一種利用迭代同源重組體內(nèi)進化目標蛋白質(zhì)的新方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用迭代同源重組體內(nèi)進化目標蛋白質(zhì)的新方法。其特征在于：首先在體外通過兩步PCR制備得到帶突變的單鏈核苷酸并用DNase I酶切，回收80?100nt片段構(gòu)成目標蛋白質(zhì)的單鏈核苷酸突變庫；以此單鏈突變庫轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過λ?Red同源重組技術(shù)建立含有目標蛋白質(zhì)突變體的大腸桿菌菌群；再次將上述單鏈突變庫轉(zhuǎn)化含有目標蛋白質(zhì)突變體的大腸桿菌菌群，形成更大庫容量的大腸桿菌菌群；再次轉(zhuǎn)化大腸桿菌的操作循環(huán)2?6次，構(gòu)建含有目標基因突變的大腸桿菌突變庫；最后通過高效篩選或高通量篩選獲得目標蛋白質(zhì)突變體。這一技術(shù)可應用于微生物基因原位進化，提高酶催化活性，并應用于提高微生物代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率。
【專利說明】一種利用迭代同源重組體內(nèi)進化目標蛋白質(zhì)的新方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用迭代同源重組體內(nèi)進化目標蛋白質(zhì)的新方法，屬于生物技術(shù) 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 定向進化技術(shù)是一種在實驗室中模擬達爾文進化，進化出在自然界并不存在的或 是具有更優(yōu)性質(zhì)的蛋白質(zhì)，并可以通過改變酶的催化效率改變代謝流，擴展或構(gòu)建新的代 謝途徑，弱化或消除不必要或有害的代謝途徑，從而達到提高某種代謝產(chǎn)物產(chǎn)率或降解有 害物質(zhì)的目的。定向進化技術(shù)主要有兩個步驟:首先利用現(xiàn)代分子生物學方法構(gòu)建基因的 突變文庫，然后耦合篩選方法對文庫進行篩選。突變文庫的構(gòu)建可以提供足夠的多樣性以 供篩選，是定向進化的關(guān)鍵步驟。按照DNA突變發(fā)生的場所，構(gòu)建突變文庫的技術(shù)可以分為 體外突變和體內(nèi)突變。
[0003] 體外突變手段通過易錯PCR、飽和點突變或DNA重排等標準實驗技術(shù)在感興趣的基 因上引入多樣性。體外突變手段可以有效得控制突變率和突變譜，而體內(nèi)突變手段可以耦 合突變和篩選，并且可以繞開轉(zhuǎn)化效率瓶頸，避免費時費力的建庫，克隆，操作步驟。
[0004] 最常用的體內(nèi)突變手段包括化學誘變劑，堿基類似物，紫外線和超突變菌株?；瘜W 誘變劑產(chǎn)生的突變譜很窄，而且可能對人有致癌作用。紫外線輻射產(chǎn)生的突變譜很廣，而且 幾乎沒有序列偏好性。然而紫外線對細胞的殺傷作用限制了它的作用。最廣泛應用的體內(nèi) 突變方法是使用超突變菌株比如XLl-Red。此菌株通過刪除和修飾DNA復制和修復相關(guān)基因 來提高突變概率，然而其突變頻率無法控制，基因不穩(wěn)定，生長緩慢使得分離突變子較為困 難。
[0005] George Church實驗室發(fā)明了MAGE(多重自動基因組改造技術(shù)）。它同時針對基因 組的不同區(qū)域設(shè)計一系列的單鏈寡核苷酸，利用A-Red同源重組系統(tǒng)將這些寡核苷酸整合 到基因組上，實現(xiàn)單個細胞基因組多個位點的改造或細胞群體間基因組改造的多樣性。利 用該技術(shù)定向改造大腸桿菌中番茄紅素合成過程中的20個基因的RBS區(qū)域，設(shè)計不同的簡 并引物，使它們定向進化到認為可以提高表達量的經(jīng)典的SD序列(TAAGGAGGT)，最終篩選得 到高產(chǎn)菌株。MAGE技術(shù)利用體外合成的90nt單鏈寡核苷酸達到高效同源重組的目的，且針 對的改造目標都是調(diào)芐基因，并沒有實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因進行定向進化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用迭代同源重組體內(nèi)進化目標蛋白質(zhì) 的新方法。為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0007] 構(gòu)建一個80-100nt的單鏈核苷酸目標基因突變庫，通過A-Red同源重組技術(shù)，利用 所述突變庫對大腸桿菌基因組上的蛋白質(zhì)基因進行原位迭代重組，構(gòu)建較大庫容量的含有 目標基因突變的大腸桿菌突變庫，以較高的突變率達到進化酶分子結(jié)構(gòu)提高酶催化效率的 目的。
[0008] 進一步地，所述方法為在體外構(gòu)建目標蛋白質(zhì)基因的TA克隆載體，以此載體為模 板，用error-prone PCR制備得到帶堿基突變的雙鏈核苷酸；以此雙鏈為模板，單引物PCR制 備得到帶突變的單鏈核苷酸；用DNase I把以上單鏈酶切并回收80-100nt片段構(gòu)成目標蛋 白質(zhì)的單鏈核苷酸目標基因突變庫。
[0009] 進一步地，所述迭代的步驟為：
[0010]以得到的單鏈核苷酸目標基因突變庫轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過A-Red同源重組技術(shù)建 立含有目標蛋白質(zhì)突變體的大腸桿菌菌群，得到初始的含有目標基因突變的大腸桿菌突變 庫；
[0011] 將上述單鏈核苷酸目標基因突變庫轉(zhuǎn)化初始的含有目標基因突變的大腸桿菌突 變庫，得到新的含有目標基因突變的大腸桿菌突變庫，形成更大庫容量的大腸桿菌菌群，構(gòu) 建成含有目標基因突變的大腸桿菌突變庫;或者：
[0012] 再用上述單鏈核苷酸目標基因突變庫轉(zhuǎn)化新形成的含有目標基因突變的大腸桿 菌突變庫，得到更新后的含有目標基因突變的大腸桿菌突變庫，以此不斷增加含有目標基 因突變的大腸桿菌突變庫的庫容量，構(gòu)建含有目標基因突變的大腸桿菌突變庫。
[0013] 單鏈核苷酸的獲取方式包括但不限于T7逆轉(zhuǎn)錄法，核酸外切酶法，變性高效液相 色譜法，磁珠捕獲法，不對稱PCR，兩步PCR法等。
[0014] 80-100nt的單鏈核苷酸是通過降解長單鏈核苷酸的方式得到，它的獲取方式包括 但不限于DNase頂每切，超聲波破碎法等。
[0015] 單鏈核苷酸可以通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的方式進入細胞內(nèi)。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的方式包括但不 限于磷酸鈣法，氯化鈣法，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，電穿孔法，光穿孔法等。轉(zhuǎn)化介質(zhì)包括但不限于水， 氯化媽，脂質(zhì)體等。
[0016]在轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染之前，大腸桿菌細胞在30°C培養(yǎng)至一定濃度，并于42 °C進行誘導。在 細胞基因組上的A-Red同源重組系統(tǒng)在pL啟動子控制下，并受到cI857阻遏蛋白的調(diào)控。在 30°C時pL啟動子受阻遏不表達，42°C時誘導表達A-Red同源重組所需的三個蛋白。經(jīng)過 15min誘導之后的細胞放于4°C保存，防止誘導的蛋白降解。
[0017] 培養(yǎng)基需要置換成轉(zhuǎn)化介質(zhì)，去除其中的離子。此過程可以采用的方式包括但不 限于離心法，膜過濾法等。
[0018] 本發(fā)明為了在大腸桿菌基因組上實現(xiàn)較高的突變率并對一個或多個蛋白質(zhì)基因 進行突變，通過迭代A-Red同源重組的策略，達到對蛋白質(zhì)進化的目的。此方法可以對基因 組上單一基因進行進化，也可以同時對多個基因進行修飾，并耦合篩選，尋找出多個突變蛋 白協(xié)同作用所達到的最佳效果。
[0019] 本發(fā)明所提供的利用迭代同源重組進化目標蛋白質(zhì)的新方法是有效獲得所需蛋 白質(zhì)突變的方法，比以往的方法更加簡便、高效。
[0020] 本發(fā)明所提供的一種利用迭代同源重組體內(nèi)進化目標蛋白質(zhì)的新方法，通過突變 大腸桿菌基因組上1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因，提高大腸桿菌產(chǎn)番茄紅素 的水平。通過篩選得到5個1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶的突變體，其基因序列選自序列 表第SEQ ID勵.5、^).7、勵.9、^).11、^).13序列中的一種，分別提高了相應大腸桿菌合成 番茄紅素水平50 % -300 %。
[0021] 本發(fā)明所提供的一種利用迭代同源重組體內(nèi)進化目標蛋白質(zhì)的新方法，通過突變 大腸桿菌基因組上0s因子(Rpos)基因，提高大腸桿菌產(chǎn)番茄紅素的水平。通過篩選得到2個 0s因子突變體，其序列選自序列表第SEQ ID NO. 19、N0.21序列中的一種，分別提高了相應 大腸桿菌合成番茄紅素水平80 %和205 %。
【附圖說明】
[0022] 圖1:本發(fā)明流程示意圖。其中，Gene:基因；Error-Prone PCR:易錯PCR;Single Primer PCR:單鏈PCR;DNase I Digestion:DNase I酶切；cycles of Recombination:多次 重組;Genome:基因組;E ? co 1 i :大腸桿菌。
[0023]圖2:野生型及含DXS突變體的大腸桿菌菌株產(chǎn)番茄紅素能力對比圖；其中， Lycopene Production:番前紅素產(chǎn)量。
[0024]圖3:野生型及含Rpos突變體的大腸桿菌菌株產(chǎn)番茄紅素能力對比圖；其中， Lycopene Production:番前紅素產(chǎn)量。
【具體實施方式】
[0025] 本發(fā)明通過迭代同源重組的策略對大腸桿菌基因組上的結(jié)構(gòu)基因進行突變，達到 對功能蛋白原位進化的目的，以下把這種策略應用到兩個直接在大腸桿菌基因組上進化蛋 白質(zhì)的例子中，證實了本發(fā)明為有效地獲得所需蛋白質(zhì)突變體的方法。本發(fā)明的操作流程 如圖1所示，兩個例子分別為突變大腸桿菌基因組上1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS) 基因和突變大腸桿菌基因組上^因子(Rpos)基因提高大腸桿菌中產(chǎn)番茄紅素的水平。
[0026] 實施例1，大腸桿菌基因組上突變1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因
[0027] 1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)是大腸桿菌異戊二烯合成途徑中一個關(guān)鍵 酶，以3-磷酸-甘油醛和丙酮酸為底物合成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸，提高其催化效率可以 增強異戊二烯代謝流，并最終提高番茄紅素的產(chǎn)量。
[0028] 在大腸桿菌EcNR2(Harris H.Wang等?（2009)Nature.460:894_890)中引入外源基 因(3^￡，(：竹8，(^?，使得該大腸桿菌可以產(chǎn)番茄紅素。由于番茄紅素具有可見的紅色，可以 根據(jù)菌落紅色的深淺，高通量的篩選番茄紅素產(chǎn)量提高的菌株。
[0029] 體外制備80-100nt dxs基因單鏈突變庫：
[0030] 1、從大腸桿菌基因組上PCR得到dxs基因并與T載體連接，構(gòu)建dxs基因的TA克隆載 體。
[0031] 2、用上引物dxs-for(SEQ ID NO. 1)和5'端磷酸化的下引物dxs_rev(SEQ ID 勵.2)兩個引物以〇^8基因的了六克隆載體為模板，在添加此2+的條件下，941€458,54 1€5〇8,72 °C 2min循環(huán)30次做易錯PCR，割膠純化回收得到的雙鏈核苷酸；
[0032] 3、以上述含有突變的雙鏈核苷酸為模板，在PCR體系中只添加上引物dxs-for(SEQ ID NO? 1)，94°C30s，53°C30s，72°C4min循環(huán) 15次，制備得到dxs單鏈核苷酸；
[0033] 4、用Lambda EX0外切酶處理上述得到的PCR產(chǎn)物，把其中的dxs雙鏈酶切成單鏈核 苷酸；
[0034] 5、乙醇沉淀上述得到的酶切產(chǎn)物，得到dxs單鏈核苷酸；
[0035] 6、用DNase頂每切上述得到的單鏈核苷酸，并切膠回收80-100nt的單鏈核苷酸片 段，構(gòu)成單鏈突變庫。
[0036]迭代同源重組進化目標蛋白質(zhì)：
[0037] 1、在50mL LB培養(yǎng)基的搖瓶中接入從平板上挑取的大腸桿菌單菌落，并加入25yL 卡那霉素，30 °C下?lián)u床過夜培養(yǎng)；
[0038] 2、轉(zhuǎn)接1%的菌液至2mL LB培養(yǎng)基的試管中，置于30°C下?lián)u床培養(yǎng)2.5-3h至0D達 到0.7左右；
[0039] 3、將試管置于42°C水浴中振蕩培養(yǎng)15min，誘導A-Red重組蛋白充分表達；
[0040] 將試管置于冰上5min;
[0041 ] 4、取lmL菌液移入1.5mL預冷離心管中，4°C下以13000r/min離心30s，棄去上清液， 加入預冷的無菌水lml重懸洗滌，棄去上清液，并用預冷的無菌水lml重懸洗滌2次；
[0042] 5、去除上清液，并用100此預冷無菌水重懸菌體，加入80-100nt dxs單鏈突變庫；
[0043] 6、將上述混合物轉(zhuǎn)移到2mm電轉(zhuǎn)杯中，在電容25yF，電壓2.5kV，電阻200 Q條件下 進行電擊；
[0044] 7、迅速將準備好的lml S0C培養(yǎng)基加入到電擊杯中，輕輕吹打使細胞懸浮。將電擊 杯中的混合液轉(zhuǎn)移到裝有l(wèi)ml培養(yǎng)基的試管中，放入30°C搖床培養(yǎng)，使細胞復蘇；
[0045] 8、當細胞復蘇到0D達到0.7左右時，重復上述步驟，進行第二輪轉(zhuǎn)化。該轉(zhuǎn)化過程 一共進行4輪；
[0046] 9、最后一輪電轉(zhuǎn)后，復蘇12h并涂板。在平板上篩選出紅色較深的菌落。野生大腸 桿菌菌株(野生型〇乂5基因序列56〇10勵.3;氨基酸序列5￡〇10勵.4)及含0乂5突變體的大 腸桿菌菌株(DXS-M1，DXS-M2，DXS-M3，DXS-M4，DXS-M5，DXS突變位點總結(jié)如表1所示)產(chǎn)番茄 紅素能力對比如圖2所示。
[0047] 表1 DXS突變位點總結(jié)
[0049] 從圖中可以看出，各株含有DXS突變體的大腸桿菌菌株的番茄紅素積累量相對于 野生型菌株都得到了提高，幅度在50 % -300 %。
[0050] 實施例2,大腸桿菌基因組上突變〇3因子(Rpos)基因
[0051] 〇s因子(Rpos)在大腸桿菌細胞中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，可以應答不同環(huán)境壓 力。因為番茄紅素的大量積累對大腸桿菌有毒性，突變〇 s因子可以使大腸桿菌更好地適應 壓力。
[0052] 體外制備80-100nt rpos基因單鏈突變庫：
[0053] 1、從大腸桿菌基因組上PCR得到Rpos基因并與T載體連接，構(gòu)建Rpos基因的TA克隆 載體。
[0054] 2、用上引物rpos-for(SEQ ID NO. 15)和5'端磷酸化的下引物rpos_rev(SEQ ID 如.16)兩個引物以印〇8基因的了六克隆載體為模板，在添加血2+的條件下，941€458,54 1€ 50s，72°C 2min循環(huán)30次做易錯PCR，割膠純化回收得到的雙鏈核苷酸；
[0055] 3、以上述含有突變的雙鏈核苷酸為模板，在PCR體系中只添加上引物rpos-for (SEQ ID 從).15)，941€3〇8,531€3〇8,721€4111111循環(huán)15次，制備得到鄺〇8單鏈核苷酸 ；
[0056] 4、用Lambda EX0外切酶處理上述得到的PCR產(chǎn)物，把其中的rpos雙鏈酶切成單鏈 核苷酸；
[0057] 5、乙醇沉淀上述得到的酶切產(chǎn)物，得到rpos單鏈核苷酸；
[0058] 6、用DNase頂每切上述得到的單鏈核苷酸，并切膠回收80-100nt的單鏈核苷酸片 段，構(gòu)成單鏈突變庫。
[0059] 迭代同源重組進化目標蛋白質(zhì)：
[0060] 1、在50mL LB培養(yǎng)基的搖瓶中接入從平板上挑取的大腸桿菌單菌落，并加入25yL 卡那霉素，30 °C下?lián)u床過夜培養(yǎng)；
[0061 ] 2、轉(zhuǎn)接1%的菌液至2mL LB培養(yǎng)基的試管中，置于30°C下?lián)u床培養(yǎng)2.5-3h至0D達 到0.7左右；
[0062] 3、將試管置于42°C水浴中振蕩培養(yǎng)15min，誘導A-Red重組蛋白充分表達;將試管 置于冰上5min;
[0063] 4、取lmL菌液移入1.5mL預冷離心管中，4°C下以13000r/min離心30s，棄去上清液， 加入預冷的無菌水lml重懸洗滌，棄去上清液，并用預冷的無菌水lml重懸洗滌2次；
[0064] 5、去除上清液，并用100此預冷無菌水重懸菌體，加入80-100nt dxs單鏈突變庫；
[0065] 6、將上述混合物轉(zhuǎn)移到2mm電轉(zhuǎn)杯中，在電容25yF，電壓2.5kV，電阻200 Q條件下 進行電擊；
[0066] 7、迅速將準備好的lml S0C培養(yǎng)基加入到電擊杯中，輕輕吹打使細胞懸浮。將電擊 杯中的混合液轉(zhuǎn)移到裝有l(wèi)ml培養(yǎng)基的試管中，放入30°C搖床培養(yǎng)，使細胞復蘇；
[0067] 8、當細胞復蘇到0D達到0.7左右時，重復上述步驟，進行第二輪轉(zhuǎn)化。該轉(zhuǎn)化過程 一共進行6輪；
[0068] 9、最后一輪電轉(zhuǎn)后，復蘇12h并涂板。在平板上篩選出紅色較深的菌落。野生大腸 桿菌菌株(野生型Rpos的基因序列SEQ ID N0.17;氨基酸序列SEQ ID N0.18)及含Rpos突變 體的大腸桿菌菌株(Rp〇s-Ml，Rpos-M2，Rpos突變位點總結(jié)如表2所示)產(chǎn)番前紅素能力對比 如圖2所示。
[0069] 表2 Rpos突變位點總結(jié)

[0072] 從圖中可以看出，各株含有Rpos突變體的大腸桿菌菌株的番茄紅素積累量相對于 野生型菌株都得到了提高，幅度分別為80 % -205 %。
[0073] 序列：
[0074] SEQ ID N0.1 上引物dxs-for
[0075] 5 '-GAGTTTTGATATTGCCAAATACCCGACCCTGGC-3 '
[0076] SEQ ID N0.2 5'端磷酸化的下引物dxs-rev
[0077] 5 ' -TTATGCCAGCCAGGCCTTGATITTG-3 '（5 ' 端磷酸化）
[0078] SEQ ID N0.3 DXS基因序列
[0080] SEQ ID N0.4 DXS氨基酸序列







【主權(quán)項】
1. 一種利用迭代同源重組體內(nèi)進化目標蛋白質(zhì)的新方法，其特征在于它包括以下步 驟： 構(gòu)建一個80-100nt的單鏈核苷酸目標基因突變庫，通過λ-Red同源重組技術(shù)，利用所述 突變庫對大腸桿菌基因組上的蛋白質(zhì)基因進行原位迭代重組，構(gòu)建含有目標基因突變的大 腸桿菌突變庫，達到進化酶分子結(jié)構(gòu)提高酶催化效率的目的。2. 如權(quán)利要求1所述的一種利用迭代同源重組體內(nèi)進化目標蛋白質(zhì)的新方法，其特征 在于所述方法為在體外構(gòu)建目標蛋白質(zhì)基因的TA克隆載體，以此載體為模板，用error-prone PCR 制備得到帶堿基突變的雙鏈核苷酸； 以此雙鏈為模板，單引物 PCR 制備得到帶突 變的單鏈核苷酸；用DNase I把以上單鏈酶切并回收80-100nt片段構(gòu)成單鏈核苷酸目標基 因突變庫。3. 如權(quán)利要求1所述的一種利用迭代同源重組體內(nèi)進化目標蛋白質(zhì)的新方法，其特征 在于所述迭代的步驟為： 以得到的單鏈核苷酸目標基因突變庫轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過λ-Red同源重組技術(shù)建立含 有目標蛋白質(zhì)突變體的大腸桿菌菌群，得到初始的含有目標基因突變的大腸桿菌突變庫； 將上述單鏈核苷酸目標基因突變庫轉(zhuǎn)化初始的含有目標基因突變的大腸桿菌突變庫， 得到新的含有目標基因突變的大腸桿菌突變庫，形成更大庫容量的大腸桿菌菌群，構(gòu)建成 含有目標基因突變的大腸桿菌突變庫;或者： 再用上述單鏈核苷酸目標基因突變庫轉(zhuǎn)化新形成的含有目標基因突變的大腸桿菌突 變庫，得到更新后的含有目標基因突變的大腸桿菌突變庫，以此不斷增加含有目標基因突 變的大腸桿菌突變庫的庫容量，構(gòu)建含有目標基因突變的大腸桿菌突變庫。4. 如權(quán)利要求1所述的一種利用迭代同源重組體內(nèi)進化目標蛋白質(zhì)的新方法，其特征 在于所述方法通過突變大腸桿菌基因組上1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因，提 高大腸桿菌產(chǎn)番茄紅素的水平。5. 如權(quán)利要求1所述的一種利用迭代同源重組體內(nèi)進化目標蛋白質(zhì)的新方法，其特征 在于所述方法通過突變大腸桿菌基因組上〇s因子(Rpos)基因，提高大腸桿菌產(chǎn)番茄紅素的 水平。6. -種DXS基因，其序列選自序列表第SEQ ID N0.5、N0.7、N0.9、N0.11、N0.13序列中的 一種。7. -種Rpos基因，其序列選自序列表第SEQ ID N0.19、N0.21序列中的一種。
【文檔編號】C12N15/31GK105820990SQ201610079480
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年2月4日
【發(fā)明人】徐志南, 濮悅, 黃磊, 杭寶建, 董昌, 蔡瑾
【申請人】浙江大學