一個嵌合型RbcS cTP基因及其表達(dá)載體和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一個嵌合型RbcS cTP基因及其表達(dá)載體和應(yīng)用。該基因由擬南芥RbcS cTP的N?端插入到玉米RbcS cTP的N?端和中間結(jié)構(gòu)域之間形成，其cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。玉米RbcS cTP基因，其cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。所述的嵌合型RbcS cTP基因能在將外源基因轉(zhuǎn)入到單子葉和/或雙子葉植物葉綠體中應(yīng)用。
【專利說明】
一個嵌合型RbcS cTP基因及其表達(dá)載體和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開了一個嵌合型RbcS cTP基因及其表達(dá)載體和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 葉綠體是綠色植物把光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的重要細(xì)胞器，葉綠體只能合成自身需要 的一部分蛋白質(zhì)，許多葉綠體蛋白均是由核基因編碼的，它們在細(xì)胞質(zhì)中被翻譯成成熟的 功能性蛋白或蛋白質(zhì)前體物，然后再被導(dǎo)入到葉綠體中發(fā)揮各自的功能。導(dǎo)肽在這個過程 中發(fā)揮了十分重要作用。多數(shù)葉綠體蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)饺~綠體是由轉(zhuǎn)運(yùn)肽（transit peptide, TP)的介導(dǎo)來實現(xiàn)的。該轉(zhuǎn)運(yùn)肽一般位于被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的N端。在氨基酸序列一級結(jié) 構(gòu)上TP可被分為三個結(jié)構(gòu)域，它們分別是N-端結(jié)構(gòu)域、中間結(jié)構(gòu)域和C-端結(jié)構(gòu)域。在不同物 種的同一個結(jié)構(gòu)域之間或者同一物種的不同結(jié)構(gòu)域之間，其序列通常具有高度的可變性， 缺少一致序列或共同序列基序。每一個基序在葉綠體蛋白運(yùn)輸?shù)奶囟ㄟ^程中都發(fā)揮著至關(guān) 重要的作用。1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亞基（the small subunits of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，RbcS)的葉綠體車專運(yùn)肽（chloroplast transit peptide，cTP)是研究較為廣泛的植物葉綠體導(dǎo)肽之一。
[0003] 目前，擬南芥RbcS的cTP的結(jié)構(gòu)域和部分基序的功能相對比較清楚，但是在單子葉 植物RbcS的cTP中，其結(jié)構(gòu)域和不同基序是如何發(fā)揮功能的還不是很清楚，特別是單子葉和 雙子葉植物的cTP是否具有物種特異性等至今鮮有報道。
[0004] 本研究首先在啟候選動子/增強(qiáng)子驗證中篩選出玉米RbcS cTP，利用生物信息學(xué) 預(yù)測轉(zhuǎn)運(yùn)肽的大小，并克隆玉米RbcS的cTP基因，再采用類似方法克隆出水稻和擬南芥中的 同源基因，發(fā)現(xiàn)RbcS cTP的葉綠體的靶向功能在單子葉和雙子葉植物中具有明顯的物種特 異性;其次構(gòu)建了玉米和擬南芥的N-端串聯(lián)的嵌合型cTP，轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體后GFP信號定位到 擬南芥和玉米的葉綠體中。
[0005] 葉綠體作為一種新型生物反應(yīng)器，生產(chǎn)藥物和某些具有特殊功能的蛋白，具有高 效表達(dá)、定點(diǎn)整合、安全性好、后代遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，發(fā)展前景非常好。隨著植物葉綠體基因 工程研究的不斷完善，該發(fā)明有利將葉綠體作為一種新型高效的生物反應(yīng)器，將為遺傳工 程帶來新的生機(jī)和活力，也將為農(nóng)業(yè)發(fā)展帶來一場"綠色革命"。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個目的是提供玉米RbcS cTP基因和嵌合型RbcS cTP基因。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的是提供玉米RbcS cTP和嵌合型RbcS cTP的瞬時表達(dá)載體。 [0008]本發(fā)明的又一個目的是提供玉米RbcS cTP和嵌合型RbcS cTP的瞬時表達(dá)載體，瞬 時表達(dá)可用于將外源基因轉(zhuǎn)入到單子葉和雙子葉植物葉綠體中。
[0009] 本發(fā)明的目的可以通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0010] 一個嵌合型RbcS cTP基因，由擬南芥RbcS cTP的N-端插入到玉米RbcS cTP的N-端 和中間結(jié)構(gòu)域之間形成，其cDNA序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011] 所述的嵌合型RbcS cTP基因編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0012] 含有所述的嵌合型RbcS cTP基因的瞬時表達(dá)載體。
[0013]所述的瞬時表達(dá)載體優(yōu)選以pJIT163-hGFP為原始載體，將所述的嵌合型RbcS cTP 插入p JIT163-hGFP的Hind III和BamM酶切位點(diǎn)間所得。
[0014] 所述的嵌合型RbcS cTP基因在將外源基因轉(zhuǎn)入到單子葉和/或雙子葉植物葉綠體 中的應(yīng)用。
[0015] 含有所述的嵌合型RbcS cTP基因的瞬時表達(dá)載體在將外源基因轉(zhuǎn)入到單子葉和/ 或雙子葉植物葉綠體中的應(yīng)用。
[0016] 玉米RbcS cTP基因，其cDNA序列如SEQ ID N0.1所示。
[0017] 含有SEQ ID NO. 1所示的玉米RbcS cTP基因的瞬時表達(dá)載體。
[0018]所述的瞬時表達(dá)載體優(yōu)選以pJIT163-hGFP為原始載體，將SEQ ID N0.1所示的玉 米RbcS cTP基因插入pJIT163-hGFP的Hindlll和Banffl酶切位點(diǎn)間所得。
[0019] SEQ ID NO. 1所示的玉米RbcS cTP基因在將外源基因轉(zhuǎn)入到單子葉和/或雙子葉 植物葉綠體中的應(yīng)用。
[0020] 含有SEQ ID NO. 1所示的玉米RbcS cTP基因的瞬時表達(dá)載體在將外源基因轉(zhuǎn)入到 單子葉植物葉綠體中的應(yīng)用。
[0021] 有益效果：
[0022] 本發(fā)明首次從玉米中克隆得到RbcS cTP基因及其所編碼的蛋白質(zhì)，為玉米中首次 報道。將玉米和擬南芥的RbcS cTP插入瞬時表達(dá)載體pJIT163-hGFP，轉(zhuǎn)化到玉米、小麥、水 稻和擬南芥原生質(zhì)體中，玉米的RbcS cTP瞬時轉(zhuǎn)化載體的GFP信號可以定位到玉米、小麥或 水稻的葉綠體中，不可以定位到擬南芥的葉綠體中；而擬南芥的RbcS cTP瞬時轉(zhuǎn)化載體的 GFP信號只可以定位到擬南芥葉綠體中，不可以定位到玉米或水稻的葉綠體中。把擬南芥 RbcS cTP的N-端結(jié)構(gòu)域插入到玉米RbcS cTP的N-端和中間結(jié)構(gòu)域中間的嵌合型cTP，轉(zhuǎn)化 原生質(zhì)體后GFP信號可同時定位到擬南芥和玉米的葉綠體中。
【附圖說明】
[0023] 圖1玉米RbcS cTP瞬時表達(dá)載體構(gòu)建示意圖。
[0024]圖2 cTP序列三個結(jié)構(gòu)域劃分。
[0025] 圖3 TP-DNTP結(jié)構(gòu)示意圖。
[0026]圖4玉米RbcS cTP在水稻、小麥、擬南芥葉綠體中的亞細(xì)胞定位信號。
[0027]圖5擬南芥RbcScTP在擬南芥和玉米中的亞細(xì)胞定位信號。
[0028]圖6 RbcScTP的N-端串聯(lián)混合型cTP在玉米和擬南芥中的亞細(xì)胞定位信號。
【具體實施方式】
[0029] 實施例1克隆RbcScTP基因及載體構(gòu)建
[0030] 玉米是單子葉植物，基因組已完成測序。玉米RbcScTP基因是由第一
【申請人】(發(fā)明 人）張文利根據(jù)mDNase_seq(modified DNase-seq)鑒定出DHSs(DNase I hypersensitive sites)，同時結(jié)合RNA-seq的分析得到候選啟動子/增強(qiáng)子，然后用GFP作為報告基因，利用 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法從這些候選啟動子/增強(qiáng)子中篩選得到。在NCBI上用blast找到擬南芥的同 源基因。
[0031]首先用引物F1CGATAAGGCGACAAGTGGTG(SEQ ID N0.5)/R1:CTGCATGCACCGGATCCTT (SEQ ID NO·6 )和F2:AGTAGTAATGGCTTCCTCTATGC(SEQ ID NO .7 ) /R2： ACCTTCATGCAGCTAACTCTTC(SEQ ID NO. 8)分別從玉米和擬南芥基因組中將RbcScTP基因分 別克隆到PMD19-T載體上，測序后用NCBI比對序列。然后用玉米RbcScTP基因引物F3: GCCCTTGCTCACCATGGATCCATGGCGCCCACCGTGATGAT(SEQ ID NO .9)/R3： GCCCTTGCTCACCATGGATCCGGACCGGATCCTTCCGCCGT(SEQIDN0·10)和擬南芥RbcScTP基因 引物F4 : TGGAGAGGACAGCCCAAGCTTATGGCTTCCTCTATGCTCTC(SEQ ID NO · 11 )/R4 : GCCCTTGCTCACCATGGATCCGCAGCTAACTCTTCCCCCGT(SEQ ID NO. 12)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用快速克 隆試劑盒ClonExpress?n(南京諾唯贊公司）把PCR產(chǎn)物連到瞬時表達(dá)載體pJIT163-hGFP的 Hindm和BamHI之間（如圖1所示），測序后用NCBI比對序列，并分別命名為M-TP(maize RbcS-TP)和A-TP(ArabidopsisRbcS-TP)。同時用相同的方法，先把玉米RbcS cTP的中間結(jié) 構(gòu)域和C-端結(jié)構(gòu)域（如圖2所示)連到瞬時表達(dá)載體pJIT163-hGFP的Hindm和BamHI之間： (F5 : TGGAGAGGACAGCCCAAGCTTGTCGCCCCGTTCCAGGGTCT(SEQ ID NO.13)/R5: GCCCTTGCTCACCATGGATCCGCACCGGATCCTTCCGCCGT(SEQ ID NO.14)，模板Ml: GTCGCCCCGTTCCAGGGTCTCAAGTCCGCCGCCAGCCTCCCCGTCGCCCGCCGCAGCACCAGGAGCCTCGGCAACGT CAGCAACGGCGGAAGGATCCGGTGC(SEQ ID NO. 15))，然后再插入擬南芥RbcScTP的N-端結(jié)構(gòu)域 (F6:TGGAGAGGACAGCCCAAGCTTATGGCTTCCTCTATGCTCTC(SEQ ID NO.16)/R6: GAGACCCTGGAACGGGGCGACCATGGTGGCCTGAGCCGGGG(SEQ ID NO.17)，模板M2: ATGGCTTCCTCTATGCTCTCCTCCGCCGCTGTGGTTACATCCCCGGCTCAGGCCACCATG(SE Q ID NO.18)), 最后再插入玉米RbcS cTP的N-端結(jié)構(gòu)域(F7: TGGAGAGGACAGCCCAAGCTTATGGCGCCCACCGTGATG (SEQIDN0·19)/R7:GGAGAGCATAGAGGAAGCCATGGCGGTTGCCGACGAGGC(SEQIDN0·20)，模板 M3:ATGGCGCCCACCGTGATGATGGCCTCGTCGGCAACCGCC(SEQ ID N0.21))，構(gòu)建成擬南芥RbcS cTP的N-端結(jié)構(gòu)域插入到玉米RbcS cTP的N-端和中間結(jié)構(gòu)域中間的嵌合型cTP的瞬時轉(zhuǎn)化 表達(dá)載體(如圖3所示），并命名為TP-DNTP。
[0032]實施例2原生質(zhì)體提取及轉(zhuǎn)化
[0033]原生質(zhì)體的提取及轉(zhuǎn)化方法主要參照已發(fā)表的方法（參考文獻(xiàn)：Yang Zhang， Jianbin Su，等，A highly efficient rice green tissue protoplastsystem for transient gene expression andstudying light/chloroplast-related processes， Plant Methods，2011)，并做適當(dāng)修改，通過該方法提取了玉米、水稻、小麥和擬南芥的原生 質(zhì)體。
[0034]步驟：
[0035] 1)培養(yǎng)正常生長的綠化苗，選取玉米、水稻和小麥生長十天左右的幼苗，擬南三周 左右的幼苗，同時純化轉(zhuǎn)化用的實施例1構(gòu)建的兩種瞬時表達(dá)質(zhì)粒20u 1 (1 ug/u 1)。
[0036] 2)配制酶液 1〇1111，55。(：加熱1〇11^11。
[0037] 3)用刀片將葉片(玉米、小麥和擬南芥)或莖(水稻)切至0.5-lmm左右，立即浸入酶 液中。
[0038] 4)抽真空30min，在28 °C下黑暗中30-50rpm振蕩培養(yǎng)4-6h左右。
[0039] 5)加入等體積W5并搖勻，再通過35μπι(200目）尼龍膜過濾酶液，。
[0040] 6) 100g室溫離心2min，棄上清，緩慢沿著壁加入4ml W5溶液，輕輕懸浮，然后再進(jìn) 行100g X 2min室溫離心。
[00411 7)棄去上清，沿管壁加入預(yù)冷的MMG溶液4ml，100g X 2min室溫離心后棄去上清， 重新加入4ml MMG溶液，充分懸浮后冰浴30min。
[0042] 8) 100g室溫離心2min來沉淀原生質(zhì)體，棄去上清，加 MMG調(diào)整原生質(zhì)體濃度為1-2 X105/ml〇
[0043] 9)取2ml tube,按100μ1原生質(zhì)體加入10μ1質(zhì)粒，輕彈混勻后加入110yl40%PEG， 輕彈混勻。室溫靜置20min。
[0044] 10)加入lml W5溶液，混勻清洗，100g X 2min室溫離心。
[0045] 11)取上清，加入500μ1 W5,輕彈混勻，28°C黑暗過夜培養(yǎng)。
[0046] 12)第二天，100g，3min室溫離心，去上清，留取20-40μ1，輕彈混勻后制片觀察。
[0047] 實例3RbcScTP基因定位
[0048]培養(yǎng)后的原生質(zhì)體用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察。設(shè)定不同的激發(fā)波長，利用GFP 熒光蛋白發(fā)出綠色熒光和葉綠體自發(fā)紅光區(qū)分信號，并進(jìn)行信號觀察。結(jié)果顯示，玉米和水 稻的RbcS cTP瞬時轉(zhuǎn)化載體的GFP信號可以定位到玉米、小麥或水稻的葉綠體中，不可以定 位到擬南芥的葉綠體中；而擬南芥的RbcS cTP瞬時轉(zhuǎn)化載體的GFP信號只可以定位到擬南 芥葉綠體中，不可以定位到玉米或水稻的葉綠體中。把擬南芥RbcS cTP的N-端結(jié)構(gòu)域插入 到玉米RbcS cTP的N-端和中間結(jié)構(gòu)域中間的嵌合型RbcS cTP，轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體后GFP信號定 位到擬南芥和玉米的葉綠體中。上述實驗說明玉米RbcS cTP能夠?qū)⑼庠椿蚨ㄎ坏胶瘫究?單子葉植物的葉綠體中，而嵌合型RbcS cTP能夠?qū)⑼庠椿蚨ㄎ坏诫p子葉和單子葉植物的 葉綠體中。
【主權(quán)項】
1. 一個嵌合型RbcS cTP基因，其特征在于由擬南芥RbcS cTP的N-端插入到玉米RbcS cTP的N-端和中間結(jié)構(gòu)域之間形成，其cDNA序列如SEQ ID NO.3所示。2. 權(quán)利要求1所述的嵌合型RbcS cTP基因編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其特征在于其氨基酸序列如 SEQ ID NO .4所示。3. 含有權(quán)利要求1所述的嵌合型RbcS cTP基因的瞬時表達(dá)載體。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的瞬時表達(dá)載體，其特征在于以pJIT163-hGFP為原始載體，將權(quán) 利要求1所述的嵌合型RbcS cTP插入pJIT163-hGFP的HindIII和BamM酶切位點(diǎn)間所得。5. 含有SEQ ID NO. 1所示的玉米RbcS cTP基因的瞬時表達(dá)載體。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的瞬時表達(dá)載體，其特征在于以pJIT163-hGFP為原始載體，將 SEQ ID N0.1所示的玉米RbcS cTP基因插入pJIT163-hGFP的HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)間所 得。7. 權(quán)利要求1所述的嵌合型RbcS cTP基因在將外源基因轉(zhuǎn)入到單子葉和/或雙子葉植 物葉綠體中的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求3或4所述的瞬時表達(dá)載體在將外源基因轉(zhuǎn)入到單子葉和/或雙子葉植物葉 綠體中的應(yīng)用。 9.SEQ ID NO. 1所示的玉米RbcS cTP基因在將外源基因轉(zhuǎn)入到單子葉和/或雙子葉植 物葉綠體中的應(yīng)用。10.含有SEQ ID NO. 1所示的玉米RbcS cTP基因的瞬時表達(dá)載體在將外源基因轉(zhuǎn)入到 單子葉和/或雙子葉植物葉綠體中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N9/88GK105950641SQ201610438482
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月18日
【發(fā)明人】張文利, 汪西蒙, 方圓, 王磊, 潘秀才
【申請人】南京農(nóng)業(yè)大學(xué)