一種高效表達(dá)與制備外分泌型人源ca125的方法
【專利摘要】一種高效表達(dá)與制備外分泌型人源CA125的方法，該方法主要包括如下三個(gè)方面的內(nèi)容：(1)利用基因合成技術(shù)合成CA125的DNA序列，再采用基因克隆和分子生物學(xué)方法構(gòu)建酵母重組表達(dá)質(zhì)粒PpICZαA?CA125，并進(jìn)行質(zhì)粒抽提；(2)使用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)體外誘導(dǎo)表達(dá)分泌型CA125重組蛋白，并通過(guò)優(yōu)化表達(dá)時(shí)間、誘導(dǎo)劑添加量等條件得出最佳誘導(dǎo)條件；(3)優(yōu)化硫酸銨分級(jí)沉淀,從發(fā)酵液上清中分離純化得到分泌到胞外的CA125重組蛋白，在55％硫酸銨濃度下目的蛋白CA125幾乎全部析出，本發(fā)明將純化得到的分泌重組蛋白CA125用臨床檢測(cè)電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)其生物活性，其值達(dá)802100U/mL。
【專利說(shuō)明】
一種高效表達(dá)與制備外分泌型人源CA125的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種體外重組高效表達(dá)制備具有生物活性CA125的方法，具體涉及利用分泌型畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)具有生物活性的人源CA125重組蛋白的方法，屬于生物醫(yī)學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]腫瘤相關(guān)抗原CA125是一種細(xì)胞表面的高分子糖蛋白，為膜抗原，組織分布廣泛， 在部分正常組織、良性病變和惡性腫瘤中均可產(chǎn)生。腫瘤相關(guān)抗原CA125作為最重要的腫瘤標(biāo)志物，被廣泛應(yīng)用于婦科上皮性惡性腫瘤，特別是卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌的診斷和治療，也成為多種婦科疾病的篩查、診斷、隨訪以及病情監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)。目前，CA125作為高特異性的卵巢腫瘤標(biāo)志物已被廣泛應(yīng)用于卵巢癌的臨床診斷、療效觀察和疾病監(jiān)測(cè)。
[0003]巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)是近幾年發(fā)展起來(lái)的較為完善的、被廣泛用來(lái)表達(dá)外源蛋白的甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)主要有以下優(yōu)點(diǎn):1)具有強(qiáng)有力的乙醇氧化酶(Alochol Oxidase，A0X1)基因啟動(dòng)子，可嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)； 2)作為真核表達(dá)系統(tǒng)，可對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后的加工與修飾，從而使表達(dá)出的蛋白具有生物活性;3)營(yíng)養(yǎng)要求低、生長(zhǎng)快、培養(yǎng)基廉價(jià)，便于工業(yè)化生產(chǎn);4)在P.pastoris中表達(dá)的蛋白既可存在于細(xì)胞內(nèi)，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，十分有利于純化;5) 糖基化程度低，與S.cerevisiae相比，P.pastoris不產(chǎn)生過(guò)度的糖基化。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供一種能夠大規(guī)模制備具有生物活性且高純度的高效表達(dá)與制備外分泌型人源CA125的方法。
[0005]本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)完成的，一種高效表達(dá)與制備外分泌型人源 CA125的方法，該方法主要包括如下三個(gè)方面的內(nèi)容:
[0006](1)利用基因合成技術(shù)合成CA125的DNA序列，再采用基因克隆和分子生物學(xué)方法構(gòu)建酵母重組表達(dá)質(zhì)粒PpICZaA-CAl 25，并進(jìn)行質(zhì)粒抽提；
[0007](2)使用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)體外誘導(dǎo)表達(dá)分泌型CA125重組蛋白，并通過(guò)優(yōu)化表達(dá)時(shí)間、誘導(dǎo)劑添加量等條件得出最佳誘導(dǎo)條件；
[0008](3)優(yōu)化硫酸銨分級(jí)沉淀，從發(fā)酵液上清中分離純化得到分泌到胞外的CA125重組蛋白，在55%硫酸銨濃度下目的蛋白CA125幾乎全部析出，經(jīng)電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)其生物活性，且生物活性值達(dá)802100U/mL。
[0009]本發(fā)明進(jìn)一步的技術(shù)方案是:所述三個(gè)方面的內(nèi)容中，分別包含有如下具體步驟:
[0010]第(1)方面的內(nèi)容中包括如下兩個(gè)步驟:
[0011]a.利用基因合成技術(shù)，合成人源CA125序列；
[0012]b.設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物，通過(guò)PCR得到帶有雙酶切位點(diǎn)的CA125克隆質(zhì)粒，并進(jìn)行質(zhì)粒提??；
[0013]第(2)方面的內(nèi)容中包括如下五個(gè)步驟:
[0014]c.將b步驟中獲得的質(zhì)粒通過(guò)雙酶切克隆到PpICZaA載體中，構(gòu)建PpICZaA_CA125重組表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)彳丁質(zhì)粒抽提；
[0015]d.將c步驟中獲得的質(zhì)粒進(jìn)行線性化后電轉(zhuǎn)進(jìn)入畢赤酵母GS115中，通過(guò)優(yōu)化感受態(tài)細(xì)胞GS115濃度，獲取高轉(zhuǎn)染率，通過(guò)PCR鑒定挑取陽(yáng)性克??；
[0016]e.將d步驟中挑取的陽(yáng)性克隆同時(shí)用甲醇進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)對(duì)甲醇添加量、誘導(dǎo)時(shí)間和菌密度表達(dá)條件的優(yōu)化，獲得最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件并獲取最佳表達(dá)重組菌；
[0017]f.通過(guò)步驟e中實(shí)驗(yàn)得出，甲醇濃度為0.5%，誘導(dǎo)表達(dá)第3天的重組蛋白的分泌量最大;
[0018]g.通過(guò)前面實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，再將表達(dá)體系擴(kuò)大至2L，收集表達(dá)第3天的發(fā)酵上清液；
[0019]第(3)方面的內(nèi)容中包括如下兩個(gè)步驟:
[0020]h.將g步驟中獲得的發(fā)酵液通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀純化蛋白，設(shè)計(jì)不同硫酸銨濃度梯度獲得沉淀蛋白；
[0021]1.將h步驟中獲得的蛋白回溶后經(jīng)透析，測(cè)其含量得出目的蛋白在55%硫酸銨濃度下幾乎已全部析出。
[0022]本發(fā)明將純化得到的分泌重組蛋白CA125用臨床檢測(cè)電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)其生物活性，其值達(dá)802100U/mL。
【附圖說(shuō)明】
[0023 ]圖1是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒Pp ICZaA的質(zhì)粒圖譜，
[0024]圖2是重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA_CA125構(gòu)建的PCR鑒定圖，
[0025]圖3是酵母GS115重組菌株的菌落PCR鑒定圖，
[0026]圖4是Western blot分析經(jīng)硫酸錢沉淀后的CA125，
[0027]圖5是硫酸銨濃縮后CA125活力測(cè)定。
[0028]圖1中圖譜的具體信息為:
[0029]5，A0X I啟動(dòng)子(5，A0X lpromoter reg1n):base 1-941
[0030]5，A0X I引物綁定位點(diǎn)(5’A0X lpriming site):base 855-875[0031 ].因子信號(hào)序列(-factor signal sequence):base 941-1207
[0032].因子引物綁定位點(diǎn)(-factoepriming site):base 1144-1164
[0033]多克隆位點(diǎn)(Multiplecloning site):base 1208-1276
[0034]c_myc抗原決定基(c_myc epitope):base 1275-1304
[0035]6XHis標(biāo)簽(Polyhistidine(6XHis)tag):base 1320-1337
[0036]3’Α0Π引物綁定位點(diǎn)(3’A0Xlpriming site):base 1423-1443Α0Π轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域(AOXltranscript1n terminat1n reg1n):base 1341-1682
[0037]TEFl啟動(dòng)子(TEFlpromoter):base 1683-2093
[0038]EM7 啟動(dòng)子(EM7promoter): base 2095-2162
[0039]Sh ble開(kāi)放閱讀框架(Sh ble ORF):base 2163-2537
[0040]CYCl轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(CYCltranscript1n terminat1n reg1n):base 2538-2855[0041 ]pUC復(fù)制起始位點(diǎn)(pUC origin):base 2866-3539(complementary strand)。
[0042]圖4中的具體信息:
[0043]Lane 1:第3天發(fā)酵液
[0044]Lane 2:55%硫酸銨集份
[0045]Lane 3:75%硫酸銨集份
[0046]M:蛋白分子量marker。
【具體實(shí)施方式】
[0047]下面將結(jié)合具體實(shí)施例以及附圖對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)介紹，本發(fā)明在實(shí)施中選用的生產(chǎn)設(shè)備都是本領(lǐng)域的常用設(shè)備，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0048]本發(fā)明所述一種高效表達(dá)與制備外分泌型人源CA125的方法，該方法主要包括如下三個(gè)方面的內(nèi)容:
[0049](I)利用基因合成技術(shù)合成CA125的DNA序列，再采用基因克隆和分子生物學(xué)方法構(gòu)建酵母重組表達(dá)質(zhì)粒PpICZaA-CAl 25，并進(jìn)行質(zhì)粒抽提；
[0050](2)使用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)體外誘導(dǎo)表達(dá)分泌型CA125重組蛋白，并通過(guò)優(yōu)化表達(dá)時(shí)間、誘導(dǎo)劑添加量等條件得出最佳誘導(dǎo)條件；
[0051 ] (3)優(yōu)化硫酸銨分級(jí)沉淀，從發(fā)酵液上清中分離純化得到分泌到胞外的CA125重組蛋白，在55%硫酸銨濃度下目的蛋白CA125幾乎全部析出，經(jīng)電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)其生物活性，值達(dá)802100U/mL。
[0052]本發(fā)明的要點(diǎn)是首先構(gòu)建酵母表達(dá)的CA125重組表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入到畢赤酵母GS115中，再通過(guò)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白CA125，最后通過(guò)硫酸銨沉淀純化表達(dá)的CA125;具體包括以下步驟:
[0053]a.利用基因合成技術(shù)，合成人源CA125序列；
[0054]b.設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物，通過(guò)PCR得到帶有雙酶切位點(diǎn)的CAl 25克隆質(zhì)粒，并進(jìn)行質(zhì)粒提??；
[0055]c.將b步驟中獲得的質(zhì)粒通過(guò)雙酶切克隆到PpICZaA載體中，構(gòu)建PpICZaA_CA125重組表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)彳丁質(zhì)粒抽提；
[0056]d.將c步驟中獲得的質(zhì)粒進(jìn)行線性化后電轉(zhuǎn)進(jìn)入畢赤酵母GS115中，通過(guò)優(yōu)化感受態(tài)細(xì)胞GS115濃度，獲取高轉(zhuǎn)染率，通過(guò)PCR鑒定挑取陽(yáng)性克??；
[0057]e.將d步驟中挑取的陽(yáng)性克隆同時(shí)用甲醇進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)對(duì)甲醇添加量、誘導(dǎo)時(shí)間、菌密度等表達(dá)條件的優(yōu)化，獲得最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件并獲取最佳表達(dá)重組菌；
[0058]f.通過(guò)e步驟中的實(shí)驗(yàn)得出，甲醇濃度為0.5%，誘導(dǎo)表達(dá)第3天的重組蛋白的分泌量最大；
[0059]g.通過(guò)前面實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，再將表達(dá)體系擴(kuò)大至2L，收集表達(dá)第3天的發(fā)酵上清液；
[0060]h.將g步驟中獲得的發(fā)酵液通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀純化蛋白，設(shè)計(jì)不同硫酸銨濃度梯度獲得沉淀蛋白；
[0061]1.將h步驟中獲得的蛋白回溶后經(jīng)透析，測(cè)其含量得出目的蛋白在55%硫酸銨濃度下幾乎已全部析出。
[0062]實(shí)施例1
[0063]1.研究材料:重組質(zhì)粒pReceiver_CA125由外包服務(wù)公司合成;表達(dá)載體pPICZaA均購(gòu)自復(fù)能基因；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購(gòu)自大連寶生物公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑購(gòu)自北京天根公司;ECL Western Blot檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Millipore公司；一抗購(gòu)自SC B1technology;二抗購(gòu)自GE Healthcare。
[0064]2.工作流程:
[0065](I)以原核表達(dá)重組質(zhì)粒pReceiVer-CA125為模板，設(shè)計(jì)含限制性內(nèi)切酶EcoRI和KpnI識(shí)別位點(diǎn)的PCR引物，PCR擴(kuò)增帶雙酶切識(shí)別位點(diǎn)的CA125目的基因片段，再將畢赤酵母表達(dá)載體PPICZaA(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)和CA125PCR擴(kuò)增基因片段同時(shí)用EcoRI和KpnI雙酶切后經(jīng)T4DNA連接酶連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA-CAl 25。
[0066](2)制備E.Coli BL21(DE3)的感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA-CAl25，取10uL涂布在含zeocin抗性的低鹽LB即LLB平板上，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。挑取4個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示在2700bp左右的位置有特異性條帶，表明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，如圖2所示。選取其中一個(gè)單克隆置于ISmIy^zeocin LLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，再用小提中量質(zhì)粒提取試劑盒抽提重組表達(dá)質(zhì)粒。
[0067](3)在將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中之前，先將(3)中提取獲得的重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoRI進(jìn)行單酶切線性化、乙醇純化，制備新鮮的畢赤酵母GSl 15感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)電轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入GS115中，并均勻地將其涂布在含zeocin的YH)平板中。待長(zhǎng)出單克隆后，挑取18個(gè)單克隆進(jìn)行PCR鑒定，用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示在2700bp左右的位置有特異性條帶，表明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，如圖3所示。
[0068](4)挑取(3)中鑒定為陽(yáng)性單克隆的4株重組菌株接種于1mL BMGY培養(yǎng)基中。30°C震蕩培養(yǎng)至OD6QQ達(dá)2?6，2500r/min離心5min，棄上清，用20mL BMMY培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，30°C振蕩培養(yǎng)甲醇(0.5%)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)開(kāi)始后每隔2411取樣，樣品經(jīng)800(^/1^11離心Imin，將上清和細(xì)胞沉淀分離并放置在4°C。同時(shí)，補(bǔ)加無(wú)菌的100 %甲醇至終濃度為0.5 %以維持誘導(dǎo)。
[0069](5)發(fā)酵液經(jīng)8000r/min離心30min。將發(fā)酵上清液用硫酸銨分級(jí)沉淀(30%、55%和75% )進(jìn)行純化，并通過(guò)Western blot分析純化結(jié)果。結(jié)果Western blot檢測(cè)到10kDa處有CAl 25特異性免疫反應(yīng)條帶，表明重組CAl 25蛋白表達(dá)成功如圖4所示。
[0070](6)將(5)中的經(jīng)硫酸銨沉淀后獲得的CA125和硫酸銨沉淀前的CA125用羅氏E601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定其活力，結(jié)果表明成功表達(dá)的重組CA125具有生物活性如圖5所不O
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種高效表達(dá)與制備外分泌型人源CA125的方法，其特征在于該方法主要包括如下 三個(gè)方面的內(nèi)容:(1)利用基因合成技術(shù)合成CA125的DNA序列，再采用基因克隆和分子生物學(xué)方法構(gòu)建 酵母重組表達(dá)質(zhì)粒PpICZaA-CAl 25，并進(jìn)行質(zhì)粒抽提；(2)使用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)體外誘導(dǎo)表達(dá)分泌型CA125重組蛋白，并通過(guò)優(yōu)化表達(dá)時(shí) 間、誘導(dǎo)劑添加量等條件得出最佳誘導(dǎo)條件；(3)優(yōu)化硫酸銨分級(jí)沉淀，從發(fā)酵液上清中分離純化得到分泌到胞外的CA125重組蛋 白，在55%硫酸銨濃度下目的蛋白CA125幾乎全部析出，經(jīng)電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)其生物活性， 其生物活性值達(dá)802100U/mL。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效表達(dá)與制備外分泌型人源CA125的方法，其特征在于所述 三個(gè)方面的內(nèi)容中，分別包含有如下具體步驟:第(1)方面的內(nèi)容中包括如下兩個(gè)步驟:a.利用基因合成技術(shù)，合成人源CA125序列；b.設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物，通過(guò)PCR得到帶有雙酶切位點(diǎn)的CA125克隆質(zhì)粒，并進(jìn)行質(zhì) 粒提??；第(2)方面的內(nèi)容中包括如下五個(gè)步驟:c.將b步驟中獲得的質(zhì)粒通過(guò)雙酶切克隆到PpICZaA載體中，構(gòu)建PpICZaA_CA125重組 表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行質(zhì)粒抽提；d.將c步驟中獲得的質(zhì)粒進(jìn)行線性化后電轉(zhuǎn)進(jìn)入畢赤酵母GS115中，通過(guò)優(yōu)化感受態(tài)細(xì) 胞GS115濃度，獲取高轉(zhuǎn)染率，通過(guò)PCR鑒定挑取陽(yáng)性克??；e.將d步驟中挑取的陽(yáng)性克隆同時(shí)用甲醇進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)對(duì)甲醇添加量、誘導(dǎo) 時(shí)間和菌密度表達(dá)條件的優(yōu)化，獲得最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件并獲取最佳表達(dá)重組菌；f.通過(guò)步驟e中實(shí)驗(yàn)得出，甲醇濃度為0.5%，誘導(dǎo)表達(dá)第3天的重組蛋白的分泌量最 大；g.通過(guò)前面實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，再將表達(dá)體系擴(kuò)大至2L，收集表達(dá)第3天的發(fā)酵上清液；第(3)方面的內(nèi)容中包括如下兩個(gè)步驟:h.將g步驟中獲得的發(fā)酵液通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀純化蛋白，設(shè)計(jì)不同硫酸銨濃度梯度 獲得沉淀蛋白；I.將h步驟中獲得的蛋白回溶后經(jīng)透析，測(cè)其含量得出目的蛋白在55%硫酸銨濃度下 幾乎全部析出。
【文檔編號(hào)】C12R1/84GK105950647SQ201610321064
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月16日
【發(fā)明人】歐文斌, 孟凡國(guó), 劉麗, 嚴(yán)子琴, 李海龍
【申請(qǐng)人】浙江理工大學(xué), 浙江清華長(zhǎng)三角研究院