專利名稱：一種腸桿菌及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水環(huán)境保護(hù)、水華控制、應(yīng)用微生物和生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體涉及一種腸桿菌，同時(shí)還涉及腸桿菌的制備方法，以及腸桿菌在治理藍(lán)藻水華中的用途。
背景技術(shù)：
在富營養(yǎng)水體中，某些藍(lán)藻能快速生長，在水體表層大量聚集，形成藍(lán)藻水華。藍(lán)藻水華引起的一系列環(huán)境和健康問題，正受到世界各國的高度重視。藻類尤其產(chǎn)毒素藍(lán)藻過度繁殖是導(dǎo)致湖泊水環(huán)境惡化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，同時(shí)對人類健康構(gòu)成了潛在的威脅。針對我國湖泊嚴(yán)重富營養(yǎng)化生態(tài)災(zāi)害問題，探索藻類的控制、“水華”發(fā)生的抑制、湖泊水質(zhì)的改善是非常必要的。藻類的控制技術(shù)可歸結(jié)為物理方法、化學(xué)方法和生物方法。物理方法主要是電磁場、機(jī)械除藻等，處理能力有限，且局限于水處理工程應(yīng)用?；瘜W(xué)除藻的方法主要包括施用除草劑、殺藻劑及金屬鹽等，雖有快速高效的優(yōu)點(diǎn)，但會(huì)帶來水體的二次污染問題。生物學(xué)控藻技術(shù)是利用生物間的各種相互作用抑制對藻類的生長、繁殖，從而達(dá)到控制水華的目的。溶藻細(xì)菌(algae-lysing bacteria)，作為水生態(tài)系統(tǒng)組成生物，在天然水體中具有重要作用。近年來，不少國內(nèi)外研究者認(rèn)為水華和赤潮的突然消亡可能與溶藻細(xì)菌的感染有關(guān)。溶藻細(xì)菌作為水華和赤潮防治的生物，已經(jīng)引起越來越多人的關(guān)注。我國已經(jīng)成為水華和赤潮的多發(fā)國家，尋求有效的水華和赤潮防治途徑勢在必行。然而由于很多溶藻細(xì)菌在自然水體中的比率較低，分離比較困難，加之環(huán)境因子的多變性、部分細(xì)菌溶藻能力的不穩(wěn)定性，國內(nèi)對溶藻細(xì)菌的研究還處于起步階段，所以分離、培養(yǎng)和應(yīng)用一種強(qiáng)烈溶解藻細(xì)胞的細(xì)菌非常重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種腸桿菌Enterobacter sp.，該菌能夠有效地抑制藻類生長。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種制備腸桿菌的方法，其培養(yǎng)易于操作，設(shè)備簡單，適宜工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供一種腸桿菌在藍(lán)藻水華控制中的應(yīng)用，相比其他方法，使用細(xì)菌控藻不會(huì)帶來二次污染，并在大水體中形成一種新的生態(tài)平衡。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)措施腸桿菌Enterobacter sp.，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2004年2月12日，保藏編號CCTCC No.M204010。
一種腸桿菌的制備方法如下A.分離腸桿菌從污染水體采水樣，用涂平板的方法挑選單菌落，挑選對藍(lán)藻細(xì)胞生長有強(qiáng)烈抑制作用的腸桿菌，進(jìn)行培養(yǎng)；B.菌種特征1)細(xì)菌的形態(tài)特征桿狀，長度約0.5-0.7μm，能運(yùn)動(dòng)。產(chǎn)生黃色菌落，圓形，略平，有特殊氣味；2)生理生化特征


C.培養(yǎng)液配制硝酸鈉 150mg磷酸氫二鉀 4mg硫酸鎂 7.5mg氯化鈣 3.6mg檸檬酸 0.6mg檸檬酸鐵銨 0.6mg乙二胺四乙酸 0.1mg碳酸鈉 2mg，A5溶液 0.1ml大豆胰蛋白 0.6g蒸餾水 99.9ml〔注〕A5溶液配方硼酸 61.0mg硫酸錳 169.0mg硫酸鋅 287.0mg硫酸銅 2.5mg鉬酸銨 12.5mgD.培養(yǎng)條件溫度25-30℃，pH為6.5-7.5，90-110rpm振蕩培養(yǎng)。
E.培養(yǎng)流程a)一級菌種培養(yǎng)將1ml原種加入100ml培養(yǎng)液中，25-30℃靜止培養(yǎng)。
b)二級菌種培養(yǎng)將100ml一級菌種培養(yǎng)液加入4L培養(yǎng)液中，25-30℃靜止培養(yǎng)。
c)三級培養(yǎng)將二級培養(yǎng)所得的菌液倒入容積為2.5×1.6×1.2m3的水泥池塘，室外培養(yǎng)5-7天。
d)腸桿菌保種0.8-1.2％瓊脂固化的細(xì)菌培養(yǎng)基，0-4℃保存。
利用該菌控制藍(lán)藻水華滇池圍隔及200畝水域，選用該菌做溶藻試驗(yàn)，將一定濃度的菌液噴灑在水體中，8-15天測水華葉綠素含量，下降60-80％。
本發(fā)明易于操作，設(shè)備簡單，安全無污染，節(jié)省人力，適宜工業(yè)化生產(chǎn)。該菌的培養(yǎng)、制備及應(yīng)用，提供了一條藍(lán)藻水華控制的有效途徑。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明步驟如下腸桿菌Enterobacter sp.，于2004年2月12日在武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No.M204010。
一種腸桿菌的制備方法如下A.分離腸桿菌從污染水體采水樣，用涂平板的方法挑選單菌落，挑選對藍(lán)藻細(xì)胞生長有強(qiáng)烈抑制作用的腸桿菌，進(jìn)行培養(yǎng)；B.菌種特征1)細(xì)菌的形態(tài)特征桿狀，長度約0.5-0.7μm，能運(yùn)動(dòng)。產(chǎn)生黃色菌落，圓形，略平，有特殊氣味；2)生理生化特征


C.培養(yǎng)液配制硝酸鈉 150mg磷酸氫二鉀 4mg硫酸鎂 7.5mg氯化鈣 3.6mg檸檬酸 0.6mg檸檬酸鐵銨 0.6mg乙二胺四乙酸 0.1mg碳酸鈉 2mg，A5溶液 0.1ml大豆胰蛋白 0.6g蒸餾水 99.9ml〔注〕A5溶液配方硼酸 61.0mg硫酸錳 169.0mg硫酸鋅 287.0mg硫酸銅 2.5mg鉬酸銨 12.5mgD.培養(yǎng)條件溫度30℃，pH為7，90-110rpm振蕩培養(yǎng)。
E.培養(yǎng)流程a)一級菌種培養(yǎng)將1ml原種加入100ml培養(yǎng)液中，30℃靜止培養(yǎng)。
b)二級菌種培養(yǎng)將100ml一級菌種培養(yǎng)液加入4L培養(yǎng)液中，30℃靜止培養(yǎng)。
c)三級培養(yǎng)將二級培養(yǎng)所得的菌液倒入容積為2.5×1.6×1.2m3的水泥池塘，室外培養(yǎng)7天。
d)腸桿菌保種1.2％瓊脂固化的細(xì)菌培養(yǎng)基，0℃保存。
利用該菌控制藍(lán)藻水華A.細(xì)菌的噴灑將獲得的腸桿菌培養(yǎng)物按照2.5-3×105cells/L噴灑在富藍(lán)藻水華發(fā)生的水體中。
B.實(shí)驗(yàn)水質(zhì)監(jiān)測定期采集實(shí)驗(yàn)區(qū)水樣，檢測結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)水體葉綠素水華葉綠素含量下降，水體透明度提高，藍(lán)藻種群優(yōu)勢度降低，同時(shí)可觀察到水體顏色變淺。
C.應(yīng)用實(shí)例不同的環(huán)境條件下復(fù)合菌凈水的測試。
1)光照培養(yǎng)250ml三角瓶中，25℃，不通氣。6天以后惠氏微囊藻的葉綠素下降率為100％，顯微鏡下幾乎看不到活的藻細(xì)胞，只見細(xì)胞碎片。
2)黑暗培養(yǎng)1L三角瓶中，25℃，不通氣。6天以后惠氏微囊藻的葉綠素下降率為87％。三天后再測，發(fā)現(xiàn)惠氏微囊藻的葉綠素下降率達(dá)到93％。
3)室溫培養(yǎng)5L玻璃瓶中，25℃，不通氣。5天后水華藍(lán)藻的葉綠素下降率為59％；10天后葉綠素下降率為96％。
4)自然水域滇池1500立方米的圍隔中，溫度12～17℃，自然狀態(tài)。加入腸桿菌各為3000毫升，數(shù)目為108個(gè)/毫升。水華葉綠素含量下降70-80％。
滇池200畝水域中，溫度12～17℃，自然狀態(tài)。加入腸桿菌各300升，數(shù)目為8×108個(gè)/毫升。水華葉綠素含量下降60-70％。
權(quán)利要求
1.一種腸桿菌，腸桿菌(Enterobacter sp.)，CCTCC No.M204010。
2.一種用于權(quán)利要求1所述的腸桿菌的制備方法，包括下列步驟A、分離腸桿菌從污染水體采水樣，用涂平板的方法挑選單菌落，挑選對藍(lán)藻細(xì)胞生長有強(qiáng)烈抑制作用的腸桿菌，進(jìn)行培養(yǎng)；B、培養(yǎng)基配制硝酸鈉150mg磷酸氫二鉀4mg硫酸鎂7.5mg氯化鈣3.6mg檸檬酸0.6mg檸檬酸鐵銨0.6mg乙二胺四乙酸 0.1mg碳酸鈉2mg，A5溶液 0.1ml大豆胰蛋白0.6g蒸餾水99.9mlC、培養(yǎng)條件溫度30-35℃，pH為6.5-7.5，90-110rpm振蕩培養(yǎng)；D、培養(yǎng)流程1)一級培養(yǎng)將1ml原種加入100ml培養(yǎng)液中，25-30℃靜止培養(yǎng)；2)二級培養(yǎng)將100ml一級培養(yǎng)物加入4L培養(yǎng)液中，25-30℃靜止培養(yǎng)；3)三級培養(yǎng)將二級培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物倒入容積為2.5×1.6×1.2m3的水泥池塘，室外培養(yǎng)5-7天。E、菌種保藏0.8-1.2％瓊脂固化的BG11培養(yǎng)基，0-4℃保存。
3.權(quán)利要求1所述的一種腸桿菌在藍(lán)藻水華控制中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腸桿菌Enterobacter sp.及其制備方法和應(yīng)用，首先是細(xì)菌的分離和純化；其次是確定最適培養(yǎng)基；第三是培養(yǎng)條件的優(yōu)化，獲得了該菌生長的最適合條件，溫度為25－30℃，pH為6.5－7.5，90－110rpm振蕩培養(yǎng)；第四是采取原種置恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，然后逐級擴(kuò)大培養(yǎng)；第五是在自然水域利用該菌控制藍(lán)藻水華。本發(fā)明易于操作，設(shè)備簡單，安全無污染，節(jié)省人力，適宜工業(yè)化生產(chǎn)。該菌的培養(yǎng)、制備及應(yīng)用，提供了一條藍(lán)藻水華控制的有效途徑。
文檔編號C02F3/34GK1563355SQ20041001293
公開日2005年1月12日 申請日期2004年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月27日
發(fā)明者劉永定, 史順玉, 沈銀武, 陳坤 申請人:中國科學(xué)院水生生物研究所