專利名稱:一種檢測K562單細胞表達p16基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域,涉及腫瘤相關(guān)基因的檢測方法,尤其涉及利用PCR技術(shù)檢測基因表達的方法。
背景技術(shù):
在人類基因組測序工作完成后,生命科學的研究已從基因序列分析進入功能基因組學的研究。從分子水平探討細胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)的產(chǎn)生及其對基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)控的作用,揭示特定基因表達與人體生長、發(fā)育、衰老的關(guān)系,揭示特定基因缺失或異常表達與疾病發(fā)生之間的關(guān)系,成為生物、醫(yī)學領(lǐng)域研究的熱點。
P16基因是重要的抗癌基因,定位于9p21上,全長8.5kb,由2個內(nèi)含子間隔3個外顯子組成,編碼產(chǎn)物是16KD的蛋白。P16是細胞周期蛋白依賴性激酶——CDK4的抑制因子,參與細胞周期的調(diào)節(jié),與腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系。當P16基因正常表達時,可以抑制Cdk4活性,最終阻止細胞進入S期。一旦P16基因因缺失,突變等原因?qū)е鹿δ苋笔?,則不能抑制CDK4,最終導致細胞進入惡性增殖,加速腫瘤發(fā)生。
P16基因在多種惡性腫瘤中有較高的失活率,失活的主要方式為基因缺失、點突變、移碼、基因重排及甲基化等。p16基因純合缺失常見于各種腫瘤,例如,食道癌約為92.3%,急性淋巴細胞性白血病(ALL)中約為40%,間皮瘤61.9%,胰腺癌40.5%,卵巢癌22%。P16基因突變與腫瘤的發(fā)生也有著密切的關(guān)系,在肺癌、黑色素瘤等腫瘤中,都存在p16基因突變,包括無義突變,錯義突變,剪接供體位點突變等。
P16基因參與了各種組織的腫瘤形成,因此檢測P16基因的突變與缺失,研究P16基因異常與腫瘤的分期、分級的相關(guān)性,對腫瘤臨床治療有重要意義。同樣,通過檢測P16基因表達,篩選可以激活P16基因的藥物,在抗腫瘤藥物開發(fā)中具有重要意義。許多榮等在《臨床研究》1999;vol 18(4),上,探討了p16基因純合缺失與急性淋巴細胞白血病的關(guān)系及其臨床意義,采用PCR方法檢測P16基因的有無;芮紅兵在《中國實驗血液學研究》2002;10(5)研究了野生型P16和P53抑癌基因共轉(zhuǎn)染對K562細胞增殖的抑制作用,采用RT-PCR方法檢測了P16基因的表達。
然而,通常采用的PCR方法,檢測的對象是組織或多個細胞,采用的模板是從組織或多個細胞制備的DNA或RNA,在檢測的靈敏度、特異性等方面均有缺陷,尤其是,檢測結(jié)果不能反映各細胞之間的差異。
本領(lǐng)域迫切需要準確、靈敏,能夠檢測單個細胞P16基因的方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測K562單細胞表達p16基因的方法,以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足;本發(fā)明的方法包括如下步驟采用極限稀釋法(limiting dilution)制備單細胞懸液,將含有單個細胞的懸液置于PCR管中;加入細胞裂解液裂解細胞;裂解后加入擴增p16全長基因的引物和RT-PCR試劑;進行RT-PCR擴增;擴增產(chǎn)物進行測序;擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳。
用于檢測p16基因表達的引物序列為上游引物GAATTCGGCGGTGAGGGGG下游引物GGATCCCTGAGGGACCTTC在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方案中采用極限稀釋法(limiting dilution)制備單細胞懸液,將含有單個細胞的懸液置于PCR管中;加入細胞裂解液,冰浴中處理5min;裂解后加入p16特異性擴增引物和RT-PCR試劑;37℃逆轉(zhuǎn)錄1小時,94℃預變性5分鐘,再以93℃30s,55℃30S,72℃50S,35個循環(huán),循環(huán)結(jié)束后延伸8min;擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測。
本發(fā)明的有益效果主要表現(xiàn)在本發(fā)明的方法能夠檢測單一細胞p16基因及其特異性表達情況。
RT-PCR擴增中mRNA模板的制備是一項技術(shù)性很強的工作,在抽提工作中,容易造成模板降解,導致實驗失敗。本發(fā)明通過單細胞原位基因擴增,避免模板降解所致的問題。與多細胞RT-PCR方法相比,本發(fā)明的方法具有更好的靈敏度。
圖1、PCR擴增管中的單細胞和多細胞圖(左為單細胞100X,中為多細胞100X,右為1μl細胞懸液40X)。
圖2、p16基因表達的時間-效應(yīng)圖。
圖3為p16電泳LightFrame分析圖。
具體實施例方式
實施例1、K562白血病細胞的ABPS誘導培養(yǎng)凋亡基因的誘導取對數(shù)增殖期的K562白血病細胞系(上海細胞所細胞庫購進)細胞,計數(shù)并將5×105/ml的細胞、10%胎牛血清(Fetus Cattle Serum,F(xiàn)CS,Gibco.lot.No.1165723)RPMI1640(Gibco)培養(yǎng)液和已知具有誘導凋亡基因表達的巴西蘑菇多糖(Agaricus Blazei Polysaccharide,ABPS)10μg/ml充分混勻后,加于96孔培養(yǎng)板(costar)中,每孔100μl,設(shè)8個復孔。樣品制好后,置37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。進行誘導p16基因表達。
實施例2、單細胞RT-PCR檢測單個細胞的獲得實施例1誘導培養(yǎng)的細胞,采用極限釋釋法分別于誘導基因表達的24h、48h、72h和96h時,取出培養(yǎng)的細胞進行p16基因的檢測。制備單細胞時,先將實驗孔細胞在無菌條件下取出,加于細胞計數(shù)板中,計數(shù),視細胞量,用PBS將細胞稀釋至約103/ml,然后取出1μl細胞懸液,加于0.2ml的PCR管中,倒置光顯微鏡下觀察,選擇細胞形態(tài)完整的單個細胞進行RT-PCR。見圖1。(左為單細胞100X,中為多細胞100X,右為1μl細胞懸液40X)。
RT-PCR在PCR管中加入細胞裂解液
[2],離心,置冰浴中靜置處理細胞5min,然后4℃12000r/min離心5min,旋即移至超凈工作臺中,加入p16基因特異性擴增藥物,按華美公司酶混合物試劑盒說明分別加入RT-PCR的各種試劑,離心,PCR儀進行基因擴增。擴增條件為37℃逆轉(zhuǎn)錄1小時,94℃預變性5分鐘,再以93℃30s 55℃30S,72℃50S循環(huán)擴增35次,最后終延伸8min。
擴增結(jié)果進行凝膠電泳,結(jié)果見圖2。
第1泳道為marker,2,4,6,8為單細胞-時效PCR擴增條帶,分別為ABPS誘導后24h,48h,72h和96h的擴增結(jié)果;3,5,7,9為多細胞時-效PCR擴增的條帶,分別為ABPS誘導后24h,48h,72h和96h的擴增結(jié)果。
p16基因在誘導的24時小就有表達,72小時表達達到高峰,96小時下降。
實施例3、多細胞RT-PCR檢測實施例1誘導培養(yǎng)的細胞,制備細胞懸液,調(diào)整細胞濃度到1.5*105/ml細胞作為多細胞對照組。常規(guī)方法制備mRNA模板......
在PCR管中加入模板1ul,按實施例2的方法進行RT-PCR擴增。凝膠電泳檢測,結(jié)果圖2。
1泳道為marker,2,4,6,8為單細胞-時效PCR擴增條帶,分別為ABPS誘導后24h,48h,72h和96h的擴增結(jié)果;3,5,7,9為多細胞時-效PCR擴增的條帶,分別為ABPS誘導后24h,48h,72h和96h的擴增結(jié)果。
p16基因在誘導的24時小就有表達,72小時表達達到高峰,96小時下降。
p16電泳LightFrame分析見圖3。
權(quán)利要求
1.一種檢測K562單細胞表達p16基因的方法,其特征在于,包括如下步驟采用極限稀釋法制備單細胞懸液,將含有單個細胞的懸液置于PCR管中;加入細胞裂解液裂解細胞;裂解后加入p16特異性擴增引物和RT-PCR試劑;進行RT-PCR擴增;擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測。
2.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所說的p16基因特異性引物為上游引物GAA TTC GGC GGT GAG GGG G下游引物GGA TCC CTG AGG GAC CTT C。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法,其特征在于,包括如下步驟采用極限稀釋法制備單細胞懸液,將含有單個細胞的懸液置于PCR管中;加入細胞裂解液,冰浴中處理5min;裂解后加入p16特異性擴增引物和RT-PCR試劑;RT-PCR擴增37℃逆轉(zhuǎn)錄1小時,94℃預變性5分鐘,再以93℃30s,55℃30S,72℃50S,35個循環(huán),循環(huán)結(jié)束后延伸8分鐘;擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測K562單細胞表達p16基因表達的方法,包括如下步驟采用極限稀釋法制備單細胞懸液,將含有單個細胞的懸液置于PCR管中;加入細胞裂解液裂解細胞;裂解后加入擴增p16全長基因的引物和RT-PCR試劑;進行RT-PCR擴增;擴增產(chǎn)物進行測序;擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳。本發(fā)明通過單細胞原位基因擴增,避免模板降解所致的問題。與多細胞RT-PCR方法相比,本發(fā)明的方法具有更好的靈敏度。
文檔編號C12Q1/68GK1861806SQ200510025810
公開日2006年11月15日 申請日期2005年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月13日
發(fā)明者李興玉, 李靜, 丁煥平, 忻茜 申請人:上海師范大學