一種獲取西蘭花毛狀根的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種毛狀根的獲取方法，尤其涉及一種獲取西蘭花毛狀根的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]西蘭花中含有豐富的抗癌物質(zhì)蘿卜硫素，被美國(guó)《時(shí)代周刊》評(píng)為十大最佳營(yíng)養(yǎng)蔬菜之一。西蘭花可以增強(qiáng)機(jī)體免疫力、促進(jìn)生長(zhǎng)、增強(qiáng)血管韌性等功效，可以預(yù)防患乳腺癌、胃癌等癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。
[0003]西蘭花中的次生代謝產(chǎn)物蘿卜硫素由于具有防癌、抗癌的功效，在醫(yī)學(xué)上有著重要的應(yīng)用價(jià)值。而目前通常是從西蘭花種子或西蘭花幼苗中獲取，由于其種子原料成本過(guò)高，西蘭花的育種方式復(fù)雜且周期長(zhǎng)，并且西蘭花種子與幼苗中的蘿卜硫素含量低，無(wú)法滿足日常生活中人們對(duì)蘿卜硫素的需求。此外傳統(tǒng)的種植技術(shù)對(duì)植物的產(chǎn)量和質(zhì)量都有較大的影響，不利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。若建立西蘭花毛狀根的誘導(dǎo)及培養(yǎng)體系，通過(guò)培養(yǎng)大量的毛狀根來(lái)提高蘿卜硫素的產(chǎn)量將是一種應(yīng)用于工業(yè)化中簡(jiǎn)單、快速的方法。
[0004]雖然在個(gè)別植物中已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物外植體而獲得毛狀根，如煙草、新疆雪蓮等，并且獲得的這些毛狀根具有自主生長(zhǎng)、多根毛等特點(diǎn)，但到目前為止，國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)利用發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒介導(dǎo)西蘭花毛狀根培養(yǎng)體系的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種簡(jiǎn)單、高效的獲取西蘭花毛狀根的方法。
[0006]為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所述的一種獲取西蘭花毛狀根的方法，包括以下步驟: ⑴在超凈工作臺(tái)上，用高溫滅菌后的剪刀剪取同一批快繁的西蘭花無(wú)菌苗外植體，放在無(wú)菌濾紙上，然后用滅菌的針頭在其表面扎2~8個(gè)傷口，并接種于MS培養(yǎng)基中，最后于25°C暗處預(yù)培養(yǎng)2~7d，得到預(yù)培養(yǎng)的無(wú)菌苗外植體；
⑵將所述預(yù)培養(yǎng)的無(wú)菌苗外植體用0D_為0.2-0.8的發(fā)根農(nóng)桿菌在25 °C侵染2~10min，然后用無(wú)菌濾紙吸干其表面殘留的菌液，并接種于添加濃度為50~200 ymol/L乙酰丁香酮的MS培養(yǎng)基上，于25°C暗處共培養(yǎng)2~8d，得到共培養(yǎng)后的受體外植體；
⑶所述共培養(yǎng)后的受體外植體轉(zhuǎn)接于添加濃度為80~300mg/L羧芐青霉素二鈉的MS培養(yǎng)基中，于25°C暗培養(yǎng)，每5d轉(zhuǎn)接一次，經(jīng)2~5次轉(zhuǎn)接后即可獲得無(wú)菌毛狀根。
[0007]所述步驟⑴中剪取的西蘭花無(wú)菌苗外植體為0.5cm2的葉片和0.5cm長(zhǎng)的莖段。
[0008]所述步驟⑵中發(fā)根農(nóng)桿菌的型號(hào)為ATCC11325、R1601、ATCC15834中的任意一種。
[0009]所述MS培養(yǎng)基的pH值均為5.8。
[0010]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn):
1、本發(fā)明在國(guó)內(nèi)外未有類(lèi)似報(bào)道，在獲取毛狀根時(shí)侵染時(shí)間短，誘導(dǎo)率高(40.34%~73.64%)，且其浸染所得毛狀根中次生代謝產(chǎn)物蘿卜硫素含量(可達(dá)3689.35 μ g/g)較西蘭花種子、葉片等組織高30~200倍，具有較好的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)前景。
[0011]2、本發(fā)明投資少，工藝簡(jiǎn)單，適合工廠化生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0012]實(shí)施例1 一種獲取西蘭花毛狀根的方法，包括以下步驟:
⑴在超凈工作臺(tái)上，用高溫滅菌后的剪刀剪取同一批快繁的西蘭花無(wú)菌苗外植體，放在無(wú)菌濾紙上，然后用滅菌的針頭在其表面扎2個(gè)傷口，并接種于pH值為5.8的MS培養(yǎng)基中，最后于25°C暗處預(yù)培養(yǎng)2d，得到預(yù)培養(yǎng)的無(wú)菌苗外植體。
[0013]其中:剪取的西蘭花無(wú)菌苗外植體為0.5cm2的葉片和0.5cm長(zhǎng)的莖段。
[0014]⑵將預(yù)培養(yǎng)的無(wú)菌苗外植體用OD6。。為0.2的發(fā)根農(nóng)桿菌在25°C侵染2min，然后用無(wú)菌濾紙吸干其表面殘留的菌液，并接種于添加濃度為50 μ mol/L乙酰丁香酮且pH值為5.8的MS培養(yǎng)基上，于25°C暗處共培養(yǎng)2d，得到共培養(yǎng)后的受體外植體。
[0015]其中:發(fā)根農(nóng)桿菌的型號(hào)為ATCC11325。
[0016]⑶共培養(yǎng)后的受體外植體轉(zhuǎn)接于添加濃度為80mg/L羧芐青霉素二鈉且pH值為5.8的MS培養(yǎng)基中，于25°C暗培養(yǎng)，每5d轉(zhuǎn)接一次，經(jīng)2次轉(zhuǎn)接后即可獲得無(wú)菌毛狀根。毛狀根誘導(dǎo)率可達(dá)52.56%ο
[0017]實(shí)施例2 —種獲取西蘭花毛狀根的方法，包括以下步驟:
⑴在超凈工作臺(tái)上，用高溫滅菌后的剪刀剪取同一批快繁的西蘭花無(wú)菌苗外植體，放在無(wú)菌濾紙上，然后用滅菌的針頭在其表面扎5個(gè)傷口，并接種于pH值為5.8的MS培養(yǎng)基中，最后于25°C暗處預(yù)培養(yǎng)5d，得到預(yù)培養(yǎng)的無(wú)菌苗外植體。
[0018]其中:剪取的西蘭花無(wú)菌苗外植體為0.5cm2的葉片和0.5cm長(zhǎng)的莖段。
[0019]⑵將預(yù)培養(yǎng)的無(wú)菌苗外植體用OD6。。為0.6的發(fā)根農(nóng)桿菌在25°C侵染6min，然后用無(wú)菌濾紙吸干其表面殘留的菌液，并接種于添加濃度為150ymol/L乙酰丁香酮且pH值為5.8的MS培養(yǎng)基上，于25 °C暗處共培養(yǎng)5d，得到共培養(yǎng)后的受體外植體。
[0020]其中:發(fā)根農(nóng)桿菌的型號(hào)為ATCC15834。
[0021]⑶共培養(yǎng)后的受體外植體轉(zhuǎn)接于添加濃度為150mg/L羧芐青霉素二鈉且pH值為5.8的MS培養(yǎng)基中，于25 °C暗培養(yǎng)，每5d轉(zhuǎn)接一次，經(jīng)4次轉(zhuǎn)接后即可獲得無(wú)菌毛狀根。毛狀根誘導(dǎo)率可達(dá)73.64%ο
[0022]實(shí)施例3 —種獲取西蘭花毛狀根的方法，包括以下步驟:
⑴在超凈工作臺(tái)上，用高溫滅菌后的剪刀剪取同一批快繁的西蘭花無(wú)菌苗外植體，放在無(wú)菌濾紙上，然后用滅菌的針頭在其表面扎8個(gè)傷口，并接種于pH值為5.8的MS培養(yǎng)基中，最后于25°C暗處預(yù)培養(yǎng)7d，得到預(yù)培養(yǎng)的無(wú)菌苗外植體。
[0023]其中:剪取的西蘭花無(wú)菌苗外植體為0.5cm2的葉片和0.5cm長(zhǎng)的莖段。
[0024]⑵將預(yù)培養(yǎng)的無(wú)菌苗外植體用OD6。。為0.8的發(fā)根農(nóng)桿菌在25°C侵染lOmin，然后用無(wú)菌濾紙吸干其表面殘留的菌液，并接種于添加濃度為200 μ mol/L乙酰丁香酮且pH值為5.8的MS培養(yǎng)基上，于25 °C暗處共培養(yǎng)8d，得到共培養(yǎng)后的受體外植體。
[0025]其中:發(fā)根農(nóng)桿菌的型號(hào)為R1601。
[0026]⑶共培養(yǎng)后的受體外植體轉(zhuǎn)接于添加濃度為300mg/L羧芐青霉素二鈉且pH值為
5.8的MS培養(yǎng)基中，于25°C暗培養(yǎng)，每5d轉(zhuǎn)接一次，經(jīng)5次轉(zhuǎn)接后即可獲得無(wú)菌毛狀根。毛狀根誘導(dǎo)率為40.34%ο
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種獲取西蘭花毛狀根的方法，包括以下步驟: ⑴在超凈工作臺(tái)上，用高溫滅菌后的剪刀剪取同一批快繁的西蘭花無(wú)菌苗外植體，放在無(wú)菌濾紙上，然后用滅菌的針頭在其表面扎2~8個(gè)傷口，并接種于MS培養(yǎng)基中，最后于25°C暗處預(yù)培養(yǎng)2~7d，得到預(yù)培養(yǎng)的無(wú)菌苗外植體； ⑵將所述預(yù)培養(yǎng)的無(wú)菌苗外植體用0D_為0.2-0.8的發(fā)根農(nóng)桿菌在25 °C侵染2~10min，然后用無(wú)菌濾紙吸干其表面殘留的菌液，并接種于添加濃度為50~200 ymol/L乙酰丁香酮的MS培養(yǎng)基上，于25°C暗處共培養(yǎng)2~8d，得到共培養(yǎng)后的受體外植體； ⑶所述共培養(yǎng)后的受體外植體轉(zhuǎn)接于添加濃度為80~300mg/L羧芐青霉素二鈉的MS培養(yǎng)基中，于25°C暗培養(yǎng)，每5d轉(zhuǎn)接一次，經(jīng)2~5次轉(zhuǎn)接后即可獲得無(wú)菌毛狀根。2.如權(quán)利要求1所述的一種獲取西蘭花毛狀根的方法，其特征在于:所述步驟⑴中剪取的西蘭花無(wú)菌苗外植體為0.5cm2的葉片和0.5cm長(zhǎng)的莖段。3.如權(quán)利要求1所述的一種獲取西蘭花毛狀根的方法，其特征在于:所述步驟⑵中發(fā)根農(nóng)桿菌的型號(hào)為ATCCl 1325、R160UATCC15834中的任意一種。4.如權(quán)利要求1所述的一種獲取西蘭花毛狀根的方法，其特征在于:所述MS培養(yǎng)基的pH值均為5.8。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種獲取西蘭花毛狀根的方法，該方法包括以下步驟：⑴剪取同一批快繁的西蘭花無(wú)菌苗外植體，放在無(wú)菌濾紙上，然后用滅菌的針頭在其表面扎2~8個(gè)傷口，并接種于MS培養(yǎng)基中，最后于暗處預(yù)培養(yǎng)，得到預(yù)培養(yǎng)的無(wú)菌苗外植體；⑵將所述預(yù)培養(yǎng)的無(wú)菌苗外植體用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染，然后用無(wú)菌濾紙吸干其表面殘留的菌液，并接種于添加乙酰丁香酮的MS培養(yǎng)基上，于暗處共培養(yǎng)，得到共培養(yǎng)后的受體外植體；⑶所述共培養(yǎng)后的受體外植體轉(zhuǎn)接于添加羧芐青霉素二鈉的MS培養(yǎng)基中，于暗培養(yǎng)，每5d轉(zhuǎn)接一次，經(jīng)2~5次轉(zhuǎn)接后即可獲得無(wú)菌毛狀根。本發(fā)明簡(jiǎn)單、高效，適合工廠化生產(chǎn)。
【IPC分類(lèi)】C12N15/82, C12N5/10
【公開(kāi)號(hào)】CN105063084
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510554153
【發(fā)明人】馬紹英, 李勝, 胡翠珍, 趙生琴
【申請(qǐng)人】甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2015年9月2日