一種人工改造功能蛋白的方法
【專利說明】一種人工改造功能蛋白的方法
【背景技術(shù)】：
[0001] 功能蛋白的人工改造進(jìn)化是改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)滿足工業(yè)化需求的有效途 徑，現(xiàn)在定向進(jìn)化技術(shù)已被用于上百個酶的進(jìn)化，大大提高了生物酶的活性和效率，在工 業(yè)、農(nóng)業(yè)、生物制藥等方面產(chǎn)生了巨大影響。
[0002] 功能蛋白的定向進(jìn)化的成功與否主要取決于所構(gòu)建的突變文庫是否具有足夠高 的多樣性及庫容量。根據(jù)文庫構(gòu)建原理的不同，可分為理性進(jìn)化和隨機(jī)進(jìn)化兩種策略。理 性進(jìn)化策略需要事先分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，預(yù)測和構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)。理性進(jìn)化只適用于結(jié)構(gòu)與 功能之間的關(guān)系已經(jīng)比較清楚的蛋白質(zhì)，對于分子結(jié)構(gòu)不明確的蛋白很難改造。因而，隨機(jī) 進(jìn)化成為十分有效的蛋白質(zhì)定向進(jìn)化手段。以易錯PCR為代表的隨機(jī)突變技術(shù)和以DNA改 組技術(shù)為代表的基因重組技術(shù)是目前常用的兩種隨機(jī)進(jìn)化技術(shù)。易錯PCR技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用 中存在一定的局限性，它是通過改變PCR反應(yīng)體系中的Mg 2+和dNTPs的濃度，改變DNA聚合 酶的保真性，以相繼或組合式累計變異來獲得理想突變體的方法。由于該技術(shù)引入的是點(diǎn) 突變，這就導(dǎo)致獲得理想突變體的速度較慢，且目的基因長度太短（小于800bp)。相對于易 錯PCR產(chǎn)生的點(diǎn)突變，基于基因序列之間的重組是一種更有效的建立突變體文庫方法。目 前，DNA重組的方法很多，如DNA改組、交錯延伸重組、隨機(jī)引物體外重組等。這些方法通過 將親本基因片段進(jìn)行混合并連接得到理想突變體。DNA改組技術(shù)不僅能將親本間的突變隨 機(jī)組合，更易獲得突變體，還可以將親本之間的優(yōu)勢集與一體。但是同源基因重組不能用于 同源性低于70% -80%的基因序列，因此所獲得的有效突變體少。
[0003] 1998年，Ostermeier等人建立了漸進(jìn)式切割產(chǎn)生雜合酶技術(shù)（ITCHY)，開創(chuàng)了 非同源性重組的先河，目前已發(fā)展了多項非同源重組技術(shù)，如不依賴序列同源性的蛋白質(zhì) 重組方法（SHIPREC)以及非同源隨機(jī)重組（NRR)等。但是這些方法將DNA的結(jié)構(gòu)域及重 要的功能片段破壞，降低了所構(gòu)建文庫的有效性。為增加有功能個體的比例，研究者開發(fā) 出利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能片段進(jìn)行重組構(gòu)建基因文庫的方法，如Block Shuffling，Domain Shuffling和Module Shuffling等。但是這些方法重組模塊序列長且數(shù)量少，形成的重組 基因文庫多樣性低。2008年，Graziano等利用蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)單元為重組模塊，成功獲 得可溶性蛋白。Graziano等首先從PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中查找并選取大腸桿菌中所有蛋白質(zhì) 的二級結(jié)構(gòu)，選取了 4種蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)類型（a-helix，0-strand，loop-H，loop-S)， 同時依據(jù)不同的二級結(jié)構(gòu)設(shè)計16種不同Linker，首先利用PCR的方法形成DNA雙鏈基因 庫，加入限制性核酸內(nèi)切酶消化雙鏈DNA形成粘性末端，利用連接酶將DNA片段連接成長 鏈，加入上下游引物PCR擴(kuò)增后，連接入載體導(dǎo)入受體菌中，進(jìn)行表達(dá)及篩選。該方法需設(shè) 計多條Linker，設(shè)計的Linker長度達(dá)到54bp，同一二級結(jié)構(gòu)需要設(shè)計連接不同的Linker， 增加了實(shí)驗(yàn)成本；連接為半隨機(jī)連接，降低了文庫的庫容量。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0004] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷和不足，為人們提供一種功能蛋白定向 進(jìn)化的方法。
[0005] 本發(fā)明所述一種人工改造功能蛋白的方法，以目標(biāo)蛋白分子結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，選取文 庫構(gòu)建重組模塊，所述模塊為二級結(jié)構(gòu)單元（a -螺旋，0 -折疊片，0 -轉(zhuǎn)角），并包括重要 的催化活性位點(diǎn)及配體結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域，通過將所述模塊區(qū)域基因引入Linker，并使用限制 性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切片段完全隨機(jī)連接組合構(gòu)建重組基因文庫，表達(dá)并篩選。
[0006] -種人工改造功能蛋白的方法，具體的步驟為：
[0007] (1)根據(jù)目標(biāo)酶蛋白結(jié)構(gòu)，在蛋白數(shù)據(jù)庫中查詢獲得所述蛋白質(zhì)序列，選取文庫構(gòu) 建重組模塊，所述模塊為其二級結(jié)構(gòu)單元（ a -螺旋，0 -折疊片，0 -轉(zhuǎn)角），并包括重要的 催化活性位點(diǎn)及配體結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域；
[0008] (2)確定所述各模塊區(qū)域的基因片段；
[0009] (3)利用PCR或者人工合成的方式在所選取的基因片段兩端加入Linker，形成兩 端Linker的單鏈DNA ;
[0010] (4)將所述目標(biāo)酶蛋白序列首尾基因片段作為終止序列，并只在所述終止序列一 端加入Linker，形成一端Linker的單鏈DNA ;
[0011] (5)在聚合酶的作用下，將步驟3和步驟4所得單鏈DNA合成為雙鏈DNA，使用限 制性核酸內(nèi)切酶酶切所述雙鏈DNA，產(chǎn)生粘性末端，形成酶切片段；
[0012] (6)在連接酶作用下，將步驟5所得酶切片段連接，形成重組基因文庫；
[0013] (7)所述基因文庫的擴(kuò)增及表達(dá)，將連接后的重組基因文庫進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引 物引入酶切位點(diǎn)，回收不小于原始基因長度區(qū)域的DNA片段，酶切后與載體連接，表達(dá)并篩 選。
[0014] 當(dāng)步驟（6)連接后的主要片段產(chǎn)物長度小于所述目標(biāo)蛋白基因序列長度，通過重 聚PCR進(jìn)行延長；
[0015] 所述Linker經(jīng)酶切后連接兩個模塊的基因序列的堿基數(shù)為3的倍數(shù)，翻譯后的氨 基酸為柔性氨基酸。
[0016] 進(jìn)一步的，所述Linker經(jīng)酶切后連接兩個模塊的基因序列的長度為9個堿基，減 少Linker在重組后序列中的比例，降低了 Linker對文庫功能的影響。
[0017] 所述方法Linker經(jīng)酶切后形成同一互補(bǔ)的粘性末端，因此保證了在重組基因文 庫的時候是模塊間的完全隨機(jī)的結(jié)合。
[0018] 本方法利用蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)及重要的功能結(jié)構(gòu)區(qū)域?yàn)榻M合基本模塊，以一個含 有20個模塊為例，隨機(jī)組合能產(chǎn)生20 2°種不同的序列組合方式，具有龐大的序列組合空間， 提高了所構(gòu)建文庫的多樣性，同時以蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)及重要的功能結(jié)構(gòu)區(qū)域?yàn)槟K，利 用了原有的功能結(jié)構(gòu)，提高了組合文庫的有效性，促進(jìn)了功能蛋白的定向進(jìn)化改造。
[0019] 所述目標(biāo)功能蛋白為1個或多個蛋白質(zhì)，可對某一蛋白質(zhì)功能定向改造，也可利 用多種蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)創(chuàng)造出新的蛋白質(zhì)。
[0020] 所述模塊以單個二級結(jié)構(gòu)單元為主，其含有的氨基酸個數(shù)為3-50個，優(yōu)選氨基酸 個數(shù)為3-20的模塊，模塊氨基酸個數(shù)少，目標(biāo)蛋白質(zhì)含有模塊數(shù)多，所構(gòu)建重組文庫多樣 性高。
[0021] 所述模塊經(jīng)連接重組后形成的基因文庫所包含的模塊數(shù)不小于6個，保證了文庫 的多樣性。
[0022] 所述粘性末端為非回文序列，保證在連接重組時雙鏈DNA不會反向連接，形成有 義重組。
[0023] 所述方法建立在已知蛋白序列及功能的基礎(chǔ)上，能更加高效的篩選出功能更強(qiáng)大 的功能蛋白。
[0024] 有益效果：
[0025] 本發(fā)明所述的一種人工改造功能蛋白的方法，利用蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)及重要的功 能結(jié)構(gòu)區(qū)域?yàn)榻M合基本模塊，通過模塊間的完全無序的隨機(jī)組合，構(gòu)建蛋白質(zhì)文庫，通過篩 選，定向獲得更好效率的功能蛋白。所述方法構(gòu)建的文庫數(shù)據(jù)龐大，功能定向可控，通過對 新的功能蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析，了解新的功能蛋白質(zhì)中有效的模塊重組及有效模塊，為了解 目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能生物學(xué)信息并輔助完善理性設(shè)計蛋白質(zhì)提供幫助。
【附圖說明】：
[0026] 圖1P00552二級結(jié)構(gòu)圖
[0027] 圖2 P00552結(jié)構(gòu)域示意圖
[0028] 圖3首尾序列濃度優(yōu)化，其中M. DL 2000 DNA Marker ; 1-3.不同的首尾序列濃度， 首尾序列濃度依次為50 %、10 %、2 %
[0029] 圖4重聚PCR循環(huán)數(shù)優(yōu)化，其中M. DL 2000 DNA Marker ;1-3.不同循環(huán)數(shù)的重聚 產(chǎn)物，循環(huán)數(shù)依次為3、5、10
[0030] 圖5重聚PCR模板濃度優(yōu)化，其中M. DL 2000 DNA Marker ; 1-4.不同的模板濃度 重聚產(chǎn)物，模板濃度依次為250ng/ y L、50ng/ y L、10ng/ y L、2ng/ y L
[0031] 圖6菌落PCR電泳圖
[0032] 圖7測序結(jié)果模擬圖
【具體實(shí)施方式】：
[0033] -種人工改造卡那霉素抗性蛋白的方法：
[0034] 1.根據(jù)目標(biāo)酶蛋白結(jié)構(gòu)，在蛋白數(shù)據(jù)庫中查詢獲得所述蛋白質(zhì)序列，選取模塊，所 述模塊為其二級結(jié)構(gòu)單元螺旋，折疊片，轉(zhuǎn)角），包括重要的催化活性位點(diǎn)及 配體結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域；
[0035] 從EBI (歐洲生物信息研究所）中查詢卡那霉素抗性蛋白，查找結(jié)構(gòu)信息明確的蛋 白質(zhì)。其蛋白質(zhì)編號為P00552、P00553、P05057。
[0036] 將查找到的蛋白質(zhì)在(蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)資料數(shù)據(jù)庫）中分析其相應(yīng)的結(jié)構(gòu)功 能生物學(xué)信息。找出相應(yīng)模塊，包括所述蛋白質(zhì)的基本二級結(jié)構(gòu)（a-螺旋，折疊片， 0 _轉(zhuǎn)角等），以及重要的催化活性位點(diǎn)及配體結(jié)合位點(diǎn)。
[0037] P00552氨基酸序列為：
[0038] MIEQDGLHAGSPAAWVERLFGYDWAQQTIGCSDAAVFRLSAQGRPVLFVKTDLSGALNELQDEAARLSff LATTGVPCAAVLDVVTEAGRDWLLLGEVPGQDLLS