專利名稱：腎素基因與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地涉及人腎素基因(Renin，REN)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)及其與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性。本發(fā)明還涉及檢測(cè)這些SNP的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
原發(fā)性高血壓(essential hypertension，EH)是最常見(jiàn)的心血管疾病，其發(fā)病率逐年上升，并可引起嚴(yán)重的心、腦、腎并發(fā)癥，是腦卒中和冠心病的主要危險(xiǎn)因素。EH是一種由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用而發(fā)病的多基因病，尋找EH相關(guān)基因進(jìn)而闡明高血壓發(fā)病的遺傳機(jī)制已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)(HarrapSB.Hypertensiongenes versus environment.Lancet，1994，344169-171)。
腎素-血管緊張素(RAS)系統(tǒng)是體內(nèi)調(diào)節(jié)血壓和水鹽代謝的重要系統(tǒng)，而起著推動(dòng)作用的是腎素的釋放，是由腎灌注減低或腎小管鈉濃度減少引起。腎素主要由腎小球旁細(xì)胞分泌，釋放入肺循環(huán)中的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的作用轉(zhuǎn)化為血管緊張素II(AngII)。AngII的作用為直接使小動(dòng)脈平滑肌收縮，外周阻力增加；使交感神經(jīng)沖動(dòng)發(fā)放增加；刺激腎上腺皮質(zhì)球狀帶，使醛固酮分泌增加，從而使腎小管遠(yuǎn)端集合管鈉再加強(qiáng)，導(dǎo)致體內(nèi)水與鈉潴留。但目前沒(méi)有證實(shí)REN基因與原發(fā)性高血壓相關(guān)性的報(bào)道，更沒(méi)有證實(shí)REN基因的SNP與原發(fā)性高血壓相關(guān)性的報(bào)道。
綜上所述，為了最終實(shí)現(xiàn)治療高血壓，本領(lǐng)域迫切需要尋找原發(fā)性高血壓易感基因，并開(kāi)發(fā)檢測(cè)原發(fā)性高血壓的方法、試劑盒，以及相關(guān)的治療藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種輔助性診斷(尤其是早期診斷)高血壓等高血壓的方法及檢測(cè)試劑盒。
本發(fā)明的另一目的是提供一種新的治療高血壓的方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種對(duì)個(gè)體的高血壓易感性進(jìn)行輔助性診斷的方法，它包括步驟
檢測(cè)該個(gè)體的REN基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的REN基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個(gè)體患高血壓的可能性高于正常人群。
在另一優(yōu)選例中，檢測(cè)的是REN的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常REN核苷酸序列比較差異。
在另一優(yōu)選例中，所述的差異是選自下組的單核苷酸多態(tài)性12194位G→T；12377位T→C；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO1。
在另一優(yōu)選例中，所述的差異是12194位G→T，更佳地在該12194位上的兩個(gè)等位基因的核苷酸都是T(即12194位為T(mén)T型)。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測(cè)樣品是否存在REN基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，包括步驟(a)用REN基因特異性引物擴(kuò)增樣品的REN基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；和(b)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在選自下組的單核苷酸多態(tài)性12194位G→T；12377位T→C；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO1。
在另一優(yōu)選例中，所述的單核苷酸多態(tài)性是12194位G→T。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的REN蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。
還提供了一種REN基因和蛋白的用途，它們被用于(a)制備輔助性檢測(cè)的試劑；或(b)制備治療高血壓的藥物。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種用于輔助性檢測(cè)高血壓的試劑盒，它包括特異性擴(kuò)增REN基因或轉(zhuǎn)錄本的引物和說(shuō)明書(shū)。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有選自下組的試劑(a)與突變部位結(jié)合的探針；(b)識(shí)別突變位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶。
在另一優(yōu)選例中，所述的突變選自12194位G→T；12377位T→C；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO1。
更佳地，所述的單核苷酸多態(tài)性是12194位G→T。


圖1顯示了REN的一種SNP圖像(以SNP05為例)的測(cè)序結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)多年研究，首次發(fā)現(xiàn)和證明了REN基因與高血壓密切相關(guān)，而且發(fā)現(xiàn)了它的新功能REN的改變將導(dǎo)致高血壓，其中關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，在REN第12194位的SNP05(G/T)在病例和對(duì)照組中的分布存在顯著性差異(P＜0.05)?；诖税l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了利用檢測(cè)REN基因、轉(zhuǎn)錄本或蛋白是否存在突變，從而為診斷高血壓提供輔助性或早期參考指標(biāo)的方法和試劑盒。
REN基因的總長(zhǎng)度為13518bp。其詳細(xì)序列可參見(jiàn)網(wǎng)址http://genome.ucsc.edu/或http://www.ncbi.nlm.nih.gov/(例如http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks？org＝human&position＝BC047752)，或參見(jiàn)SEQ ID NO1。
另外，與該SNP05連鎖的核苷酸變化很可能改變氨基酸編碼進(jìn)而可能影響基因表達(dá)產(chǎn)物的功能。因此，基于本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，REN蛋白或多肽有多方面的潛在用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療REN蛋白功能低下或喪失所致的疾病(如高血壓)，和用于篩選促進(jìn)REN蛋白功能的物質(zhì)，如抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組人REN蛋白篩選多肽庫(kù)可用于尋找有治療價(jià)值的能刺激人REN蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)人REN DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人REN基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人REN基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人REN蛋白的分子，也包括那些并不影響人REN蛋白功能的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人REN基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人REN蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來(lái)免疫動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)抗體。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人REN蛋白功能的抗體以及不影響人REN蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人REN基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過(guò)常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人REN基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲(chóng)細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而獲得。
抗人REN蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測(cè)活檢標(biāo)本中的人REN蛋白。一種優(yōu)選的抗REN抗體是不識(shí)別正常REN但識(shí)別突變REN的抗體，或者識(shí)別正常REN但不識(shí)別突變REN的抗體。利用該抗體對(duì)正常和異常REN蛋白的特異性差異，可以方便地進(jìn)行蛋白質(zhì)水平的高血壓易感性檢測(cè)。
利用本發(fā)明REN蛋白，通過(guò)各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與REN蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如抑制劑、激動(dòng)劑或拮抗劑等。
本發(fā)明REN蛋白及其抗體、抑制劑、激動(dòng)劑、拮抗劑等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、或皮下給藥。
正常的REN多肽可直接用于疾病治療，例如，用于高血壓治療。在使用本發(fā)明REN蛋白時(shí)，還可同時(shí)使用其他治療高血壓的藥劑。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明REN蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約0.1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的REN蛋白或其拮抗劑、激動(dòng)劑施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約0.1微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過(guò)約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0.1微克/千克體重-約100微克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
人REN蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于REN蛋白的無(wú)表達(dá)或異常/無(wú)活性的REN蛋白的表達(dá)所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常。構(gòu)建攜帶REN基因的重組病毒載體的方法可見(jiàn)于已有文獻(xiàn)(Sambrook，et al.)。另外重組人REN基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過(guò)載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測(cè)人REN蛋白水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測(cè)定和放射免疫測(cè)定。
一種檢測(cè)檢測(cè)樣品中是否存在REN蛋白的方法是利用REN蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，它包括將樣品與REN蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在REN蛋白。
REN蛋白的多聚核苷酸可用于REN蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，REN蛋白的多聚核苷酸可用于檢測(cè)REN蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下REN蛋白的異常表達(dá)。如REN DNA序列可用于對(duì)活檢標(biāo)本的雜交以判斷REN蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開(kāi)的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用REN蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測(cè)REN蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測(cè)REN基因的突變也可用于診斷高血壓。檢測(cè)可以針對(duì)cDNA，也可針對(duì)基因組DNA。REN蛋白突變的形式包括與正常野生型REN DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。一類優(yōu)選的突變是表2所示的SNP?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測(cè)突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無(wú)突變。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于首次用實(shí)驗(yàn)證實(shí)了REN的改變與高血壓的密切相關(guān)性，進(jìn)而提供了輔助性診斷高血壓(或易感性)的方法和試劑盒。本發(fā)明可以為臨床診斷(尤其是早期診斷)高血壓提供極為有價(jià)值的輔助性參考指標(biāo)，從而有利于實(shí)現(xiàn)早診斷、早預(yù)防、早得益。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例11對(duì)象與方法1.1研究對(duì)象1.1.1中國(guó)人SNP發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)樣本樣本為來(lái)自24個(gè)核心漢族高血壓家系、無(wú)親緣關(guān)系的24例原發(fā)性高血壓病人。
1.1.2SNP分型和關(guān)聯(lián)分析研究樣本所有受試者均為漢族。原發(fā)性高血壓組(EH組)和正常血壓組(NT組)各300例，均來(lái)自中國(guó)上海地區(qū)，彼此無(wú)親緣關(guān)系。EH組為上海市瑞金醫(yī)院高血壓科住院病人，均為漢族，無(wú)親緣關(guān)系。平均年齡為57.32±11.75歲。入選標(biāo)準(zhǔn)收縮壓140mmHg和/或舒張壓90mmHg，或正在接受抗高血壓藥物治療至少一年以上；在30歲之前或60歲以后發(fā)病者除外；臨床上除外繼發(fā)性高血壓，如原發(fā)性醛固酮增多癥、嗜鉻細(xì)胞瘤、腎性高血壓等。
NT組為上海地區(qū)40歲以上居民，均為漢族，無(wú)親緣關(guān)系。平均年齡56.39±6.45歲。收縮壓＜140mmHg且舒張壓＜90mmHg，無(wú)服用抗高血壓藥物史，排除肝、腎功能障礙、甲狀腺疾病、糖尿病、冠心病史。
1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1DNA提取常規(guī)酚-氯仿法提取外周血白細(xì)胞DNA，并標(biāo)化DNA濃度值至20ng/μl。
1.2.2PCR及測(cè)序引物的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中REN的基因組序列，應(yīng)用prime3軟件(美國(guó)麻省理工生物醫(yī)學(xué)白頭研究所，http://www-gonome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi)設(shè)計(jì)引物。具體引物如下表所示。
表1 引物序列表


1.2.3REN基因的調(diào)控區(qū)和編碼區(qū)分段體外擴(kuò)增以提取的DNA為模板，用Taq酶，在GeneAmp 9700 PCR儀上以Touchdown程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2分鐘，94℃變性30秒，63℃退火40秒，72℃延伸40秒，共10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度遞減0.5℃；以后94℃變性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸40秒，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。
1.2.4SNP的發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)PCR產(chǎn)物經(jīng)Resin樹(shù)脂純化后，用ABI-PRISMTM377DNA測(cè)序儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司appliedbiosystems(ABI))進(jìn)行熒光標(biāo)記末端終止法雙向測(cè)序，用Polyphred軟件(美國(guó)華盛頓大學(xué)http://droog.mbt.washington.edu/Polyphred.html)進(jìn)行序列的判讀和SNP確認(rèn)。
1.2.5SNP基因分型和關(guān)聯(lián)分析用直接單向測(cè)序法進(jìn)行SNP基因分型，即在300個(gè)高血壓病人和300個(gè)正常血壓對(duì)照組中進(jìn)行分型和關(guān)聯(lián)分析。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SNPs各基因型在病人和正常血壓對(duì)照中分布的比較采用R×C表χ2檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。
2.結(jié)果2.1REN基因SNP的發(fā)現(xiàn)和分布REN的基因共有9個(gè)外顯子，測(cè)序總長(zhǎng)度是5245bp，共發(fā)現(xiàn)7個(gè)SNP，包括啟動(dòng)子區(qū)4個(gè)，內(nèi)含子3個(gè)，其中內(nèi)含子區(qū)的1個(gè)(SNP05)是新發(fā)現(xiàn)的SNP。REN基因SNP分布情況見(jiàn)表2。測(cè)序確認(rèn)雜合子圖像見(jiàn)圖1。
表2 中國(guó)人REN基因SNP的種類及其分布

說(shuō)明(1)表中第一列為SNP的名稱；第二列為SNP在REN基因序列中的位置；第三列為SNP所屬基因區(qū)域，Promoter為啟動(dòng)子區(qū)，Exon為外顯子區(qū)，Intron為內(nèi)含子區(qū)，3′UTR為3′末端非翻譯序列；第四列為在等位基因中SNP的兩個(gè)堿基；第五列為測(cè)序所用引物。
體外抗菌藥效實(shí)驗(yàn)主要按如下方法檢測(cè)(1)最小抑菌濃度(MIC)以MH肉湯在試管中分別將受試藥物(實(shí)施例2制備的注射用門(mén)冬氨酸阿奇霉素粉針劑)或?qū)φ账幬?注射用乳糖酸紅霉素)藥液倍比稀釋成不同濃度，加入等體積的1∶200稀釋的菌液，35℃培養(yǎng)16-20小時(shí)后讀取MIC值。200株實(shí)驗(yàn)菌的MIC結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)果表明，門(mén)冬氨酸阿奇霉素粉針劑對(duì)革蘭氏陽(yáng)性球菌，如葡萄球菌、鏈球菌和腸球菌等具有較好的抗菌活性；對(duì)部分革蘭氏陰性桿菌如肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌亦具有一定的抗菌活性。其抗菌活性較之對(duì)照藥強(qiáng)2～4倍(以重量mg進(jìn)行比較)。
表3 實(shí)驗(yàn)藥物對(duì)200株實(shí)驗(yàn)菌的MIC結(jié)果

*A為門(mén)冬氨酸阿奇霉素粉針，B為乳糖酸紅霉素(2)最低殺菌濃度(MBC)測(cè)定在讀取MIC結(jié)果時(shí)，自未見(jiàn)生長(zhǎng)的各管(共取出75株菌株)中分別取出0.1ml培養(yǎng)物置滅菌平皿中傾皿培養(yǎng)(35℃)18小時(shí)左右，以平皿上菌落數(shù)小于5的藥物最低濃度為MBC。75株實(shí)驗(yàn)菌的MIC和MBC結(jié)果見(jiàn)表4，結(jié)果表明門(mén)冬氨酸阿奇霉素粉針在高濃度時(shí)具有一定的殺菌活性，其MBC約為MIC的照分析，進(jìn)行它與高血壓間的相關(guān)性研究。研究表明該SNP的T等位基因在高血壓病例中的頻率為12％，顯著高于其在正常人中8％的頻率，兩者比較差異顯著(P＝0.01)。尤其是TT型個(gè)體，幾乎有70％都患有原發(fā)性高血壓。本發(fā)明提示REN基因變異與中國(guó)漢族人群原發(fā)性高血壓發(fā)生有關(guān)。
實(shí)施例2原發(fā)性高血壓易感性輔助檢測(cè)試劑盒制備一試劑盒，它含有名稱序列(5’→3’) 編號(hào) 濃度正向引物accactcaggaaggacatgc SEQ ID NO22 干粉20D反向引物cgtctcagcagacaaggagtcSEQ ID NO23 干粉20DPCR反應(yīng)液 含Taq酶dNTP鎂離子PCR反應(yīng)緩沖液抽取待檢測(cè)男性病人的血液3ml，使用常規(guī)方法(或使用特定的試劑盒)從血液中提取DNA。將高血壓檢測(cè)試劑盒中的PCR引物稀釋到1μmol/μl，以所提取的DNA為模板與所提供的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物純化后，用ABI-PRISMTM377DNA測(cè)序儀進(jìn)行熒光標(biāo)記末端終止法雙向測(cè)序，用Polyphred軟件進(jìn)行序列的判讀和SNP確認(rèn)。檢測(cè)結(jié)果圖1所示。其中，含C表示高血壓易感性高于正常人群。
用本實(shí)施例的試劑盒對(duì)近百例待測(cè)對(duì)象進(jìn)行了SNP12194的檢測(cè)，對(duì)于檢測(cè)發(fā)現(xiàn)存在12194位G→T的30位對(duì)象。對(duì)于具有TT型的5位個(gè)體再對(duì)其進(jìn)行血壓測(cè)量，結(jié)果證實(shí)其中有4位的血壓高于正常人。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
序列表<110>上海市高血壓研究所國(guó)家人類基因組南方研究中心<120>腎素基因與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性<130>052513<160>27<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>13518<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1caaaacagaa ccgccggtct ttgtaaaata ataattattc atttcacaaa agtgataatt60aaaagacttt aatagcaata cagaaagtta catgaatata aagacttaac ctttctaaag 120ctcagttttc ctaagtaatc aaaaacctga taaagataac aagaatgagg aattatcttg 180agaaaatgta aaatctttcc ttttattttt tgagacaggg tctcactctg tcatccaggc 240taaagtgcag tggcacaatc atagctcact acagccttga actcctggac tcaagtgatc 300ctcccgcctc agcctcccca gtagctaaga ctacaggcac gcaccaccac acccagctaa 360tttttttcag agatggggtc ttgctatatt gccctggctg gtcttgaacg agcttcaagt 420gagcgtgagc ctcctacctc atcctcccaa agcactagga ttacaggcat gagccactgt 480ttcccagcct aaaataattg tttcttaggc cagctaccaa aaacgcaaag aaaaactttc 540tgtagtgtga ttgcttcttc ttatgggaag cccatttaga taacctgtaa gtcaaacctg 600atgaaaacaa tacttgaatg taatcagaca cagaaagact gttcaaggct atgagtagct 660gagtccaagc tcgtatcact tgccacacaa cagccaataa gtctagagac aaggtattgt 720ggcaaggaaa gctaccttat tcagagaacc agaaaaccaa gaagatggtg gaccagcatc 780ataaagaacc atctgaagtc agcatgaacg ttaggctctt ctttatgtta agggaagggg 840aagaagaagg ggattgggat caagaggtga ctgatgacca cagacacctg ggtgccagca 900agggtctgag gacgttgtaa aacttctttt ttctaggtca ggtcacaatg ttcctataca 960tctttaacat aacattgtta tttgtctgta tatttcctta tctccttggg ggttagtttg 1020gggaaaggaa ctgttaccat tttttttaaa gttgaactgc aagctaaact cctataatta 1080gctggtctat gtacagagct aagcagaagc ttttagccta aaggataata cccctggggg 1140tcagaggcaa aatggagtca gtcatgctaa gtctccctcc actctctttc ttttttgaga 1200tggaatttca ctcttattgc ccaggccgga gtgcagtggc atgatctcag ctcactgcaa 1260cctccgcctc ctgggttcaa gcaattctct tgcctcagcc tcctgagtag ctgagattac 1320aggtgtccat caccacaccc agctaatttt tgtagtttag tggagatggg gtttcaccat 1380tgttggtcag gctggtctgg aactcctgac ctcaggtgat ctacccacct tggcctccca 1440aagtgctggg acaggtgtga gccaccatgc ctggcccctc tactcttata attaaaccag 1500ctgttgcttt tcctgccaag aaaccagtca tgaagattca cccatgttct agatgggaaa 1560actgggctgt agcctgggag aggccagtca gggacaaagc caaagttaat atagagaatg 1620gagcttccag ggtatagggg ttgggtctgg gctagggagc tggaaaccta ggttttacgc 1680ttgtcccagt tttgatgtta gccctgagca gtgctgtttc tcatcagcct ctgcctgctc 1740caggggtcac agggccaagc cagatagagg gctgctagcg tcactggaca caagattgct 1800ttcccacagc tgtccttcct ccagcccctc tgctccccat ccggaaacct gggtaccctt 1860cacccaccta gctctgtccc gcagtgagat ttattgctga ctgccctgcc atctacccca 1920gggtaataaa tcagggcaga gcagaattgc aatcacccca tgcatggagt gtataaaagg 1980ggaagggcta agggagccac agaacctcag tggatctcag agagagcccc agactgaggg 2040
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<210>11<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>11gactgaatga caccgcatgt 20<210>12<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>12tgggctaacg ttaaaggtgg t21<210>13<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>13tcctatacct gtcggggttt c21<210>14<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>14gacctagggc tttctttgct g21<210>15<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>15atcttcccct ctcccctaca t21<210>16<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>16ccaagaaacc cagtccttga t21<210>17<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)
<400>17ccccataggt actgctgctt t21<210>18<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>18tctgtaccct ggagcatgtg t21<210>19<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>19aatttgcaat agtgccttcc a21<210>20<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>20acagctggac taccctggaa c21<210>21<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>21ttaagaagtg gctgcatttg g21<210>22<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>22accactcagg aaggacatgc 20<210>23<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>23cgtctcagca gacaaggagt c21<210>24
<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>24cgcttgttca cctcacactc t21<210>25<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>25gtgacatgca cagccaagtt t21<210>26<211>19<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>26aaaactctcc ccctctgcc 19<210>27<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>27aaccctagtg aacccagatg c2權(quán)利要求
1.一種對(duì)個(gè)體的高血壓易感性進(jìn)行輔助性診斷的方法，其特征在于，它包括步驟檢測(cè)該個(gè)體的腎素REN基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的REN基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個(gè)體患高血壓的可能性高于正常人群。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，檢測(cè)的是REN的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常REN核苷酸序列比較差異。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的差異是選自下組的單核苷酸多態(tài)性12194位G→T；12377位T→C；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO1。
4.一種檢測(cè)樣品是否存在REN基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，包括步驟(a)用REN基因特異性引物擴(kuò)增樣品的REN基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；和(b)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在選自下組的單核苷酸多態(tài)性12194位G→T；12377位T→C；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO1。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的單核苷酸多態(tài)性是12194位G→T。
6.一種REN基因和蛋白的用途，其特征在于，用于制備輔助性檢測(cè)的試劑。
7.一種用于輔助性檢測(cè)高血壓的試劑盒，其特征在于，它包括特異性擴(kuò)增REN基因或轉(zhuǎn)錄本的引物和說(shuō)明書(shū)。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，它還含有選自下組的試劑(a)與突變部位結(jié)合的探針；(b)識(shí)別突變位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的突變選自12194位G→T；12377位T→C；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO1。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述的單核苷酸多態(tài)性是12194位G→T。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)原發(fā)性高血壓易感性的方法，它包括檢測(cè)個(gè)體的腎素基因REN、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白與正常相比是否存在變異，存在變異就表明該個(gè)體患原發(fā)性高血壓的可能性大于正常人群。本發(fā)明還公開(kāi)了相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1861804SQ200510025749
公開(kāi)日2006年11月15日 申請(qǐng)日期2005年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月11日
發(fā)明者張怡, 張奎星, 朱鼎良, 高平進(jìn), 王谷亮, 黃薇 申請(qǐng)人:上海市高血壓研究所, 國(guó)家人類基因組南方研究中心