一種調(diào)節(jié)性表達目的基因的載體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于基因治療的表達載體，屬于可調(diào)控表達領(lǐng)域，具體涉及一種調(diào)節(jié) 性表達目的基因的載體及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 膽固醇是生物膜的重要組成成分之一，在許多生命過程中發(fā)揮著重要作用。但 血液中高水平的膽固醇會導(dǎo)致動脈粥樣硬化、冠心病等嚴重疾病，早發(fā)動脈粥樣硬化、冠 心病是家族性高膽固醇血癥（familial hypercholesterolemia, FH)的重要表現(xiàn)（Van Craeyveld E 等，Curr Pharm Des，17(24) :2575-2591 (2011))〇
[0003] 血液中70%的膽固醇由低密度脂蛋白（low-density lipoprotein, LDL)和極低 密度脂蛋白（very low-density lipoprotein, VLDL)攜帶（張銳，國外醫(yī)學(xué)，老年醫(yī)學(xué)分 冊，30(1) :29-33(2009))。血液中的LDL的含量對血液中膽固醇的代謝有重要影響。
[0004] 肝細胞是代謝LDL的主要細胞，也是唯一能夠排泄膽固醇的細胞。肝臟內(nèi) 的低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor, LDLr)的活性對血楽中 LDL水平起到最主要的調(diào)節(jié)作用，LDLR基因的轉(zhuǎn)錄受固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（Sterol regulatory element binding protein, SREBP)通路調(diào)節(jié)（柳童斐等，中國細胞生物學(xué)學(xué) 報，35(4) :401-409, (2013))。
[0005] SREBP是一種屬于基本-螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈 (basic-helix-loop-helix-leucine zipper, bHLHZ-ip)家方矣的轉(zhuǎn)錄因子（Yokoyama et al.，Cell 75:187-197(1993))，在哺乳動物細胞內(nèi)有 3 個成員：SREBP-la、SREBP-lc 和 SREBP-2。它們對不同的靶基因有不同的選擇性，其中主要激活LDL基因的是SREBP-2。
[0006] SREBP通路的機理是：當細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的膽固醇處于高水平時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白 SREBP裂解激活蛋白（SREBP cleavage activating protein, SCAP)的固醇敏感結(jié)構(gòu)域 (sterol sensing domain, SSD)將會結(jié)合膽固醇，導(dǎo)致SCAP構(gòu)象發(fā)生改變，SCAP會結(jié)合內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)膜蛋白胰島素誘導(dǎo)的基因 （insulin induced gene, Insig)，形成SREBP-2/SCAP/Insig 復(fù)合物并保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，導(dǎo)致膽固醇的合成和代謝被阻斷，血漿中的低密度脂蛋白不會 被代謝；當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的膽固醇處于低水平時，SCAP從Insig解離，SREBP-2/SCAP從內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 膜遷移到高爾基體，細胞核中的核SREBP-2 (SREBP-2n)增加，SREBP-2n特異性結(jié)合LDLR基 因啟動子中的膽固醇調(diào)節(jié)元件（sterol regulatory element, SRE)，從而促進LDLR基因的 轉(zhuǎn)錄，進而促使血楽中的低密度脂蛋白通過LDLr路徑進行代謝（Kassim SH等，Hum Gene Ther，24 (1):19-26 (2013) ;Sudhof TC 等，J Biol Chem，262(22):10773-10779(1987); Kong WJ 等，J Mol Med(Berl)，84(l):29_36(2006) ;RadhakrishnanA 等，Proc Natl Acad Sci U S A, 104(16):6511-6518(2007) ;Sun LP 等，Proc Natl Acad Sci U S A,104 (16):6519-6526(2007))〇
[0007] SREBP除了通過SREBP通路對LDLr的表達進行調(diào)節(jié)，還能對其他膽固醇或脂肪酸 合成途徑中的酶進行調(diào)節(jié)。研究表明，在轉(zhuǎn)錄水平上，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶 (3-hydroxy-3_methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGCR)mRNA 含量主要受到 SREBP 的調(diào)控。HMGCR是膽固醇合成的限速酶，SREBP通路與HMGCR降解通路是膽固醇代謝的兩個 主要負反饋調(diào)控機制（柳童斐等，中國細胞生物學(xué)學(xué)報，35(4) :401-409, (2013))。SREBP 對HMGCR的調(diào)節(jié)也與膽固醇調(diào)節(jié)元件SRE有關(guān)，SRE為基因啟動子上一個約10bp的順式 作用元件，SRE不僅存在于LDLR基因啟動子中，在某些編碼膽固醇或脂肪酸合成途徑中酶 的基因啟動子中，比如HMGCR基因和乙酰輔酶A合成酶基因的啟動子中也有SRE的存在。 SREBP通過SRE調(diào)節(jié)LDLR基因的轉(zhuǎn)錄或其他酶基因的轉(zhuǎn)錄，進而調(diào)節(jié)膽固醇或脂肪酸的代 謝（Rawson et al.，Mol. Cell. Biol. 4:631-640(2003))。
[0008] 目前，針對HMGCR降解通路的藥物有HMGCR抑制劑（如他汀類藥物statins)，這 種藥物治療雖然能有效降低血漿中50%的膽固醇，但必須終身服用以維持治療效果（Van Craeyveld E 等，Curr Pharm Des, 2011，17(24) :2575-2591 ;Rahalkar A R等，Mol Genet Metab，2008, 93 (3) : 282-294 ;Kassim SH 等，Hum Gene Ther，24 (1) : 19-26 (2013)) 〇
[0009] 另一方面，有報道從基因水平上針對SREBP通路進行了研究，Chen et al. (2000)采用AAV載體、CMV增強子、actin啟動子表達LDLR基因 （Chen SJ等，Mol Ther，2(3) :256-261 (2000))，降低了 40 %的膽固醇的含量。然而，這種非肝特異性表達對其 他細胞造成了殺傷。
[0010] Jacobs et al. (2008)采用AAV載體肝特異性啟動子antitrypsin以及apo E增 強子表達 LDLR 基因 （Kassim SH 等，Hum Gene Ther, 24 (1):19-26 (2013))，降低了 40-60 % 的膽固醇的含量。雖然使用了組織特異性啟動子，但這種不帶膽固醇調(diào)節(jié)元件SRE的表達 方式，對膽固醇的含量高低的反饋調(diào)節(jié)不明顯，目的基因的表達較為恒定，不能起到調(diào)節(jié)膽 固醇代謝的作用，難以達到長期治療的效果。
[0011] 因此，有必要提供一種肝臟特異地、調(diào)節(jié)性地表達目的基因的載體及其制備方法 和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 為解決上述問題，本發(fā)明第一方面提供了一種調(diào)節(jié)性表達目的基因的載體，所述 調(diào)節(jié)性表達目的基因的載體包含目的基因表達盒，所述目的基因表達盒包含：肝特異性啟 動子、膽固醇調(diào)節(jié)元件和目的基因，所述膽固醇調(diào)節(jié)元件、肝特異性啟動子與目的基因可操 作地連接。
[0013] 優(yōu)選地，所述目的基因為蛋白質(zhì)的編碼基因或小分子RNA的編碼基因。
[0014] 優(yōu)選地，所述肝特異性啟動子為磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶啟動子、α -I-抗胰蛋白 酶啟動子、甲狀腺激素結(jié)合球蛋白啟動子、α -甲胎蛋白啟動子、醇脫氫酶啟動子、IGF-II 啟動子、因子VIII啟動子、HBV基礎(chǔ)核心蛋白啟動子、HBV前s2蛋白啟動子、甲狀腺素-結(jié) 合球蛋白啟動子、HCR-ApOCII的雜合啟動子、HCR-hAAT雜合啟動子、與小鼠白蛋白基因的 增強子元件結(jié)合的AAT啟動子、載脂蛋白E啟動子、低密度脂蛋白啟動子、丙酮酸激酶啟動 子、卵磷脂-膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶啟動子、載脂蛋白Η啟動子、鐵傳遞蛋白啟動子、甲狀腺素 運載蛋白啟動子、α-纖維蛋白原及0_纖維蛋白原的啟動子、α-Ι-抗糜蛋白酶啟動子、 a -2-HS糖蛋白啟動子、觸珠蛋白啟動子、血漿銅藍蛋白啟動子、血纖維蛋白溶酶原啟動子、 補體蛋白啟動子、補體C3激活子的啟動子、血液結(jié)合素啟動子及α-I-酸性糖蛋白啟動子。
[0015] 優(yōu)選地，所述膽固醇調(diào)節(jié)元件為基因的啟動子中的順式作用元件，所述基因包括 膽固醇合成途徑中或脂肪酸合成途徑中酶的編碼基因或受體蛋白的編碼基因。
[0016] 優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)性表達目的基因的載體還包含Kozak序列和肝特異性定位控制 元件中的至少一種。
[0017] 優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)性表達目的基因的載體不含標準質(zhì)粒的骨架DNA序列。
[0018] 優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)性表達目的基因的載體為微環(huán)DNA。
[0019] 本發(fā)明第二方面提供了一種調(diào)節(jié)性表達目的基因的載體的制備方法，包括：
[0020] 將肝特異性啟動子、膽固醇調(diào)節(jié)元件和目的基因插入載體的多克隆位點，得到所 述調(diào)節(jié)性表達目的基因的載體，所述調(diào)節(jié)性表達目的基因的載體包含目的基因表達盒，所 述目的基因表達盒包含：肝特異性啟動子、膽固醇調(diào)節(jié)元件和目的基因，所述膽固醇調(diào)節(jié)元 件、肝特異性啟動子與目的基因可操作地連接。
[0021] 優(yōu)選地，所述載體為病毒載體、原核質(zhì)粒載體或真核質(zhì)粒載體。
[0022] 優(yōu)選地，所述載體為微環(huán)DNA空質(zhì)粒，所述調(diào)節(jié)性表達目的基因的載體為微環(huán)DNA 母質(zhì)粒，所述微環(huán)DNA母質(zhì)粒經(jīng)過位點特異性重組后得到不含標準質(zhì)粒的骨架DNA序列的 調(diào)節(jié)性表達目的基因的載體，所得不含標準質(zhì)粒的骨架DNA序列的調(diào)節(jié)性表達目的基因的 載體包含目的基因表達盒，所述目的基因表達盒包含：肝特異性啟動子、膽固醇調(diào)節(jié)元件和 目的基因，所述膽固醇調(diào)節(jié)元件、肝特異性啟動子與目的基因可操作地連接。
[0023] 優(yōu)選地，所述不含標準質(zhì)粒的骨架DNA序列的調(diào)節(jié)性表達目的基因的載體為微環(huán) DNA。
[0024] 優(yōu)選地，所述目的基因為蛋白質(zhì)的編碼基因或小分子RNA的編碼基因。
[0025] 優(yōu)選地，所述肝特異性啟動子為磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶啟動子、α -I-抗胰蛋白 酶啟動子、甲狀腺激素結(jié)合球蛋白啟動子、α -甲胎蛋白啟動子、醇脫氫酶啟動子、IGF-II 啟動子、因子VIII啟動子、HBV基礎(chǔ)核心蛋白啟動子、HBV前s2蛋白啟動子、甲狀腺素-結(jié) 合球蛋白啟動子、HCR-ApOCII的雜合啟動子、HCR-hAAT雜合啟動子、與小鼠白蛋白基因的 增強子元件結(jié)合的AAT啟動子、載脂蛋白E啟動子、低密度脂蛋白啟動子、丙酮酸激酶啟動 子、卵磷脂-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶啟動子、載脂蛋白Η啟動子、鐵傳遞蛋白啟動子、甲狀腺素 運載蛋白啟動子、α-纖維蛋白原及0_纖維蛋白原的啟動子、α-Ι-抗糜蛋白酶啟動子、 a -2-HS糖蛋白啟動子、觸珠蛋白啟動子、血漿銅藍蛋白啟動子、血纖維蛋白溶酶原啟動子、 補體蛋白啟動子、補體C3激活子的啟動子、血液結(jié)合素啟動子及a-ι-酸性糖蛋白啟動子。
[0026] 優(yōu)選地，所述膽固醇調(diào)節(jié)元件為基因的啟動子中的順式作用元件，所述基因包括 膽固醇合成途徑中或脂肪酸合成途徑中酶的編碼基因或受體蛋白的編碼基因。
[0027] 優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)性表達目的基因的載體還包含Kozak序列和肝特異性定位控制 元件中的至少一種。
[0028] 優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)性表達目的基因的載體不含標準質(zhì)粒的骨架DNA序列。
[0029] 本發(fā)明第三方面提供了一種調(diào)節(jié)性表達目的基因的載體在制備治療膽固醇代謝 異常疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0030] 本發(fā)明第四方面提供了一種采用調(diào)節(jié)性表達目的基因的載體治療膽固醇代謝異 常疾病的方法，包括如下步驟：
[0031] S01)制備調(diào)節(jié)性表達目的基因的載體；
[0032] S02)將所述調(diào)節(jié)性表達目的基因的載體按下述任一步驟操作：
[0033] a)將所述調(diào)節(jié)性表達目的基因的載體單獨用于基因治療；
[0034] b)將所述調(diào)節(jié)性表達目的基因的載體與化療、放療、手術(shù)、生物治療、免疫治療中 的一種或幾種聯(lián)合用于基因治療；
[0035] c)采用體內(nèi)靶向投遞的方式將所述調(diào)節(jié)性表達目的基因的載體直接投遞到患者 體內(nèi)進行治療；
[0036] d)先通過體外轉(zhuǎn)染技術(shù)將所述調(diào)節(jié)性表達目的基因的載體轉(zhuǎn)染免疫效應(yīng)細胞，然 后將所述轉(zhuǎn)染有調(diào)節(jié)性表達目的基因的載體的免疫效應(yīng)細胞輸回患者體內(nèi)實施治療。
[0037] 優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)性表達目的基因的載體為微環(huán)DNA載體。
[0038] 本發(fā)明提供了的調(diào)節(jié)性表達目的基因的載體及其制備方法和應(yīng)用具有如下有益 效果：
[0039] 本發(fā)明提供的調(diào)節(jié)性表達目的基因的載體同時具有肝特異性啟動子和膽固醇調(diào) 節(jié)元件SRE兩種調(diào)控元件，由于肝臟是膽固醇代謝的重要器官，肝特異性啟動子有利于調(diào) 節(jié)性表達目的基因的載體的組織特異性表達，提高基因治療的靶向性；此外，本發(fā)明采用的 膽固醇調(diào)節(jié)元件SRE能充分利用細胞天然的膽固醇反饋調(diào)節(jié)機制，增強了細胞主動、合適 地對膽固醇的代謝進行調(diào)節(jié)的內(nèi)在能力。
【附圖說明】
[0040] 圖1為本發(fā)明實施例提供的ZY781. bpA空載體的質(zhì)粒圖譜；
[0041] 圖2為本發(fā)明實施例提供的親本質(zhì)粒ZY781. PLDLR. LDLR. bpA的質(zhì)粒圖譜；
[0042] 圖3為本發(fā)明實施例提供的親本質(zhì)粒ZY781. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA的質(zhì)粒圖 譜；
[0043] 圖4為本發(fā)明實施例提供的親本質(zhì)粒ZY781. PLDLR. UTR. LDLR. bpA的質(zhì)粒圖譜；
[0044] 圖5為本發(fā)明實施例提供的親本質(zhì)粒ZY781. Enhancer. PLDLR. LDLR. bpA的質(zhì)粒圖 譜；
[0045] 圖6為本發(fā)明實施例提供的親本質(zhì)粒ZY781. Enhancer. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA的 質(zhì)粒圖譜；
[0046] 圖7為本發(fā)明實施例提供的親本質(zhì)粒ZY781. Enhancer. ApoE. LDLR. bpA的質(zhì)粒圖 譜；
[0047] 圖8為本發(fā)明實施例提供的親本質(zhì)粒ZY781. Enhancer. ApoE. Kozak. LDLR. bpA的 質(zhì)粒圖譜；
[0048] ZY781. ApoE. bpA (本課題組構(gòu)建保存）；
[0049] 圖9~圖25為本發(fā)明實施例提供的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染Η印G2細胞后LDLR基因的表達情 況（其中，圖9~圖16分別為ZY78L bpA空載體 Kozak. LDLR. bpA> MC. PLDLR. UTR. LDLR. bpA> MC. Enhancer. PLDLR. LDLR. bpA> MC. Enhancer. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA、MC. Enhancer. ApoE. LDLR. bpA 和 MC. Enhancer. ApoE. Kozak. LDLR. bpAA轉(zhuǎn)染H印G2細胞后，對各組細胞中LDLR基因的mRNA進行RT-PCR結(jié)果，在圖9~圖16 中，每個圖中柱-1為對照組，柱-2為膽固醇組，柱-3為他汀組，表示P〈0. 05, "**"表 示 Ρ〈0· 01 ;
[0050] 圖17包括圖a~圖h，圖a~圖h分別為ZY781. bpA空載體、微環(huán)DNA MC. PLDLR. LDLR. bpA、MC. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA、MC. PLDLR. UTR. LDLR. bpA、MC. Enhancer. PLDLR. LDLR. bpA、MC. Enhancer. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA、MC. Enhancer. ApoE. LDLR. bpA 和 MC. Enhancer. ApoE. Kozak. LDLR. bpAA轉(zhuǎn)染HepG2細胞后，米用突光顯微鏡觀察各組細胞中 LDLr分布情況的結(jié)果；
[0051] 圖 18 ~圖 25 分別為 ZY781. bpA 空載體 Kozak. LDLR. bpA> MC. PLDLR. UTR. LDLR. bpA> MC. Enhancer. PLDLR. LDLR. bpA> MC. Enhancer. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA、MC. Enhancer. ApoE. LDLR. bpA 和 MC. Enhancer. ApoE. Kozak. LDLR. bpAA轉(zhuǎn)染H印G2細胞后，各組細胞中熒光強度的相對值，在圖18~圖25中，每個圖中柱-1 為對照組，柱-2為膽固醇組，柱-3為他汀組，表示P〈0. 05, 表示P〈0. 01 ;);
[0052] 圖26~圖34為本發(fā)明實施例提供的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染HepG2細胞后LDLR基因的表 達情況（其中，圖26包括圖a~圖h，圖a~圖h分別為ZY781.bpA空載體、微環(huán)DNA MC. PLDLR. LDLR. bpA, MC. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA, MC. PLDLR. UTR. LDLR. bpA, MC. Enhancer. PLDLR. LDLR. bpA、MC. Enhancer. PLDLR. Kozak. LDLR. bpA、MC. Enhancer. ApoE. LDLR. bpA 和 MC. Enhancer. ApoE.