一種雙誘導(dǎo)同源重組無標(biāo)記載體質(zhì)粒及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，提供一種雙誘導(dǎo)同源重組無標(biāo)記載體質(zhì)粒及其應(yīng)用，所述的質(zhì)粒序列如SEQ ID NO.1所示。應(yīng)用點特異重組的逆反應(yīng)系統(tǒng)，可將質(zhì)粒定位地插入目標(biāo)基因組，并通過溫度誘導(dǎo)同源重組酶的表達(dá)，使得原有質(zhì)粒載體中用于轉(zhuǎn)化子篩選的抗生素基因切除，由此構(gòu)建植物特異性狀基因的表達(dá)載體和一類小amiRNA的載體，避免轉(zhuǎn)基因植物攜帶對人類不利的抗生素基因?qū)ι鷳B(tài)環(huán)境的可能污染。
【專利說明】
一種雙誘導(dǎo)同源重組無標(biāo)記載體質(zhì)粒及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種雙誘導(dǎo)同源重組無標(biāo)記載體質(zhì)粒及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]生物技術(shù)等高新科技在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用，將使整個農(nóng)業(yè)發(fā)生革命性的變化.在作物育種中，用重組基因技術(shù)將外源有益基因?qū)胱魑镏?，和通過反義RNA技術(shù)或amiRNA技術(shù)，定向修飾植物某個(些)目標(biāo)性狀并保留其它原有性狀，這是常規(guī)雜交育種所無法實現(xiàn)的理想.國內(nèi)外用原生質(zhì)體融合、微注射、電穿孔法、激光和基因槍等手段將抗病、抗蟲或高蛋白質(zhì)基因、花色基因?qū)胫参镏胁⒌玫奖磉_(dá)，如成熟時不軟化的番茄、高蛋白低淀粉含量的馬鈴薯、藍(lán)色玫瑰、抗花葉病毒病的番茄或煙草等等，現(xiàn)在已有一百多種轉(zhuǎn)基因作物處于中小規(guī)模，甚至大規(guī)模的田間實驗。美國國會也正式批準(zhǔn)在農(nóng)業(yè)上使用轉(zhuǎn)基因作物。我國中國科學(xué)院和北京大學(xué)等單位都有轉(zhuǎn)基因的抗病煙草在生產(chǎn)上應(yīng)用，并已推廣，在國際上處于領(lǐng)先地位。同時隨著別的作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成熟，轉(zhuǎn)基因植物的風(fēng)險性成為公眾的焦點話題，其中風(fēng)險之一就是外源基因的污染，為避免對外源基因的污染，降低基因遺傳轉(zhuǎn)化的風(fēng)險性。其中一種外源基因的污染是來自遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的標(biāo)記基因。多年來科學(xué)家正在尋求各種能將這種由于標(biāo)記基因造成的污染減少到最低的技術(shù)方法。上個世紀(jì)90年代國際上就有實驗室開始這項工作，已有他人文獻(xiàn)報道了一些采用位點特異性重組系統(tǒng)和熱激啟動子的可刪除標(biāo)記基因的質(zhì)粒載體，主要是使用Cre/loxP介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因安全性植物表達(dá)載體，現(xiàn)有的Cre/loxP位點特異性重組系統(tǒng)去除轉(zhuǎn)基因植物中標(biāo)記基因的方法中因Cre/1xP位點特異性重組系統(tǒng)具有可逆性，導(dǎo)致其刪除效率降低的問題，和FLP/frt位點特異性重組系統(tǒng)，利用重組酶FLP植物表達(dá)載體二次轉(zhuǎn)化含有frt位點的抗選擇標(biāo)記煙草植株時，17%的共轉(zhuǎn)化植株發(fā)生了選擇標(biāo)記基因切除事件;利用含有frt位點的植物表達(dá)載體與重組酶FLP植物表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化煙草時，二者感染煙草葉盤濃度比為3:1時共轉(zhuǎn)化效率最高，為21%，共轉(zhuǎn)化植株選擇標(biāo)記基因的切除效率為5% ;而利用含有frt位點的植物表達(dá)載體二次轉(zhuǎn)化含有重組酶FLP基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株時，轉(zhuǎn)化效率只有1.6%，且未見到選擇標(biāo)記基因被切除。它們均未采用雙誘導(dǎo)啟動子來控制重組酶的表達(dá)效率，并且未對該載體轉(zhuǎn)化的植株在不同植物(擬南芥、水稻、白菜)、不同發(fā)育時期、不同誘導(dǎo)溫度下的標(biāo)記基因切除效率進(jìn)行系統(tǒng)性研究；另有他人文獻(xiàn)報道了一些采用位點特異性重組系統(tǒng)、低溫誘導(dǎo)啟動子、P i ggyBac轉(zhuǎn)座酶、Gateway克隆系統(tǒng)構(gòu)建的可刪除標(biāo)記基因的質(zhì)粒載體，但是它們并未同時采用位點特異性雙誘導(dǎo)重組系統(tǒng)和熱激啟動子構(gòu)建載體。我們質(zhì)粒系統(tǒng)利用雙誘導(dǎo)型啟動子誘導(dǎo)Cre重組酶基因在植物發(fā)育的特定時期高效表達(dá)可防止Cre重組酶基因在轉(zhuǎn)基因植物中組成型表達(dá)帶來的基因組不穩(wěn)定等問題。相對于其它誘導(dǎo)型啟動子，熱誘導(dǎo)啟動子具有誘導(dǎo)簡便、反應(yīng)靈敏、作用高效、對植物生長發(fā)育危害小等優(yōu)點。目標(biāo)基因是采用了 es trad i ο I誘導(dǎo)型啟動子，可以完全控制表達(dá)時期和表達(dá)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于雙誘導(dǎo)同源重組無標(biāo)記載體質(zhì)粒及其應(yīng)用，應(yīng)用點特異重組的逆反應(yīng)系統(tǒng)，可將質(zhì)粒定位地插入目標(biāo)基因組，并通過溫度誘導(dǎo)同源重組酶的表達(dá)，使得原有質(zhì)粒載體中用于轉(zhuǎn)化子篩選的抗生素基因切除，由此構(gòu)建植物特異性狀基因的RNAi的載體，避免轉(zhuǎn)基因植物攜帶對人類不利的抗生素基因?qū)ι鷳B(tài)環(huán)境的可能污染。因此，本項目通過構(gòu)建RNAi生態(tài)環(huán)保型質(zhì)粒，并將探索性地應(yīng)用于作物生態(tài)環(huán)保型分子育種。開辟國內(nèi)生態(tài)環(huán)保型分子育種的新理念，具有很大的社會和生態(tài)效益。
[0004]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
雙誘導(dǎo)同源重組無標(biāo)記載體質(zhì)粒，所述的質(zhì)粒序列如SEQ ID N0.1所示。
[0005]本項目的具體技術(shù)要點及其解決的問題:
(1)利用酵母基因組的部分同源重組序列Cre基因構(gòu)建表達(dá)抗除草劑標(biāo)記基因的元件；
(2)以熱激蛋白基因的啟動子為酵母Cre重組酶基因的啟動子，在38-45度溫度下誘導(dǎo)表達(dá)重組酶；
(3)將以上(I)和(2)元件與RNAi載體組裝在一起構(gòu)建生態(tài)環(huán)保型質(zhì)粒； ID-Hsp-Cre-RNA1-NptLox 質(zhì)粒:
LB P35S-bar-T35S-Tocs-cre-HSP-P35S-NptI1-T35S-T35S-amiRNA-T35S-1Dpromoter
RB
所述質(zhì)粒已經(jīng)在水稻、擬南芥和白菜中應(yīng)用。熱激蛋白啟動子的誘導(dǎo)的最適溫度在水稻中為45度，標(biāo)記基因的切除率80%;擬南芥中為42度，標(biāo)記基因切除率90%;白菜中為38度。標(biāo)記基因切除率70%。
[0006]具體步驟為:
(I)克隆了2kb的番前、水稻、白菜和擬南芥熱激蛋白hsp70 (heat shock protein70)5’端上游調(diào)控序列，通過對啟動子元件分析，設(shè)計了四種植物不同長度含不同元件的調(diào)控序列片段，分別將其與⑶S (β-glucuronidase)報告基因連接，并與CaMV35啟動子驅(qū)動的草丁膦抗性基因bar的選擇標(biāo)記基因模塊一同構(gòu)建成hsp70啟動子功能探測載體。四個載體將用于番茄、水稻、白菜和擬南芥熱激蛋白hsp70啟動子熱激誘導(dǎo)活性的功能驗證。
[0007](2)將四個hsp70 5’端上游調(diào)控序列片段分別與重組酶基因Cre基因相連，并與SV40啟動子-bar基因模塊串聯(lián)，分別插入到兩個反向的1xP位點和兩個反向的1xp-FRT融合識別位點之間，構(gòu)建了八個基于Cre/loxP系統(tǒng)的可誘導(dǎo)刪除選擇標(biāo)記基因的表達(dá)載體。八個載體將用于對番茄、水稻、白菜和擬南芥熱激蛋白熱激誘導(dǎo)刪除bar基因的功能驗證，并比較單一使用1xP位點與聯(lián)合使用loxp-FRT融合識別位點的刪除效率的差別。建立番茄、水稻、白菜和擬南芥選擇標(biāo)記剔除表達(dá)載體是實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因安全應(yīng)用的重要突破，上述工作可提供基本元件和多樣化的載體，為相關(guān)研究工作奠定了一定基礎(chǔ)。
[0008](3)根據(jù)已經(jīng)測序的基因組序列設(shè)計特異基因引物，利用常規(guī)PCR的方法從擬南芥(Arabidopsis thaliana)和白菜中克隆出一類對激酶活性調(diào)控的目標(biāo)基因的RNAi片段，克隆測序后組裝在Estrad1l誘導(dǎo)的啟動子下，并在目標(biāo)基因的3末端增加一個標(biāo)簽(HA)，構(gòu)建表達(dá)元件中間載體。在植物雙價表達(dá)載體T一DNA區(qū)段，35s:Npt Π:nos表達(dá)元件位于同向排列的Lox位點之間，然后通過構(gòu)建一系列中間載體，再將HSP70: Cre: nos這一表達(dá)元件插入到Lox位點之間，目的基因?qū)砜梢圆迦氲絋一DNA區(qū)域兩個同向排列的Lox位點之外，從而實現(xiàn)在植物遺傳轉(zhuǎn)化初期利用抗性篩選標(biāo)記獲得轉(zhuǎn)基因植株，在得到轉(zhuǎn)基因植株的基礎(chǔ)上，通過溫度誘導(dǎo)調(diào)控Cre基因的表達(dá)從而刪除選擇標(biāo)記，獲得含有目的基因而無選擇標(biāo)記的嵌合體。這將是一種對當(dāng)前植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)更為安全有效的無標(biāo)記系統(tǒng)。
[0009](4)載體構(gòu)建成功后，使用一系列載體進(jìn)行了擬南芥和白菜的轉(zhuǎn)基因，對其轉(zhuǎn)化條件和溫度誘導(dǎo)條件一一植株預(yù)處理的時間、菌液侵染時間、溫度誘導(dǎo)的時間，兩種誘導(dǎo)型啟動子及不同溫度條件和不同Estrad1l濃度和時間處理下外植體的表現(xiàn)進(jìn)行了實驗，PCR檢測表明，我們得到了高效率轉(zhuǎn)化，高切除率的陽性轉(zhuǎn)基因苗。不同植物不同溫度誘導(dǎo)，熱激蛋白啟動子的誘導(dǎo)的最適溫度在水稻中為45度，標(biāo)記基因的切除率80%;擬南芥中為42度，標(biāo)記基因切除率90%;白菜中為38度。標(biāo)記基因切除率70%。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
1、載體具有20%高轉(zhuǎn)化效率，標(biāo)記基因70%_90%高切除率。
[0011]2、HSP啟動子溫度誘導(dǎo)重組酶的表達(dá)，和Estrad1l誘導(dǎo)目標(biāo)基因表達(dá)。
[0012]3、不同植物不同溫度誘導(dǎo)，熱激蛋白啟動子的誘導(dǎo)的最適溫度在水稻中為45度，標(biāo)記基因的切除率80%;擬南芥中為42度，標(biāo)記基因切除率90%;白菜中為38度。標(biāo)記基因切除率70%。
【附圖說明】
[0013]圖1成功應(yīng)用生態(tài)環(huán)保質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)化激酶SRlRNAi片段獲得的突變體表型。生態(tài)環(huán)保型質(zhì)粒構(gòu)建的SRl RNAi載體，應(yīng)用農(nóng)桿菌真空浸染法侵染擬南芥未開放的花，TO代播種后10天幼苗經(jīng)0.1%除草劑篩選，獲得的陽性植株，長至兩片真葉時，42度溫度處理4小時，恢復(fù)正常生長條件，繼續(xù)培養(yǎng)到4周，提取植株基因組DNA進(jìn)行PCR篩選，統(tǒng)計切除除草劑基因的植株，即為無標(biāo)記的陽性轉(zhuǎn)基因植株，收取種子。這些植株Tl播種，幼苗生長到特定時間(圖中呈現(xiàn)是生長到3周齡)進(jìn)行20mM的Estrad1l誘導(dǎo)處理2小時后，繼續(xù)培養(yǎng)再進(jìn)行表型觀察，并同時設(shè)野生型對照組，如圖。
[0014]圖2成功應(yīng)用生態(tài)環(huán)保質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)化份RNAi片段的白菜植株。其中A為萌發(fā)10天的“油青九號”白菜幼苗，下胚軸長5厘米;B為切下Icm的下胚軸經(jīng)帶有構(gòu)建好表達(dá)載體的農(nóng)桿菌侵染;C篩選、誘導(dǎo)愈傷組織分化;D 0.1%除草劑加入培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，獲得陽性轉(zhuǎn)化子，不同配比的激素濃度誘導(dǎo)根和芽組織分化;E 38度溫度處理4小時后繼續(xù)培養(yǎng)；F提取組織基因組DNA進(jìn)行PCR驗證是否已經(jīng)切除除草劑基因；G擴(kuò)增無標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因陽性植株;H無標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因陽性植株。
[0015]圖3雙誘導(dǎo)同源重組無標(biāo)記載體RNAi質(zhì)粒圖譜。
[0016]【具體實施方式】實施例1
(I)克隆了2kb的番前、水稻、白菜和擬南芥熱激蛋白hsp70 (heat shock protein70)5’端上游調(diào)控序列，通過對啟動子元件分析，設(shè)計了四種植物不同長度含不同元件的調(diào)控序列片段，分別將其與⑶S (β-glucuronidase)報告基因連接，并與CaMV35啟動子驅(qū)動的草丁膦抗性基因bar的選擇標(biāo)記基因模塊一同構(gòu)建成hsp70啟動子功能探測載體。四個載體將用于番茄、水稻、白菜和擬南芥熱激蛋白hsp70啟動子熱激誘導(dǎo)活性的功能驗證。
[0017](2)將四個hsp705’端上游調(diào)控序列片段分別與重組酶基因Cre基因相連，并與SV40啟動子-bar基因模塊串聯(lián)，分別插入到兩個反向的1xP位點和兩個反向的1xp-FRT融合識別位點之間，構(gòu)建了八個基于Cre/loxP系統(tǒng)的可誘導(dǎo)刪除選擇標(biāo)記基因的表達(dá)載體。八個載體將用于對番茄、水稻、白菜和擬南芥熱激蛋白熱激誘導(dǎo)刪除bar基因的功能驗證，并比較單一使用1xP位點與聯(lián)合使用loxp-FRT融合識別位點的刪除效率的差別。建立番茄、水稻、白菜和擬南芥選擇標(biāo)記剔除表達(dá)載體是實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因安全應(yīng)用的重要突破，上述工作可提供基本元件和多樣化的載體，為相關(guān)研究工作奠定了一定基礎(chǔ)。
[0018](3)設(shè)計特異基因引物，利用PCR的方法從擬南芥(Arabidopsis thaliana)和白菜中克隆出一類對激酶活性調(diào)控的目標(biāo)基因的RNAi片段，克隆測序后組裝在Estrad1l誘導(dǎo)的啟動子下，并在目標(biāo)基因的3末端增加一個標(biāo)簽(HA)，構(gòu)建表達(dá)元件中間載體。在植物雙價表達(dá)載體T一DNA區(qū)段，35s:Npt Π:nos表達(dá)元件位于同向排列的Lox位點之間，然后通過構(gòu)建一系列中間載體，再將HSP70: Cre:nos這一表達(dá)元件插入到Lox位點之間，目的基因?qū)砜梢圆迦氲絋一DNA區(qū)域兩個同向排列的Lox位點之外，從而實現(xiàn)在植物遺傳轉(zhuǎn)化初期利用抗性篩選標(biāo)記獲得轉(zhuǎn)基因植株，在得到轉(zhuǎn)基因植株的基礎(chǔ)上，通過溫度誘導(dǎo)調(diào)控Cre基因的表達(dá)從而刪除選擇標(biāo)記，獲得含有目的基因而無選擇標(biāo)記的嵌合體。這將是一種對當(dāng)前植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)更為安全有效的無標(biāo)記系統(tǒng)。
[0019](4)載體構(gòu)建成功后，使用一系列載體進(jìn)行了擬南芥和白菜的轉(zhuǎn)基因，對其轉(zhuǎn)化條件和溫度誘導(dǎo)條件一一植株預(yù)處理的時間、菌液侵染時間、溫度誘導(dǎo)的時間，兩種誘導(dǎo)型啟動子及不同溫度條件和不同Estrad1l濃度和時間處理下外植體的表現(xiàn)進(jìn)行了實驗，PCR檢測表明，我們得到了高效率轉(zhuǎn)化，高切除率的陽性轉(zhuǎn)基因苗。
[0020]實施例2應(yīng)用點特異重組的逆反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行擬南芥SRl基因的敲除。
[0021]SRl為一個致死性蛋白，過表達(dá)和敲除都導(dǎo)致植株致死，這個質(zhì)粒系統(tǒng)應(yīng)用誘導(dǎo)型啟動子誘導(dǎo)目標(biāo)基因的表達(dá)，根據(jù)誘導(dǎo)表達(dá)的時間和表達(dá)豐度能夠控制致死型蛋白的表達(dá)量。利用PCR的方法從擬南芥(Arabidopsis thaliana)中克隆出一類對SRl激酶活性調(diào)控的SRl基因RNAi小片段，克隆測序后以small酶切位點組裝在Estrad1l誘導(dǎo)的啟動子下，并在目標(biāo)基因的3末端增加一個標(biāo)簽(HA)，構(gòu)建表達(dá)元件中間載體。在植物雙價表達(dá)載體T一DNA區(qū)段，35s:Npt Π: nos表達(dá)元件位于同向排列的Lox位點之間，然后通過構(gòu)建一系列中間載體，再將HSP70:Cre:nos這一表達(dá)元件插入到Lox位點之間，目的基因?qū)砜梢圆迦氲絋一DNA區(qū)域兩個同向排列的Lox位點之外，從而實現(xiàn)在植物遺傳轉(zhuǎn)化初期利用除草劑Basta篩選標(biāo)記獲得轉(zhuǎn)基因植株，在得到轉(zhuǎn)基因植株的基礎(chǔ)上，通過42度溫度誘導(dǎo)調(diào)控Cre基因的表達(dá)從而刪除選擇標(biāo)記，刪除率90%，獲得含有目的基因而無選擇標(biāo)記的嵌合體。獲得的植株結(jié)果如圖1。
[0022]實施例3應(yīng)用點特異重組的逆反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行白菜型油菜腸Xrw基因的敲除。
[0023]WRKY31為一個轉(zhuǎn)錄因子，過表達(dá)和敲除都導(dǎo)致植株角果發(fā)育異常，無法收獲種子。這個質(zhì)粒系統(tǒng)應(yīng)用誘導(dǎo)型啟動子誘導(dǎo)目標(biāo)基因的表達(dá)，根據(jù)是否需要收獲種子而誘導(dǎo)WRKY31的表達(dá)。利用PCR的方法從白菜(Brass i ca rapa)中克隆出；^1^的RNAi基因片段，克隆測序后以small酶切位點組裝在Estrad1l誘導(dǎo)的啟動子下，并在目標(biāo)基因的3末端增加一個標(biāo)簽(HA)，構(gòu)建表達(dá)元件中間載體。在植物雙價表達(dá)載體T一DNA區(qū)段，35s:Nptn:nos表達(dá)元件位于同向排列的Lox位點之間，然后通過構(gòu)建一系列中間載體，再將HSP70:Cre:nos這一表達(dá)元件插入到Lox位點之間，目的基因?qū)砜梢圆迦氲絋一DNA區(qū)域兩個同向排列的Lox位點之外，從而實現(xiàn)在植物遺傳轉(zhuǎn)化初期利用除草劑Basta篩選標(biāo)記獲得轉(zhuǎn)基因植株，在得到轉(zhuǎn)基因植株的基礎(chǔ)上，通過38度溫度誘導(dǎo)調(diào)控Cre基因的表達(dá)從而刪除選擇標(biāo)記，刪除率70%，獲得含有目的基因而無選擇標(biāo)記的嵌合體。
[0024]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項】
1.雙誘導(dǎo)同源重組無標(biāo)記載體質(zhì)粒，其特征在于:所述的質(zhì)粒序列如SEQID N0.1所不O2.雙誘導(dǎo)同源重組無標(biāo)記載體質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于:所述載體的構(gòu)建方法為: (1)利用酵母基因組的Cre基因構(gòu)建表達(dá)抗除草劑標(biāo)記基因的元件； (2)以植物熱激蛋白基因的啟動子為酵母Cre重組酶基因的啟動子，在38-45度溫度下誘導(dǎo)表達(dá)重組酶； (3)將以上步驟(I)和(2)元件和RNAi載體組裝在一起構(gòu)建生態(tài)環(huán)保型質(zhì)粒。3.如權(quán)利要求1所述的雙誘導(dǎo)同源重組無標(biāo)記載體質(zhì)粒在水稻、擬南芥和白菜中應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/82GK105950652SQ201610391345
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月6日
【發(fā)明人】繆穎, 伍炳華, 任育軍
【申請人】福建農(nóng)林大學(xué)