生長曲線。生長曲線見圖6。
[0223] 野生型ATCC8739在不含丁二酸二鈉（Og/L，滲透壓分別為OmosM)培養(yǎng)基中，12h時 達到生長最大值，OD55tlmi約6左右；當培養(yǎng)基中含29g/L、43g/L、57g/L、71g/L、86g/L 丁二酸 二鈉時（滲透壓分別為 537mosM、796mosM、1056mosM、1314mosM、1593mosM)，12h 時，OD55tlmi 值 分別為4. 74、3. 12、2. 27、1. 64、0. 31，是不含丁二酸二鈉（Og/L，滲透壓分別為OmosM)時的 76%、50%、36%、26%、5%。
[0224] 隨著培養(yǎng)基中丁二酸二鈉濃度的增加，野生型大腸桿菌ATCC8739的生長受影響， 說明高濃度的丁二酸二鈉對野生型大腸桿菌ATCC8739菌株生長有抑制作用。
[0225] 實施例13 :高濃度丁二酸二鈉對重纟目大腸桿菌MX-202、MX-204和MX-206發(fā)酵的 影響
[0226] 使用含不同濃度丁二酸二鈉的無機鹽培養(yǎng)基對重組大腸桿菌MX-202、MX-204和 MX-206進行發(fā)酵。
[0227] 種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基組成同實施例5。發(fā)酵培養(yǎng)基含葡萄糖濃度50g/L，不添 加 KHCO3，另外還加入了 43g/L和86g/L的丁二酸二鈉。
[0228] 種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)同實施例5,中和劑為6M Κ0Η。
[0229] 每6h測定OD55tol值，繪制生長曲線。生長曲線見圖7。
[0230] 在含高濃度的丁二酸二鈉（43g/L，滲透壓為796mosM)培養(yǎng)基中生長，12h時， MX-202、MX-204 和 MX-206 的 OD55tol 值分別為：4. 42、4. 23、4. 04,相對于野生型（OD55tlmi 值為 3. 12)，OD55tlmi 值分別提高了 42%、36% 和 29%。
[0231] 在含更高濃度的丁二酸二鈉（86g/L，滲透壓為1593mosM)培養(yǎng)基中生長，36h時， MX-202、MX-204 和 MX-206 的 OD55tlnm 值分別為：2. 14、1.93、1.88,相對于野生型（OD55tlmi 值為 I. 77)，OD55cinm 值分別提高了 21%、9% 和 6%。
[0232] 在含高濃度的丁二酸鹽培養(yǎng)基中生長，隨著丁二酸鹽濃度的增加重組大腸桿菌 MX-202、MX-204和MX-206菌株生長有所減低，但在相同條件下，相對于野生型ATCC8739,突 變菌株生長能力都有顯著提高；說明rpoBbcusSbmreC*單基因突變能顯著提高野生型菌 株對高濃度丁二酸鹽的耐受性。
[0233] 參考文獻：
[0234] Datsenko KAjWanner BL (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA97 (12) :6640-6645.
[0235] Higgins CF,Cairney J，Stirling DA，Sutherland L，Booth IR(1987)Osmotic regulation of gene expression:ionic strength as an intracellular signal?Trends Biochem Sci 12:339. 344.
[0236] Weber A, Jung K(2002)Profiling early osmostress-dependent gene
[0237] expression in Escherichia coli using DNA macroarrays. J Bacterioll84:
[0238] 5502 - 5507.
[0239] Postma Pj Lengeler Jj Jacobson G (1996)Osmoregulation. In :Neidhardt FC et al.Escherichia coli and Salmonella:cellular and molecular biology,eds Neidhardt Fj Curtiss Rj 3rd, Csonka Lj Epstein W. (ASM Press, Washington, DC), 2nd Ed Volljppl210-1224.
[0240] Liu LMjXu QLjLi Y et al(2007)Enhancement of pyruvate osmotictolerant mutant production by of Torulopsis glabrata. Biotechnol
[0241] Bioeng(97) :825 - 832.
[0242] Lu J，Tang J，Liu Y，Zhu X，Zhang T，Zhang X (2012) Combinatorial modulation of galP and glk gene expression for improved alternative glucose utilization. Appl Microbiol Biotechnol93:2455-2426.
[0243] Mok YKj Clark DRj Kam KMj Shaw PC, Bsi YI (1991)A novel thermophilic restriction endonuclease that recognizes5'CCNNNNNNNGG3'and the discovery of a wrongly sequenced site in pACYC177. Nucleic Acids Resl9:2321-2323.
[0244] Tan Z，Zhu X，Chen J，Li QjZhang X. Activating phosphoenolpyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase in combination for improving succinate production. Appl Environ Microbiol. 2013, 79:4838-4844.
[0245] Zhang X，Jantama K，Shanmugam KT，Ingram LO (2009) Reengineering Escherichia coli for succinate production in mineral salts medium. Appl Environ Microbiol75:7807-7813.
【主權(quán)項】
1. 一種重組大腸桿菌，其含有選自如下的一種或多種突變的基因： (a) 突變的rpoB基因，其所編碼的多肽在對應(yīng)于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列的位置 D654的位置上含有修飾； (b) 突變的cusS基因，其所編碼的多肽在對應(yīng)于SEQ ID No. : 2所示氨基酸序列的位置 G210的位置上含有修飾；和 (c) 突變的mreC基因，其所編碼的多肽在對應(yīng)于SEQ ID No. : 3所示氨基酸序列的位置 G24的位置上含有修飾。2. 權(quán)利要求1的重組大腸桿菌，其中所述突變的rpoB基因所編碼的多肽在對應(yīng)于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列的位置D654的位置上是用Y置換D。3. 權(quán)利要求1的重組大腸桿菌，其中所述突變的cusS基因所編碼的多肽在對應(yīng)于SEQ ID No. : 2所示氨基酸序列的位置G210的位置上是用V置換G。4. 權(quán)利要求1的重組大腸桿菌，其中所述突變的mreC基因所編碼的多肽在對應(yīng)于SEQ ID No. : 3所示氨基酸序列的位置G24的位置上是用D置換G。5. 權(quán)利要求1的重組大腸桿菌，其含有如下的一種或多種突變的基因： (a) 突變的rpoB基因，其核苷酸序列在對應(yīng)于SEQ ID No. :4所示核苷酸序列的位置 G1960的位置上含有修飾； (b) 突變的cusS基因，其核苷酸序列在對應(yīng)于SEQ ID No. :5所示核苷酸序列的位置 G629的位置上含有修飾；和 (c) 突變的mreC基因，其核苷酸序列在對應(yīng)于SEQ IDNo. :6所示核苷酸序列的位置G71 的位置上含有修飾。6. 權(quán)利要求5的重組大腸桿菌，其中所述突變的rpoB基因的核苷酸序列在對應(yīng)于SEQ ID No. : 4所示核苷酸序列的位置G1960的位置上是用T置換G。7. 權(quán)利要求5的重組大腸桿菌，其中所述突變的cusS基因的核苷酸序列在對應(yīng)于SEQ ID No. : 5所示核苷酸序列的位置G629的位置上是用T置換G。8. 權(quán)利要求5的重組大腸桿菌，其中所述突變的mreC基因的核苷酸序列在對應(yīng)于SEQ ID No. : 6所示核苷酸序列的位置G71的位置上是用A置換G。9. 權(quán)利要求1-8任一項的重組大腸桿菌，其還含有如下修飾： 磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS)中所涉及的一或多個基因表達的抑制、 和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS)中所涉及的基因所編碼的蛋白質(zhì)活性 的抑制； PflB和/或adhE基因表達的抑制、和/或pfIB和/或adhE基因所編碼的蛋白質(zhì)活性 的抑制； IdhA基因表達的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制； galP基因和/或外源gif基因表達的增強、和/或galP基因和/或外源gif基因所編 碼的蛋白質(zhì)活性的增強；和 pck基因表達的增強、和/或pck基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強。10. 權(quán)利要求9的重組大腸桿菌，其中所述磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng) (PTS)中所涉及的一或多個基因是選自如下的一或多個基因：編碼PTS系統(tǒng)酶I的基因 PtsI、編碼PTS系統(tǒng)酶Hpr的基因ptsH、編碼PTS系統(tǒng)酶IIA ele的基因err和編碼PTS系統(tǒng) 酶IICBG1。的基因ptsG。11. 權(quán)利要求9的重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌還含有如下的修飾： pta基因和ackA基因表達的抑制、和/或pta基因和ackA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的 抑制；和 aceA基因、aceB基因和dcuC基因表達的增強、和/或aceA基因、aceB基因和dcuC基 因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強。12. 權(quán)利要求11的重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌中還含有如下修飾： mgsA基因表達的抑制、和/或mgsA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制。13. 生產(chǎn)丁二酸的方法，所述方法包括： (a) 發(fā)酵培養(yǎng)權(quán)利要求1-12任一項的重組大腸桿菌；和 (b) 收獲產(chǎn)生的丁二酸；任選地分離或純化所述丁二酸。14. 權(quán)利要求1-12任一項的重組大腸桿菌在生產(chǎn)丁二酸中的用途。15. 提高大腸桿菌耐滲透壓能力的方法，所述方法包括在大腸桿菌中引入選自如下的 一種或多種突變的基因： (a) 突變的rpoB基因，其所編碼的多肽在對應(yīng)于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列的位置 D654的位置上含有修飾； (b) 突變的cusS基因，其所編碼的多肽在對應(yīng)于SEQ ID No. : 2所示氨基酸序列的位置 G210的位置上含有修飾；和 (c) 突變的mreC基因，其所編碼的多肽在對應(yīng)于SEQ ID No. : 3所示氨基酸序列的位置 G24的位置上含有修飾。16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述突變的rpoB基因所編碼的多肽在對應(yīng)于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列的位置D654的位置上是用Y置換D。17. 權(quán)利要求15的方法，其中所述突變的cusS基因所編碼的多肽在對應(yīng)于SEQ ID No. : 2所示氨基酸序列的位置G210的位置上是用V置換G。18. 權(quán)利要求15的方法，其中所述突變的mreC基因所編碼的多肽在對應(yīng)于SEQ ID No. : 3所示氨基酸序列的位置G24的位置上是用D置換G。
【專利摘要】本發(fā)明涉及通過遺傳工程改造大腸桿菌的領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明提供了一種含有突變的rpoB、cusS和/或mreC基因的重組大腸桿菌。本發(fā)明還涉及使用所述大腸桿菌用于生產(chǎn)如丁二酸等化工原料的用途。本發(fā)明還提供了使用所述大腸桿菌生產(chǎn)丁二酸等化工原料的方法，以及通過引入突變的rpoB、cusS和/或mreC基因而提高大腸桿菌耐滲透壓能力的方法。CGMCC No725920130225
【IPC分類】C12R1/19, C12P7/46, C12N1/20
【公開號】CN104974946
【申請?zhí)枴緾N201410138473
【發(fā)明人】張學(xué)禮, 朱欣娜, 肖孟雍, 陳晶, 馬延和
【申請人】中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
【公開日】2015年10月14日
【申請日】2014年4月8日