仿組蛋白基因載體及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種仿組蛋白基因載體及其制備方法和應(yīng)用，屬于基因載體技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因治療為癌癥等疑難疾病的治療提供了一種新的可能。成功的基因治療可將目 的基因順利送達(dá)病變細(xì)胞，并使目的基因得以表達(dá)，這一過程需借助一定的基因傳遞載體。 基因傳遞載體包括病毒類載體和非病毒類載體。雖然病毒類載體的基因轉(zhuǎn)染效率尚，但是 非病毒類載體具有免疫原性小，靶向特異性，造價(jià)低廉，使用方便等特點(diǎn)，從而在眾多方面 優(yōu)于病毒類載體。本課題所研究的一一仿組蛋白基因載體系統(tǒng)除了生物載體基因輸送系統(tǒng) 所具有的優(yōu)勢(shì)外，轉(zhuǎn)染效率也有顯著的提高。
[0003] 組蛋白作為天然的染色體組成成分具備優(yōu)異的核酸壓縮性能。研究發(fā)現(xiàn)將組蛋白 作為基因載體進(jìn)行基因治療可以有效的介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)運(yùn)。首先組蛋白表面存在大量的精氨 酸、賴氨酸等堿性氨基酸，其可通過靜電作用與DNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物，繼而通過內(nèi)吞作用 將基因載體轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤細(xì)胞內(nèi)。
[0004] 然而，天然的組蛋白提純分離困難，價(jià)格昂貴。故，在體外合成一種既能模仿組蛋 白的高效壓縮核酸性能，又可以繼續(xù)保持其低毒性的高分子材料，這在基因遞送方面顯示 出一定的優(yōu)勢(shì)。本課題設(shè)想借助精氨酸與組氨酸的脫羧基產(chǎn)物胍丁胺與組胺和含有二硫鍵 的二丙烯胱酰胺（CBA)通過邁克爾加成反應(yīng)制備仿組蛋白基因載體，其可高效壓縮DNA，且 具有天然組蛋白具有的生物相容性好，轉(zhuǎn)染能力優(yōu)良的特點(diǎn)。
[0005] 谷胱甘肽（GSH)是一種天然生理成分，它具有解毒、延緩衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫性 能、抗癌等作用。病理?xiàng)l件下，腫瘤的存在會(huì)使人體會(huì)產(chǎn)生有害的氧自由基，而人體自身產(chǎn) 生的GSH可以降低此自由基對(duì)細(xì)胞的損害。故，利用腫瘤細(xì)胞內(nèi)的缺氧還原性環(huán)境，使得具 有二硫鍵的仿組蛋白基因載體PCAH基因載體系統(tǒng)在癌細(xì)胞的還原斷裂，基因載體分解，從 而實(shí)現(xiàn)基因的的可控釋放。
[0006] 綜上，本發(fā)明擬利用精氨酸，組氨酸等堿性氨基酸的脫羧基產(chǎn)物與二丙烯酰胱胺 的邁克爾加成反應(yīng)來制備具有仿組蛋白性質(zhì)的生物可降解高分子基因載體，并探討反應(yīng)條 件、胍丁胺與組胺的投料比等的變化對(duì)產(chǎn)物分子量和DNA壓縮能力的影響，期待借助該高 分子上與穿膜肽類似的大量胍基的存在，使其具有對(duì)腫瘤細(xì)胞的高效穿透能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 目的：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供一種仿組蛋白基因載體，。
[0008] 技術(shù)方案：為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0009] -種仿組蛋白基因載體，以精氨酸，組氨酸等堿性氨基酸脫羧基產(chǎn)物胍丁胺，組胺 和二丙烯胱酰胺（CBA)為原料，通過邁克爾加成反應(yīng)合成仿組蛋白基因載體PCAH;仿組蛋 白基因載體PCAH的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：其中，x為正整數(shù)，y為自然數(shù)，
[0010] 上述的仿組蛋白基因載體，制備方法如下：將一定比例的胍丁胺和/或組胺，二丙 烯胱酰胺在攪拌下加入甲醇共混；通入Ar保護(hù)，油浴80-KKTC，攪拌下反應(yīng)12-150h，即得 仿組蛋白基因載體PCAH。
[0011] 具體包括以下步驟：
[0012] (1)二丙烯胱酰胺的合成：將氫氧化鈉，溶解于的二氯甲烷中的丙烯酰氯逐滴加 入到胱胺二鹽酸鹽的水溶液中，冰浴，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，得到CBA粗品；使用二氯甲烷多次萃 取CBA，合并有機(jī)相，加入無水硫酸鈉除水分；將溶液抽濾，濾液旋蒸，加入300mL乙酸乙酯， 70°C水浴溶解，室溫滴加正庚烷，靜置沉淀；將沉淀烘箱干燥，稱重，得到白色固體，即二丙 烯胱酰胺；
[0013] (2)將二丙烯胱酰胺、胍丁胺和組胺在攪拌下加入甲醇共混；通入Ar保護(hù)，油浴 90°C，攪拌反應(yīng)24h，透析純化即得仿組蛋白基因載體PCAH。
[0014] 作為優(yōu)選方案，反應(yīng)中加入的二丙烯胱酰胺：胍丁胺：組胺的摩爾比為 1:0. 01-1:0-1，且反應(yīng)中加入的胍丁胺和組胺的摩爾數(shù)之和等于二丙烯胱酰胺的摩爾數(shù)。 可以選用胍丁胺和組胺的混合物或者只有胍丁胺。
[0015] 所述仿組蛋白基因載體的分子量為1000-100000。
[0016] 本發(fā)明還提供上述的仿組蛋白基因載體在制備用于腫瘤、代謝性疾病、纖維化、神 經(jīng)退行性疾病基因治療中的用途。
[0017] 本發(fā)明的另一目的是，提供一種可還原響應(yīng)釋放基因的基因載體系統(tǒng)，即上述的 仿組蛋白基因載體與核酸形成的復(fù)合物。
[0018] 所述核酸為小干擾RNA或者質(zhì)粒DNA。
[0019] 所述復(fù)合物的粒徑范圍為50-100nm，表面電荷為+20-+50mV。
[0020] 有益效果：本發(fā)明提供的仿組蛋白基因載體與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0021] (1)借助精氨酸與組氨酸的脫羧基產(chǎn)物胍丁胺與組胺和含有二硫鍵的二丙烯胱酰 胺（CBA)通過邁克爾加成反應(yīng)制備仿組蛋白基因載體，其可高效壓縮核酸，且具有天然組 蛋白具有的生物相容性好，轉(zhuǎn)染能力優(yōu)良的特點(diǎn)。
[0022] (2)借助該高分子上穿膜肽的大量胍基，使其具有對(duì)腫瘤細(xì)胞的高效穿透能力。
[0023] (3)具有二硫鍵的PCAH基因載體系統(tǒng)在癌細(xì)胞內(nèi)高GSH濃度的還原響應(yīng)下斷裂， 基因載體分解，從而實(shí)現(xiàn)核酸的高效釋放。
【附圖說明】
[0024] 圖1是仿組蛋白基因載體PCAH的核磁氫譜圖（1A)和分子量表征（1B);
[0025] 圖2是PCAH與DNA結(jié)合能力的凝膠電泳圖；
[0026] 圖3是PCAH基因載體系統(tǒng)的還原響應(yīng)凝膠電泳圖；
[0027] 圖4是PCAH基因載體系統(tǒng)在IfepG2細(xì)胞上轉(zhuǎn)染效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明。
[0029] 實(shí)施例1 :PCAH基因載體的制備
[0030] 稱取 0? 2g 胍丁胺（lmmol)和 0? 52g 二丙稀胱酰胺（2mmol)和 0? 18g 組胺（lmmol) 于燒瓶中，加入3mL甲醇攪拌下共混。通Ar保護(hù)，油浴升溫至90°C，攪拌反應(yīng)24h，透析純 化。仿組蛋白基因載體PCAH的核磁氫譜圖如圖1A所示，其分子量經(jīng)GPC表征如圖1B所示。
[0031] 實(shí)施例2 :PCAH基因載體與DNA結(jié)合的基因載體系統(tǒng)（PCAH-DNA)的制備
[0032] 將PCAH基因載體與DNA以不同質(zhì)量比混合，共孵育30min即PCAH-DNA復(fù)合物。 凝膠電泳實(shí)驗(yàn)所得PCAH-DNA復(fù)合物的最佳結(jié)合質(zhì)量比例為2 :1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。所得 PCAH-DNA復(fù)合物的粒徑與表面電荷如下：
[0033]
[0034] 實(shí)施例3 :PCAH-DNA基因載體系統(tǒng)的還原響應(yīng)實(shí)驗(yàn)
[0035] 利用二硫代蘇糖醇（DTT)模擬細(xì)胞內(nèi)高濃度的GSH環(huán)境，用凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，考察 PCAH-DNA基因載體系統(tǒng)的還原響應(yīng)能力，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行各組分比例如下：
[0036]
[0037] 所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。
[0038] 實(shí)施例4 :PCAH-DNA基因載體系統(tǒng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)
[0039] 將HepG2細(xì)胞接種于兩塊24孔板上，每孔10000個(gè)細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng) 24h。根據(jù)樣品（lmg/mL)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)確定的最佳結(jié)合比例在HepG2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。 加入24孔板前先將pGL-3質(zhì)粒DNA滴加入配好的載體聚合物溶液中，制成納米粒，從培養(yǎng) 箱中取出24孔板，吸走上清。處理好后，培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后，吸走上清，各孔加入lmL的完全 培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，按照熒光素酶轉(zhuǎn)染試劑盒說明操作，進(jìn)行熒光素定量實(shí)驗(yàn)。實(shí) 驗(yàn)結(jié)果見圖4。
[0040] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種仿組蛋白基因載體，其特征在于，仿組蛋白基因載體PCAH的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：其中，X為正整數(shù)，y為自然數(shù)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的仿組蛋白基因載體，制備方法如下：將一定比例的胍丁胺和 /或組胺，二丙烯胱酰胺在攪拌下加入甲醇共混；通入Ar保護(hù)，油浴SO-KKTC，攪拌下反應(yīng) 12-150h，即得仿組蛋白基因載體PCAH。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的仿組蛋白基因載體，其特征在于：反應(yīng)中加入的二丙烯胱酰 胺：胍丁胺：組胺的摩爾比為1:0. 01-1:0-1，且胍丁胺和組胺的摩爾數(shù)之和等于二丙烯胱 酰胺的摩爾數(shù)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的仿組蛋白基因載體，其特征在于：所述仿組蛋白基因載體的 分子量為1000-100000。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的仿組蛋白基因載體在制備用于腫瘤、代謝性疾病、 纖維化、神經(jīng)退行性疾病基因治療中的用途。6. -種如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的仿組蛋白基因載體與核酸形成的復(fù)合物。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的復(fù)合物，其特征在于：所述核酸為小干擾RNA或者質(zhì)粒DNA。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的復(fù)合物，其特征在于：所述復(fù)合物的粒徑范圍為50-100nm，表 面電荷為 +20 __i~50niV。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種仿組蛋白基因載體及其制備方法和用途；具體涉及一種可遞送基因的仿組蛋白基因載體PCAH，還提供一種基因載體系統(tǒng)由精氨酸，組氨酸等堿性氨基酸脫羧基產(chǎn)物胍丁胺、組胺和二丙烯酰胱胺而合成的聚合物，通過與核酸之間靜電吸附自組裝而成。本發(fā)明還公開了仿組蛋白基因載體的制備方法及其在基因治療中的作用。本發(fā)明的仿組蛋白基因載體具有很好的細(xì)胞穿透功能，仿組蛋白基因載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率高且細(xì)胞毒性低，為疾病的基因治療提供了一種有效的手段。
【IPC分類】A61P35/00, A61P25/00, A61P3/00, C08G69/42, A61K48/00, C12N15/87, A61K47/34
【公開號(hào)】CN105063090
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510471422
【發(fā)明人】姜虎林, 崔朋飛, 邢磊, 莊婉茹
【申請(qǐng)人】中國(guó)藥科大學(xué)
【公開日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2015年8月4日