專(zhuān)利名稱(chēng)：：利用基因重組蠶生產(chǎn)生理活性蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用染色體中整合了細(xì)胞因子基因的蠶的重組型細(xì)胞因子的制造方法。另外涉及具有在絲腺或繭絲中產(chǎn)生重組型細(xì)胞因子的性質(zhì)的基因重組蠶、以及用于制作該重組蠶的向蠶染色體導(dǎo)入外源基因用的載體。另外還涉及向昆蟲(chóng)細(xì)胞導(dǎo)入基因的基因?qū)胼d體和利用用該載體導(dǎo)入了基因的昆蟲(chóng)細(xì)胞、昆蟲(chóng)組織、昆蟲(chóng)的外源蛋白質(zhì)的制造方法。另外還涉及含有本發(fā)明中得到的重組蠶產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)的蠶絲。
背景技術(shù)：
：使用基因重組技術(shù)進(jìn)行外源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)可以在各種各樣的產(chǎn)業(yè)中利用。作為宿主主要可以使用大腸桿菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞等。然而，由于所謂可以高效生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)的宿主還沒(méi)有開(kāi)發(fā)出來(lái)，對(duì)于每個(gè)目的蛋白質(zhì)都需要構(gòu)建生產(chǎn)體系，人們當(dāng)然期盼在各個(gè)宿主的外源蛋白質(zhì)生產(chǎn)技術(shù)中的進(jìn)一步技術(shù)革新。在大腸桿菌等細(xì)菌或酵母的體系中，存在著翻譯后修飾的問(wèn)題。有時(shí)不能合成充分功能形式的蛋白質(zhì)。另外，動(dòng)物細(xì)胞大多可以合成具有功能形式的蛋白質(zhì)，但一般來(lái)說(shuō)使其增殖困難，而且產(chǎn)量低，不經(jīng)濟(jì)。另一方面，在使用昆蟲(chóng)或昆蟲(chóng)細(xì)胞的基因重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)中，酶和具有生理活性的有用蛋白質(zhì)等可以比較廉價(jià)地批量生產(chǎn)，可以得到接近于動(dòng)物的蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，這已為人們所了解。具體來(lái)說(shuō)，通過(guò)使整合了外源蛋白質(zhì)基因的桿狀病毒感染昆蟲(chóng)或昆蟲(chóng)細(xì)胞的方法，可以比較廉價(jià)地批量生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)，已知有作為醫(yī)藥品已成品化的生理活性蛋白質(zhì)(特開(kāi)昭61-9288號(hào)公報(bào)、特開(kāi)昭61-9297號(hào)公報(bào))。作為具有基因免疫調(diào)節(jié)作用的生理活性物質(zhì)，如在醫(yī)藥用途中引人注目的細(xì)胞因子類(lèi)的生產(chǎn)，在特開(kāi)平3-139276號(hào)公報(bào)、特開(kāi)平9-234085號(hào)公報(bào)中分別給出了將整合了貓干擾素"基因、狗干擾素Y基因的BmNPV接種到蠶的方法。另外，作為干擾素以外的蛋白質(zhì)在昆蟲(chóng)中生產(chǎn)的例子，還已知使桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞進(jìn)行人膠原的生產(chǎn)方法(特開(kāi)平8-23979號(hào)公報(bào))。然而，在以往的使用昆蟲(chóng)或昆蟲(chóng)細(xì)胞的重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)技術(shù)中，由于在外源基因的導(dǎo)入中使用重組病毒，所以從安全性考慮，有一個(gè)課題是必須要使其失活或進(jìn)行封閉。另外，在將重組病毒向蠶進(jìn)行接種的方法中，由于重組病毒的接種煩雜，目的外源蛋白質(zhì)產(chǎn)生在體液中，需要從來(lái)自蠶體液的大量的夾雜蛋白質(zhì)中純化目的重組蛋白質(zhì)。因此，存在著難于獲得高純度的重組蛋白質(zhì)的問(wèn)題。另外，近年來(lái)嘗試了對(duì)昆蟲(chóng)染色體進(jìn)行外源基因的重組，利用多[核殼體]核型多角體病毒的一種苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus(AcNPV))的DNA，通過(guò)同源重組將在絲心蛋白L鏈基因付加了水母綠色熒光蛋白質(zhì)基因的融合基因?qū)胄Q染色體上，使其表達(dá)的方法已開(kāi)發(fā)(GenesDev.,13，511-516，1999)，利用該技術(shù)導(dǎo)入了人膠原基因的蠶及其制造方法也已公布(特開(kāi)2001-161214號(hào)公報(bào))。另外，最近，利用來(lái)自于鱗翅目昆蟲(chóng)的轉(zhuǎn)座子piggyBac將外源基因穩(wěn)定導(dǎo)入到蠶染色體，使外源基因編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)的方法進(jìn)行了以水母綠色熒光蛋白質(zhì)作為模型的研究，也已確認(rèn)可以通過(guò)交配將基因穩(wěn)定地傳給后代(NatureBiotechnology,18，81-84，2000)。然而，在使用上述的AcNPV向昆蟲(chóng)染色體導(dǎo)入外源蛋白質(zhì)基因的導(dǎo)入方法中，由于使用重組桿狀病毒(AcNPV)，重組病毒的失活和封閉的課題依然存在。在使用轉(zhuǎn)座子piggyBac的例子中，綠色熒光蛋白質(zhì)由于產(chǎn)量不充分、而且在蠶全身產(chǎn)生，為了以高純度形式回收表達(dá)的重組型綠色熒光蛋白質(zhì)，就需要高度的純化技術(shù)，所以經(jīng)濟(jì)上也是個(gè)問(wèn)題。另外，生產(chǎn)的重組型蛋白質(zhì)的產(chǎn)量還不充分，非常少。S卩，在以這樣的昆蟲(chóng)細(xì)胞作為宿主生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)技術(shù)中，存在著需要使重組桿狀病毒失活和封閉，使用蠶時(shí)等，存在著從存在大量夾雜蛋白的體液中純化目的蛋白質(zhì)是困難的、目的蛋白質(zhì)的表達(dá)量少等幾個(gè)課題。到目前為止，人們還不知道將細(xì)胞因子基因等編碼具有生理活性的蛋白質(zhì)的基因?qū)胄Q染色體，使目的蛋白質(zhì)表達(dá)的例子。另外，也沒(méi)有從蠶體液以外的部位的絲腺或蠶的分泌物蠶絲回收重組型的細(xì)胞因子，確認(rèn)得到的細(xì)胞因子的生理活性的例子。而且，關(guān)于可遺傳上述性質(zhì)的蠶也沒(méi)有先例。另外，也沒(méi)有通過(guò)利用轉(zhuǎn)座子制作的重組蠶使大量重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生在蠶絲中的例子。發(fā)明的公開(kāi)利用昆蟲(chóng)的重組型蛋白質(zhì)的生產(chǎn)技術(shù)雖然投入精力進(jìn)行了研究，但存在著需要對(duì)整合了外源蛋白質(zhì)的重組桿狀病毒進(jìn)行失活或封閉，且重組桿狀病毒接種煩雜等課題。另外，在使用重組桿狀病毒的蠶中的外源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)中，也存在著由含有大量的雜質(zhì)的體液提取、純化目的蛋白質(zhì)是困難的課題。雖然也進(jìn)行了將外源蛋白質(zhì)基因?qū)氲叫Q染色體的重組蛋白質(zhì)的制造技術(shù)的研究，但也存在著目的外源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量低、而且從蠶體液純化目的蛋白質(zhì)困難的課題。本發(fā)明鑒于上述狀況，作為課題提供不需要使用重組桿狀病毒，而且容易進(jìn)行具有生理活性的目的蛋白質(zhì)的純化的昆蟲(chóng)用的基因工程材料，同時(shí)也提供利用該基因工程材料的外源蛋白質(zhì)的制造方法。本發(fā)明人進(jìn)行了專(zhuān)心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)利用來(lái)自轉(zhuǎn)座子的DNA將具有編碼目的蛋白質(zhì)的基因結(jié)合在在蠶絲腺中特異表達(dá)的啟動(dòng)子下游的構(gòu)造的DNA序列導(dǎo)入蠶染色體，目的蛋白質(zhì)可以以保持生理活性的形式在絲腺或繭絲中生產(chǎn)，并因此完成了本發(fā)明。在本發(fā)明中，重組蛋白質(zhì)由于可以從不含有大量雜質(zhì)的絲腺或蠶絲中回收，具有目的蛋白質(zhì)純化容易的優(yōu)點(diǎn)。另外，由于不使用桿狀病毒那樣的病毒，不需要使病毒失活，可以簡(jiǎn)便而且安全地實(shí)施重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。另外，本發(fā)明人著眼于蠶絲腺特別是后部絲腺大量生產(chǎn)占絲蛋白質(zhì)的7080%的絲心蛋白，而且向絲腺細(xì)胞外分泌這一點(diǎn)，進(jìn)行了專(zhuān)心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)將在絲腺中進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子的下游含有絲心蛋白H鏈基因的第1內(nèi)含子的5'末端部分的3'末端側(cè)連接外源蛋白質(zhì)基質(zhì)的5'末端側(cè)，使得氨基酸讀框變成一列的基因[序列]盒導(dǎo)入絲腺細(xì)胞，5外源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量飛躍提高，另外，發(fā)現(xiàn)在絲腺進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子調(diào)控下，使外源蛋白質(zhì)基因的3'側(cè)連接絲心蛋白H鏈基因的3'末端部分，使得氨基酸讀框變成一列的融合基因表達(dá)時(shí)，外源蛋白質(zhì)可以大量分泌生產(chǎn)在絲腺細(xì)胞的外面。另外，將外源蛋白質(zhì)基因的5'側(cè)含有絲心蛋白H鏈基因的第1內(nèi)含子的5'末端部分的DNA序列、3'側(cè)絲心蛋白H鏈基因的3'末端部分的DNA設(shè)計(jì)成各個(gè)氨基酸讀框變成一列，制作基因[序列]盒，當(dāng)制作將該基因[序列]盒導(dǎo)入染色體的重組蠶時(shí)，發(fā)現(xiàn)該重組蠶在蠶絲中大量生產(chǎn)目的蛋白質(zhì)。本發(fā)明人在通過(guò)將使絲心蛋白H鏈基因的5'末端部分的DNA序列和3'末端部分的DNA序列與外源蛋白質(zhì)融合的表達(dá)用基因[序列]盒導(dǎo)入絲腺細(xì)胞等，可以成功地使大量的外源蛋白質(zhì)產(chǎn)生在絲腺細(xì)胞內(nèi)、絲腺細(xì)胞外，以及蠶絲中，可以確立不使用重組桿狀病毒，通過(guò)利用絲腺生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)，容易純化的外源蛋白質(zhì)生產(chǎn)技術(shù)。S卩，本發(fā)明涉及一種重組型細(xì)胞因子的制造方法，其特征是制作將細(xì)胞因子基因整合到染色體的基因重組蠶，從其絲腺或繭絲中回收細(xì)胞因子。另外，涉及整合了細(xì)胞因子基因的基因重組蠶、向蠶導(dǎo)入細(xì)胞因子基因中使用的基因重組載體。另外，本發(fā)明還涉及通過(guò)以下所示的基因[序列]盒、載體等在昆蟲(chóng)中可用于外源蛋白質(zhì)生產(chǎn)的基因工程材料、轉(zhuǎn)化體、利用轉(zhuǎn)化體的外源蛋白質(zhì)的制造方法和含有外源蛋白質(zhì)的蠶絲。因此，1)、本發(fā)明提供外源蛋白質(zhì)表達(dá)用基因[序列]盒，其含有(1)在絲腺中進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子，和(2)使連接在上述(1)的下游的絲心蛋白H鏈基因的5'末端部分與外源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的5'側(cè)融合的基因。2)、本發(fā)明還提供外源蛋白質(zhì)表達(dá)用基因[序列]盒，其含有(1)在絲腺中進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子，和(2)使絲心蛋白H鏈基因的3'末端部分與連接在上述(1)的下游的不含有終止密碼子的外源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的3'側(cè)融合的基因?；蛞环N外源蛋白質(zhì)表達(dá)用基因[序列]盒，其含有(1)在絲腺中進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子，和(2)使外源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因與連接在上述(1)的下游的絲心蛋白H鏈基因的3'末端部分的3'側(cè)融合的基因。3)、本發(fā)明還提供外源蛋白質(zhì)表達(dá)用基因[序列]盒，其含有(1)在絲腺中進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子，和(2)使絲心蛋白H鏈基因的5'末端部分與連接在上述(1)的下游的不含有終止密碼子的外源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的5'側(cè)融合，而且使絲心蛋白H鏈基因的3'末端部分與上述結(jié)構(gòu)基因的3'側(cè)融合的基因。4)本發(fā)明還提供一種昆蟲(chóng)細(xì)胞用表達(dá)載體，其特征是含有上述1)至3)中任一項(xiàng)所述的外源蛋白質(zhì)的表達(dá)基因[序列]盒。5)、本發(fā)明還提供一種外源蛋白質(zhì)的制造方法，其特征是將上述4)所述的昆蟲(chóng)細(xì)胞用載體導(dǎo)入昆蟲(chóng)細(xì)胞。6)、本發(fā)明還提供外源蛋白質(zhì)的制造方法，其特征是制作將上述1)至3)中任一項(xiàng)所述的外源蛋白質(zhì)表達(dá)用基因[序列]盒整合到染色體的重組蠶，使得到的重組蠶的絲腺或蠶絲生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)后，從其絲腺或蠶絲中回收外源蛋白質(zhì)。7)、本發(fā)明還提供重組蠶，其染色體中導(dǎo)入了上述1)至3)中任一項(xiàng)所述的外源蛋白質(zhì)表達(dá)用基因[序列]盒，而且具有在絲腺或蠶絲中生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)的能力。8)、本發(fā)明另外還提供含有上述7)所述的蠶產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)的蠶絲。附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明圖1是基因?qū)胼d體pigSIB的限制性酶切圖譜。圖2是基因?qū)胼d體pigFIB的限制性酶切圖譜。圖3是帶有轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒pHA3PIG的限制性酶切圖譜。圖4是表示對(duì)表1的由陽(yáng)性蛾區(qū)得到的11頭蠶(Gl)的基因組DNA進(jìn)行EcoRV，Xmnl處理后，以貓干擾素"基因作為探針進(jìn)行Southern印跡法解析的結(jié)果圖。圖5是表示導(dǎo)入了連接在絲心蛋白H鏈啟動(dòng)子的貓干擾素"基因的重組蠶的蠶絲提取液的抗病毒活性的圖。被染色的泳道的樣品具有活性。圖6是表示對(duì)表3的由陽(yáng)性蛾區(qū)(來(lái)自實(shí)驗(yàn)1的3蛾區(qū)、來(lái)自實(shí)驗(yàn)2的2蛾區(qū))得到的蠶絲腺基因組DNA進(jìn)行EcoRI或BglII處理后，以貓干擾素"基因作為探針進(jìn)行Southern印跡法解析的結(jié)果圖。圖7是通過(guò)RT-PCR對(duì)基因重組蠶中部絲腺中的貓干擾素mRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)的圖。圖8是表示導(dǎo)入了連接在絲膠蛋白啟動(dòng)子的貓干擾素"基因的重組蠶的中部絲腺提取液和繭絲提取液的抗病毒活性的圖。被染色的泳道的樣品具有活性。圖9是表示含有P.IC.A基因[序列]盒的基因?qū)胗脴?gòu)建物的制作手法(前半部分)的圖。圖10是表示含有P.IC.A基因[序列]盒的基因?qū)胗脴?gòu)建物的制作手法(后半部分)的圖。圖ll是表示含有HP.IC.HA基因[序列]盒的基因?qū)胗脴?gòu)建物的制作手法(前半部分)的圖。圖12是表示含有HP.IC.HA基因[序列]盒的基因?qū)胗脴?gòu)建物的制作手法(后半部分)的圖。圖13是表示含有HUP.IC.HA基因[序列]盒的基因?qū)胗脴?gòu)建物的制作手法(前半部分)的圖。圖14是表示含有HUP.IC.HA基因[序列]盒的基因?qū)胗脴?gòu)建物的制作手法(后半部分)的圖。圖15是表示含有HP.IC.A基因[序列]盒的基因?qū)胗脴?gòu)建物的制作手法(前半部分)的圖。圖16是表示含有HP.IC.A基因[序列]盒的基因?qū)胗脴?gòu)建物的制作手法(后半部分)的圖。圖17是通過(guò)Western解析對(duì)培養(yǎng)蠶絲腺中的P_半乳糖苷酶的表達(dá)進(jìn)行解析的圖。表明絲心蛋白H鏈基因第一外顯子、第一內(nèi)含子、第二外顯子區(qū)對(duì)在細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成或基因表達(dá)起著重要的作用。另外也確認(rèn)了向細(xì)胞外的分泌。圖18是通過(guò)Western解析對(duì)蠶絲腺組織中的重組蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行解析的圖。再次確認(rèn)絲心蛋白H鏈基因第一外顯子、第一內(nèi)含子、第二外顯子區(qū)對(duì)在蠶后部絲腺細(xì)胞內(nèi)的重組蛋白質(zhì)表達(dá)的快速上升起著重要的作用。另外表明在絲心蛋白啟動(dòng)子上游區(qū)約5.5kbp處存在使蛋白質(zhì)產(chǎn)量提高的基因區(qū)。圖19是通過(guò)Western解析對(duì)在蠶絲中的重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生進(jìn)行解析的圖。顯然絲心蛋白H鏈基因的3'末端部分在絲腺細(xì)胞內(nèi)合成的蛋白質(zhì)向蠶絲的分泌中起著重要的作用。另外，再次確認(rèn)在絲心蛋白啟動(dòng)子上游區(qū)約5.5kbp處存在使蛋白質(zhì)產(chǎn)量提高的基因區(qū)。發(fā)明的實(shí)施方式細(xì)胞因子是由各種各樣的細(xì)胞產(chǎn)生、具有對(duì)造血細(xì)胞和免疫細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用、抗病毒作用、血球細(xì)胞增殖作用的蛋白質(zhì)。其作用是通過(guò)形成準(zhǔn)確無(wú)誤的高級(jí)結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞膜上的特異受體結(jié)合發(fā)揮的。到現(xiàn)在為止，由于其作用的特征，正進(jìn)行著對(duì)以人為首的動(dòng)物的臨床應(yīng)用。作為本發(fā)明的細(xì)胞因子種類(lèi)并沒(méi)有特別限定，只要是當(dāng)在蠶體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)時(shí)，保持其生理活性的細(xì)胞因子類(lèi)就可以，作為具有免疫調(diào)節(jié)作用、抗病毒作用、血球細(xì)胞增殖作用等生理活性物質(zhì)，如在醫(yī)藥、醫(yī)療應(yīng)用中引人注目的蛋白質(zhì)，可列舉例如，人干擾素a、P、y(J.InterferonRes.5、521_526，1985，NucleicAcidsRes.10，2487-2501，1982)、人白細(xì)胞介素12(J.Immunol.146，3074-3081，1991)、人顆粒球菌落剌激因子(Nature,319，415-418，1986)、人紅細(xì)胞生成素(Nature,313，806-810，1985)、人血小板生成素(Cell.77，1117-1124，1994)、貓干擾素w(Biosci.Biotech.Biochem.，56,211-214，1992、GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄編號(hào)E04599)、貓紅細(xì)胞生成素(GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄編號(hào)FDU00685)、貓粒細(xì)胞菌落剌激因子(Gene，274，263-269，2001)、狗干擾素y(GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄編號(hào)S41201)、狗白細(xì)胞介素12(特開(kāi)平10-36397號(hào)公報(bào))、狗粒細(xì)胞菌落剌激因子(美國(guó)專(zhuān)利第5606024號(hào))等。作為細(xì)胞因子類(lèi)最好的是干擾素類(lèi)或菌落剌激因子類(lèi)，其中包括干擾素a、|3、y、"、t和粒細(xì)胞菌落剌激因子、粒細(xì)胞單核細(xì)胞菌落剌激因子、單核細(xì)胞菌落剌激因子、紅細(xì)胞生成素、血小板生成素等。而更優(yōu)選的是貓干擾素w、貓粒細(xì)胞菌落剌激因子、人干擾素P。貓干擾素"基因可以通過(guò)從例如由E.Coli(pFeIFNl)(微工研條第1633號(hào))提取的質(zhì)粒切出得到。或者，也可以從將切出的貓干擾素"基因與蠶的克隆載體(T.Horiuchi等人，Agric.Biol.Chem.，51，1573-1580，1987)連接制作的重組質(zhì)粒和蠶多[核殼體]核型多角體病毒DNA共轉(zhuǎn)染蠶樹(shù)立細(xì)胞后制作的rBNV100中獲得。貓粒細(xì)胞菌落剌激因子基因可通過(guò)用LPS剌激來(lái)自貓腎臟的培養(yǎng)細(xì)胞CRFK后，由該細(xì)胞回收mRNA，再將通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，使用參考GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄編號(hào)AB042552設(shè)定的引物進(jìn)行PCR得到。人干擾素P基因可以通過(guò)從編碼該cDNA的質(zhì)粒pORF-hIFN-P(Invivogen公司)切出獲得。關(guān)于本發(fā)明中的向蠶染色體導(dǎo)入基因的基因?qū)敕椒ǎ灰强梢酝ㄟ^(guò)基因被穩(wěn)定地整合到染色體、進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)交配基因也能穩(wěn)定傳遞到后代中那樣的基因?qū)敕椒ň涂梢裕梢允褂脤?duì)蠶卵進(jìn)行微注射的方法、使用基因槍的方法等，但最好是采用將含有轉(zhuǎn)座酶基因的輔助質(zhì)粒(NatureBiotechnology，18，81-84，2000)和含有目的基因的向蠶染色體導(dǎo)入外源基因用載體同時(shí)向蠶卵進(jìn)行微注射的方法。目的基因被導(dǎo)入在由被微注射的蠶卵孵化成長(zhǎng)的重組蠶中的生殖細(xì)胞。這樣獲得的重組蠶的后代在其染色體上可以穩(wěn)定保持目的基因。在本發(fā)明中得到的基因重組蠶可以與通常的蠶同樣的方法進(jìn)行繼代維持。即，在通常條件下對(duì)蠶進(jìn)行催青，將孵化出的蟻蠶收蟻到人工飼料等，通過(guò)與通常蠶同樣的條件下進(jìn)行飼養(yǎng)可以飼養(yǎng)到5齡蠶。8在本發(fā)明中得到的基因重組蠶可以與通常的蠶同樣進(jìn)行蛹化，做繭。在蛹階段區(qū)別雌雄，出蛾之后使雌雄交尾，第二天進(jìn)行采卵。卵可以與通常的卵同樣進(jìn)行保存。本發(fā)明的基因重組蠶通過(guò)這樣的反復(fù)飼養(yǎng)可以進(jìn)行傳代，而且可以大量增殖。在本發(fā)明中以將細(xì)胞因子導(dǎo)入到蠶染色體為目的使用的外源基因?qū)胼d體如果能設(shè)計(jì)成的確可以控制細(xì)胞因子的表達(dá)，則沒(méi)有特別限定，通常對(duì)于細(xì)胞因子基因，具有在上游連接在絲腺特異表達(dá)的啟動(dòng)子，而在下游連接任意的多聚A序列的結(jié)構(gòu)，在這些基因序列的外側(cè)有1對(duì)來(lái)自轉(zhuǎn)座子的DNA序列。另外，在與啟動(dòng)子之間也可以連接來(lái)自任意基因的信號(hào)序列等，在與多聚A之間也可以連接任意的基因序列。另外也可以連接人工設(shè)計(jì)、合成的基因序列。另外也可以根據(jù)需要，連接用于在細(xì)菌宿主中進(jìn)行復(fù)制的序列、抗生素抗性基因、熒光蛋白質(zhì)基因、LacZ基因等。例如，可以將結(jié)合在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子下游的綠色熒光蛋白質(zhì)GFP的基因?qū)氲揭粚?duì)來(lái)自轉(zhuǎn)座子的DNA序列之間的適當(dāng)部位。通過(guò)這樣操作可以容易進(jìn)行基因重組蠶的篩選。另外，本載體也可以含有PUC9、19等來(lái)自大腸桿菌質(zhì)粒的一部分或全部。另外，這里使用的啟動(dòng)子沒(méi)有特別限定，無(wú)論是來(lái)自哪一種生物的啟動(dòng)子，只要是在蠶細(xì)胞內(nèi)有效發(fā)揮功能的啟動(dòng)子都可以，最好是想辦法設(shè)計(jì)的能夠在蠶絲腺中特異誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)的啟動(dòng)子。例如，絲心蛋白H鏈啟動(dòng)子、絲心蛋白L鏈啟動(dòng)子、p25啟動(dòng)子、絲膠蛋白啟動(dòng)子等蠶絲腺蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子。另外，關(guān)于除了啟動(dòng)子以外使用的基因序列，可列舉信號(hào)序列、多聚A序列以及控制其他基因表達(dá)的序列等。這些沒(méi)有特別限定，可以選擇適合于目的蛋白質(zhì)表達(dá)的序列?？闪信e例如，貓干擾素o等細(xì)胞因子的信號(hào)序列或多聚A序列等來(lái)自目的蛋白質(zhì)的序列，宿主蠶等昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)的信號(hào)序列、多聚A序列。或者，可列舉在SV40多聚A或牛生長(zhǎng)激素多聚A等一般的蛋白質(zhì)表達(dá)中有實(shí)際成效的序列等。通過(guò)改變上述的啟動(dòng)子或與其他細(xì)胞因子類(lèi)基因連接的基因序列，可以對(duì)其進(jìn)行表達(dá)的部位或表達(dá)量進(jìn)行操作。在本發(fā)明中，所謂「外源蛋白質(zhì)的表達(dá)用基因[序列]盒」指的是在被導(dǎo)入昆蟲(chóng)細(xì)胞時(shí)為了使該外源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)所必需的DNA的序列組件。該外源蛋白質(zhì)表達(dá)[序列]盒含有外源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因和促進(jìn)該基因表達(dá)的啟動(dòng)子。通常還含有終止子、付加多聚A區(qū)、最好是含有啟動(dòng)子、外源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因、終止子、多聚A付加區(qū)全部。另外在與啟動(dòng)子之間也可以含有與外源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因結(jié)合的分泌信號(hào)基因。另外也可以連接人工設(shè)計(jì)、合成的基因序列。另外，所謂「基因?qū)胗没騕序列]盒」是在兩側(cè)含有1對(duì)piggyBac轉(zhuǎn)座子的反向重復(fù)序列的外源蛋白質(zhì)的表達(dá)用基因[序列]盒，而且是通過(guò)piggyBac轉(zhuǎn)座子的作用可以導(dǎo)入到昆蟲(chóng)細(xì)胞染色體的DNA盒。對(duì)獲得本發(fā)明中使用的DNA的方法沒(méi)有特別限制?？闪信e根據(jù)已知基因信息、使用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))法擴(kuò)增獲得必需的基因區(qū)的方法、根據(jù)已知基因信息以同源性為指標(biāo)從基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選的方法等。在本發(fā)明中，這些基因也包括遺傳多型性和使用變異劑等人為變異處理出現(xiàn)的變異型。所謂遺傳多型性指的是基因上由于自然突變使得基因的堿基序列一部分發(fā)生變化引起的現(xiàn)象。外源蛋白質(zhì)表達(dá)[序列]盒中的啟動(dòng)子沒(méi)有特別限定，最好是促進(jìn)外源蛋白質(zhì)基因表達(dá)活性高的啟動(dòng)子。例如，特開(kāi)平6-261770和特開(kāi)昭62-285787所述的果蠅熱休克9蛋白基因的啟動(dòng)子或蠶肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子(NatureBiotechnology,18，81-84，2000)等，絲心蛋白H鏈基因(GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄編號(hào)V00094的堿基編號(hào)255574)、絲心蛋白L鏈基因(Gene，100:151-158;GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄編號(hào)M76430)、絲膠蛋白基因的啟動(dòng)子(GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄編號(hào)AB007831的堿基編號(hào)5991656)等在蠶絲腺細(xì)胞中具有高促進(jìn)活性的啟動(dòng)子是合適的。所謂「外源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因」是要使基因表達(dá)的宿主細(xì)胞沒(méi)有的基因，就是編碼宿主細(xì)胞本身不產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的基因，沒(méi)有特別限定。從產(chǎn)業(yè)價(jià)值考慮，可列舉人和哺乳類(lèi)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、例如生長(zhǎng)激素、細(xì)胞因子、增殖因子和細(xì)胞骨架蛋白的基因等。另外，微生物、植物或昆蟲(chóng)等產(chǎn)生的酶或各種蛋白質(zhì)的基因等也包括在本發(fā)明的范圍中。在本發(fā)明中的外源蛋白質(zhì)表達(dá)用基因[序列]盒中，絲心蛋白H鏈的5'末端部分是具有通過(guò)啟動(dòng)子使外源蛋白質(zhì)基因的表達(dá)增強(qiáng)作用的DNA序列，是含有絲心蛋白H鏈基因的第1外顯子和第1內(nèi)含子的全長(zhǎng)或其一部分和第2外顯子的一部分的DNA序列。通過(guò)使外源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的5'側(cè)與該第2外顯子的3'側(cè)融合使得氨基酸讀框變成一列，可以使外源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量提高，如果第2外顯子部分過(guò)長(zhǎng)，由于在目的外源蛋白質(zhì)的N末端側(cè)付加多余的氨基酸殘基，有時(shí)會(huì)使目的外源蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或活性喪失，所以需要根據(jù)目的做成適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度。在多數(shù)場(chǎng)合下，通過(guò)將第2外顯子部分做成緊貼在絲心蛋白H鏈基因的分泌信號(hào)基因的后面或數(shù)個(gè)氨基酸殘基之前，可以獲得好的結(jié)果。另外，由于認(rèn)為在絲心蛋白H鏈基因啟動(dòng)子的5'側(cè)上游區(qū)，即在約5.5kbp上游區(qū)中存在增強(qiáng)啟動(dòng)子活性的區(qū)域，所以通過(guò)付加該區(qū)，可期待目的蛋白質(zhì)的表達(dá)量的增大。絲心蛋白H鏈基因的3'末端部分是在使外源蛋白質(zhì)在蠶絲腺中產(chǎn)生時(shí)，具有使外源蛋白質(zhì)大量分泌到絲腺細(xì)胞外的效果的DNA序列。在染色體導(dǎo)入了在3'側(cè)融合了作為向該蠶絲的分泌信號(hào)的絲心蛋白H鏈基因的3'末端部分的外源蛋白質(zhì)的表達(dá)用基因[序列]盒的重組蠶，可以在其蠶絲中產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)。另外，絲心蛋白H鏈基因的3'末端部分也可以存在于外源蛋白質(zhì)基因的上游、下游、外源蛋白質(zhì)基因中的任一處。在這一部分中，至少存在一個(gè)半胱氨酸殘基，直接利用絲心蛋白H鏈基因的3'末端時(shí)，半胱氨酸殘基應(yīng)當(dāng)位于從絲心蛋白H鏈蛋白質(zhì)的羧基端開(kāi)始的第20位處。該半胱氨酸具有通過(guò)二硫鍵與絲心蛋白L鏈結(jié)合的作用。絲心蛋白H鏈基因的3'末端部分的DNA序列的長(zhǎng)度只要不妨礙與絲心蛋白L鏈形成二硫鍵，則沒(méi)有特別限制。絲心蛋白H鏈由于在由3'末端開(kāi)始約100個(gè)堿基以上的上游連接著DNA的重復(fù)序列，所以該上游部分的DNA序列通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶切斷或加工成任意的長(zhǎng)度是困難的。因此，從基因工程的手法的難易程度考慮，絲心蛋白H鏈的3'末端部分最好使用絲心蛋白H鏈基因的重復(fù)DNA序列結(jié)束后的3'側(cè)的約100個(gè)堿基對(duì)。另外，如果絲心蛋白H鏈基因的3'末端部分長(zhǎng)，在外源蛋白質(zhì)的羧基末端或氨基末端就要結(jié)合很多來(lái)自絲心蛋白H鏈蛋白質(zhì)的羧基末端的氨基酸，有時(shí)目的外源蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或活性會(huì)喪失。因此，由于末端蛋白質(zhì)不同，絲心蛋白H鏈基因的3'末端部分的DNA序列有時(shí)需要盡可能做短。對(duì)于多聚A區(qū)也沒(méi)有特別限制，可適當(dāng)使用絲心蛋白H鏈、絲心蛋白L鏈、絲膠蛋白等在絲腺中可大量表達(dá)的蛋白質(zhì)基因的多聚A區(qū)。本發(fā)明中所謂的載體指的是具有環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)或線(xiàn)狀DNA結(jié)構(gòu)的載體?？蛇m當(dāng)使用特別是可以在大腸桿菌中復(fù)制，而具有環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)的載體。在這樣的載體中從容易進(jìn)行轉(zhuǎn)化體的挑選的目的出發(fā)，也可以整合抗生素抗性基因、來(lái)自水母的熒光綠色蛋白質(zhì)基因等標(biāo)記基因。在本發(fā)明中使用的所謂昆蟲(chóng)細(xì)胞雖然沒(méi)有特別限定，但優(yōu)選來(lái)自鱗翅目昆蟲(chóng)的，更優(yōu)選來(lái)自家蠶(Bombyxmori)的細(xì)胞，進(jìn)一步優(yōu)選的是來(lái)自蠶絲腺細(xì)胞或來(lái)自家蠶(Bombyxmori)的卵中含有的細(xì)胞。在絲腺細(xì)胞中，絲心蛋白質(zhì)的合成旺盛，而且操作容易的蠶5齡幼蟲(chóng)的后部絲腺細(xì)胞是合適的。對(duì)于向昆蟲(chóng)細(xì)胞導(dǎo)入外源蛋白質(zhì)的表達(dá)用基因[序列]盒和載體的方法沒(méi)有特別限制。作為向昆蟲(chóng)培養(yǎng)細(xì)胞導(dǎo)入的方法，可以使用磷酸鈣法，電穿孔法、利用脂質(zhì)體的方法、使用基因槍的方法、微注射方法等，在向蠶絲腺細(xì)胞的導(dǎo)入中，例如可以通過(guò)使用基因槍很簡(jiǎn)單地將基因?qū)霃男Q5齡幼蟲(chóng)的體內(nèi)取出的后部絲腺組織中。利用基因槍向后部絲腺導(dǎo)入基因，例如，可以將含有外源蛋白質(zhì)的表達(dá)用基因[序列]盒的載體進(jìn)行包被的金粒子用BioRad公司的粒子槍(型號(hào)PDS-1000/He)通過(guò)1，1001，800psi的He氣壓噴射到固定于瓊脂板等的后部絲腺。向家蠶(Bombyxmori)卵中含有的細(xì)胞導(dǎo)入基因時(shí)，微注射方法是合適的。其中向卵進(jìn)行微注射時(shí)，不需要直接向卵中的細(xì)胞進(jìn)行微注射，而可以只是通過(guò)微注射向卵中導(dǎo)入基因。通過(guò)將本發(fā)明的含有「基因?qū)胗没騕序列]盒」的載體微注射到家蠶(Bombyxmori)的卵中，可以獲得本發(fā)明的「外源蛋白質(zhì)的表達(dá)用基因[序列]盒」被導(dǎo)入到了染色體的重組蠶。例如，根據(jù)田村等人的方法(NatureBiotechnology,18，81-84，2000)，將含有「基因?qū)胗没騕序列]盒」的載體和在蠶肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子控制下配置了PiggyBac轉(zhuǎn)座酶基因的質(zhì)粒同時(shí)向家蠶的卵進(jìn)行微注射，飼養(yǎng)孵化的幼蟲(chóng)，將得到的成蟲(chóng)(GO)在組內(nèi)進(jìn)行交配，可以獲得次世代(Gl)蠶幼蟲(chóng)。重組蠶在該G1世代中出現(xiàn)的頻率通常為12%。重組蠶的挑選可以通過(guò)從G1世代蠶的組織的一部分取出DNA，通過(guò)使用外源蛋白質(zhì)基因?yàn)榛A(chǔ)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR實(shí)施。或者，預(yù)先在「基因?qū)胗没騕序列]盒」內(nèi)導(dǎo)入在蠶細(xì)胞中可表達(dá)的啟動(dòng)子的下游連接了編碼綠色熒光蛋白質(zhì)的基因，對(duì)G1世代蠶、例如1齡幼蟲(chóng)，通過(guò)挑選在紫外線(xiàn)下發(fā)綠色熒光的個(gè)體，可以很容易進(jìn)行重組蠶的挑選。另外，目的是要獲得「外源蛋白質(zhì)的表達(dá)用基因[序列]盒」被導(dǎo)入到染色體的重組蠶時(shí)，在將含有「基因?qū)胗没騕序列]盒」的載體向家蠶(Bombyxmori)的卵進(jìn)行微注射時(shí)，也可以通過(guò)同時(shí)微注射PiggyBac轉(zhuǎn)座酶蛋白質(zhì)，與上述同樣獲得重組蠶。所謂PiggyBac轉(zhuǎn)座酶是在兩端含有13個(gè)堿基對(duì)的反向序列和內(nèi)部含有約2.lk堿基對(duì)的0RF的DNA的轉(zhuǎn)位因子。在本發(fā)明中使用的PiggyBac轉(zhuǎn)座酶沒(méi)有特別限定，可以使用來(lái)自例如TrichoplusianicelllineTN_368、AutographacalifornicaNPV(AcNPV)、GalleriamelloneaNPV(GmMNPV)的PiggyBac轉(zhuǎn)座酶。優(yōu)選使用帶有來(lái)自TrichoplusianicelllineTN-368的PiggyBac的一部分的質(zhì)粒pHA3PIG和pPIGA3GPP(NatureBiotechnology，18，81-84，2000)，可以制備該基因和具有DNA轉(zhuǎn)移活性的PiggyBac轉(zhuǎn)座酶。作為來(lái)自PiggyBac的DNA序列的結(jié)構(gòu)，含有TTAA序列的1對(duì)末端反向序列是必需的，是具有在該DNA序列間插入了細(xì)胞因子基因等外源基因的結(jié)構(gòu)。為了利用來(lái)自轉(zhuǎn)座子的DNA序列將外源基因?qū)胄Q染色體，更優(yōu)選利用轉(zhuǎn)座酶。例如，通過(guò)同時(shí)導(dǎo)入可進(jìn)行來(lái)自piggyBac的轉(zhuǎn)座酶表達(dá)的DNA，在蠶細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄、翻譯的轉(zhuǎn)座酶識(shí)別2對(duì)末端反向序列后切出他們之間的基因片段，使其轉(zhuǎn)移到蠶染色體，可以使基因?qū)氲叫Q染色體的頻率顯著提高。本發(fā)明中使用的所謂基因重組蠶是染色體中導(dǎo)入了外源蛋白質(zhì)基因的蠶，是通過(guò)常規(guī)方法對(duì)該蠶染色體DNA進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶處理后，利用常規(guī)方法以標(biāo)記的外源蛋白質(zhì)基因作為探針，進(jìn)行Southern印跡法時(shí)，給出陽(yáng)性信號(hào)的蠶。導(dǎo)入細(xì)胞因子基因的染色體上的基因座位只要是不妨礙蠶的產(chǎn)生、分化、成長(zhǎng)的部位則沒(méi)有特別限制。重組蠶具有在其絲腺細(xì)胞、絲腺內(nèi)腔、以及蠶絲中產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)的能力。另外，重組蠶可以進(jìn)行正常發(fā)育、交配，可以穩(wěn)定保有導(dǎo)入的外源蛋白質(zhì)基因，而且可以傳遞給后代。因此，通過(guò)對(duì)重組蠶進(jìn)行繼代培養(yǎng)，增加頭數(shù)，可以很容易使外源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量做成規(guī)模。在交配中，通過(guò)與野生型的蠶進(jìn)行交配，也有可能使外源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量提高。此時(shí)，需要對(duì)導(dǎo)入了目的外源蛋白質(zhì)基因的蠶進(jìn)行適當(dāng)選擇的同時(shí)，進(jìn)行繼代培養(yǎng)。此時(shí)使用來(lái)自任意組織的細(xì)胞的DNA，通過(guò)PCR、Southern印跡法等對(duì)重組蠶挑選時(shí)使用的標(biāo)記基因和外源蛋白質(zhì)基因的存在以及結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，可以很容易對(duì)繼承了重組蠶基因的后代進(jìn)行判別。導(dǎo)入了本發(fā)明的外源蛋白質(zhì)的表達(dá)用基因[序列]盒的昆蟲(chóng)細(xì)胞和蠶絲腺通過(guò)在分別適于培養(yǎng)的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，在其培養(yǎng)上清或細(xì)胞中可以產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)。例如，導(dǎo)入了本發(fā)明的表達(dá)用基因[序列]盒的蠶卵巢細(xì)胞BmN細(xì)胞通過(guò)在TC-100培養(yǎng)基(77_$>-工>公司生產(chǎn))于27t:下進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)3至4日可以產(chǎn)生目的外源蛋白質(zhì)。另外，蠶后部絲腺，例如從5齡幼蟲(chóng)無(wú)菌條件下摘出后，通過(guò)在Grace昆蟲(chóng)培養(yǎng)基中，在25°C下進(jìn)行培養(yǎng)可以產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)。當(dāng)在絲腺產(chǎn)生蛋白質(zhì)時(shí)，最好是將培養(yǎng)基中的溶存氧濃度維持在很高，另外最好是將蓄積在培養(yǎng)基中的低分子的抑制蛋白質(zhì)合成的因子通過(guò)例如超濾膜等除去的同時(shí)，進(jìn)行培養(yǎng)，可以進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。導(dǎo)入了使本發(fā)明的絲心蛋白H鏈基因的3'末端部分融合的外源蛋白質(zhì)基因的絲腺可以在培養(yǎng)上清中大量產(chǎn)生目的外源蛋白質(zhì)。絲腺培養(yǎng)上清中的夾雜蛋白由于幾乎只是絲心蛋白，所以，從絲腺培養(yǎng)上清純化目的蛋白質(zhì)很容易，結(jié)果可以獲得高純度的目的蛋白質(zhì)。本發(fā)明中得到的重組蠶可以與通常的蠶同樣進(jìn)行飼養(yǎng)，通過(guò)在通常條件下進(jìn)行飼養(yǎng)可以使外源蛋白質(zhì)產(chǎn)生?？梢愿鶕?jù)目的外源蛋白質(zhì)的情況，特別是通過(guò)將5齡時(shí)期的培養(yǎng)溫度、濕度、給餌條件等進(jìn)行最適化，也可以使外源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量提高。導(dǎo)入了與本發(fā)明的絲心蛋白H鏈基因的3'末端部分融合的外源蛋白質(zhì)基因的重組蠶使得在蠶繭中大量生產(chǎn)目的外源蛋白質(zhì)成為可能?？梢院苋菀讖牡玫降男Q繭中純化、回收目的外源蛋白質(zhì)。另外，根據(jù)產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)的功能，可以將得到的含有外源蛋白質(zhì)的蠶絲以原有形式或以進(jìn)行部分加工的形式用于各種產(chǎn)業(yè)用途中。通過(guò)適當(dāng)?shù)奶崛〔僮骺梢詮脑诒景l(fā)明得到的重組蠶的絲腺或繭絲中獲得外源蛋白質(zhì)。對(duì)于為了從絲腺或繭絲中提取外源蛋白質(zhì)使用的溶劑沒(méi)有特別限制，但多數(shù)場(chǎng)合下，優(yōu)選水溶性溶劑。提取中使用的水溶液為了促進(jìn)外源蛋白質(zhì)的提取，可以含有合適的溶質(zhì)?？闪信e例如，磷酸等無(wú)機(jī)酸、醋酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸等有機(jī)酸、或食鹽、尿素、鹽酸胍、氯化鈣等鹽類(lèi)、乙醇、甲醇、乙腈、丙酮等極性有機(jī)溶劑等。另外，提取溶液的pH也沒(méi)有特別限定，只要是不使目的外源蛋白質(zhì)的功能失活的pH，可以使用任意的pH。用于分離、純化提取的外源蛋白質(zhì)的方法沒(méi)有特別限定，可以使用通常蛋白質(zhì)的純化方法。例如，以目的有用蛋白質(zhì)本來(lái)具有的功能作為指標(biāo)，通過(guò)使用硅膠載體、離子交換載體、凝膠過(guò)濾載體、鰲合性載體、帶有色素載體等的色譜、超濾、凝膠過(guò)濾、透析、鹽析等脫鹽、濃縮的組合可以進(jìn)行純化、分離。例如，貓干擾素"可以在將導(dǎo)入了貓干擾素"基因的蠶的絲腺或繭絲于20mM磷酸緩沖液(pH7.0)中進(jìn)行勻漿得到的可能性級(jí)分中回收。再通過(guò)將得到的提取液吸附于例如Blues印harose載體，洗凈后，用含有鹽類(lèi)的緩沖液進(jìn)行洗脫，可以使貓干擾素"的純度提高。這樣制造的細(xì)胞因子類(lèi)可以與以往的其他制造方法制造的細(xì)胞因子同樣用于醫(yī)藥和各種測(cè)定、診斷用途中。此時(shí)，也可以做成加入了各種添加劑的混合物使用。另外，表達(dá)細(xì)胞因子類(lèi)的蠶的組織、或繭絲可以直接或進(jìn)行加工后用于醫(yī)療或用作衣料的纖維。另外，表達(dá)酶類(lèi)的重組蠶的組織或蠶絲也可以直接用于酶反應(yīng)中。實(shí)施例以下給出實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體地說(shuō)明，但本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。參考例抗病毒活性測(cè)定法干擾素的生理活性作為抗病毒活性利用以下方法進(jìn)行測(cè)定。作為病毒使用VesicularStomatitisVirus(VSV)，作為感受性細(xì)胞對(duì)于貓干擾素"的情形使用貓F(tuán)c9細(xì)胞(J.K.Yamamoto等；Vet.Immunol,andlmmunopathol.，11，1-19，1986)，對(duì)于人干擾素|3使用人FL細(xì)胞，通過(guò)CPE法進(jìn)行測(cè)定。即，向鋪滿(mǎn)96孔微量反應(yīng)板的于37t:下培養(yǎng)的感受性細(xì)胞(上端的一行)加樣品稀釋液，向下端進(jìn)行各2倍的階段稀釋。于37t:下培養(yǎng)2024小時(shí)后，加VSV再于37t:下培養(yǎng)1620小時(shí)。存活下來(lái)附著在微量反應(yīng)板上的感受性細(xì)胞用含有20甲醛的龍膽紫染色液進(jìn)行染色，通過(guò)測(cè)定570nm的吸光度，將微量反應(yīng)板上的龍膽紫量與標(biāo)準(zhǔn)比較，求抗病毒活性。作為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于貓干擾素"使用將<>夕一*^'7卜(東麗(株)生產(chǎn))用細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基調(diào)整到1000Unit/ml后的溶液，對(duì)于人干擾素13使用將Feron[商品名](干擾素P)(東麗(株)生產(chǎn))用細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基調(diào)整到1000Unit/ml后的溶液。另外，樣品用細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基稀釋15倍后，用于抗病毒活性測(cè)定。實(shí)施例1.家蠶(Bombyxmori)基因組DNA的制備解剖5齡第3日的蠶，取出后部絲腺組織。用1XSSC洗凈后，加200y1的DNA提取緩沖液(50mMTris-HClpH8.0，lmMEDTApH8.0，100mMNaCl)。加蛋白酶K(終濃度200iig/ml)，用研磨機(jī)將組織充分磨碎，再加入350ii1DNA提取緩沖液，10%SDS60y1，混合后，在5(TC下保溫2小時(shí)。加Tris-HCl飽和酚pH8.0500yl，混合10分鐘后于10，000rpm、4°C下離心分離5分鐘，回收上清。向上清中加入等量的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)混合后，進(jìn)行離心分離。再次加等量的酚/氯仿/異戊醇，離心分離后回收上清，加入等量的氯仿/異戊醇(24:1)混合后，進(jìn)行離心分離，再次加入氯仿/異戊醇，離心分離后回收上清。向得到的上清中加1/10量的3M醋酸鈉(pH5.2)進(jìn)行混合，再加2.5倍量的冷乙醇，于-8(TC下靜置后，于15，000rpm、4。C下離心分離10分鐘，使基因組DNA沉淀。用70%乙醇將DNA沉淀洗凈后，使其風(fēng)干。用加有RNase的滅菌水溶解、稀釋成100yg/ml，制備基因組DNA溶液。實(shí)施例2.基因的制備使用的基因可以通過(guò)利用已知的序列制作其兩端序列的引物，以適當(dāng)?shù)腄NA源作為模板，進(jìn)行PCR獲得。在引物的端側(cè)付加用于下面的基因構(gòu)建操作的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)。貓干擾素"基因(GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄編號(hào)S62636的堿基編號(hào)9593)可以通過(guò)以編碼貓干擾素"基因的桿狀病毒rBNV100為模板，使用引物3(序列編號(hào)3)和引物4(序列編號(hào)4)2種引物進(jìn)行PCR獲得。從由例如E.Coli(pFeIFNI(微工研條寄第1633號(hào))提取的質(zhì)粒切出FeIFN基因，與蠶的克隆載體(T.Horiuchi等人，Agric.Biol.Chem.，51,1573-1580,1987)連接制作的重組質(zhì)粒，然后將該重組質(zhì)粒與蠶多[核殼體]核型多角體病毒DNA共轉(zhuǎn)染蠶樹(shù)立細(xì)胞中可制作rBNV100。絲膠蛋白-l基因的啟動(dòng)子(GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄編號(hào)AB007831的堿基編號(hào)5991656)是通過(guò)以蠶染色體DNA作為模板，使用引物5(序列編號(hào)5)和引物6(序列編號(hào)6)兩種引物通過(guò)PCR獲得的。絲心蛋白H鏈基因的啟動(dòng)子(GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄編號(hào)V00094的堿基編號(hào)255574是通過(guò)以蠶染色體DNA作為模板，使用引物7(序列編號(hào)7)和引物8(序列編號(hào)8)兩種引物通過(guò)PCR獲得的。牛生長(zhǎng)激素基因多聚A(pcDNA3.1(+)序列編號(hào)10111253)通過(guò)以質(zhì)粒pcDNA3.1(+)載體(Invitrogen公司生產(chǎn))為模板，使用引物9(序列編號(hào)9)和引物IO(序列編號(hào)IO)兩種引物通過(guò)PCR獲得的。PCR使用KODplus(東洋紡(株)生產(chǎn))，按照附帶的程序進(jìn)行。即，添加各種試劑，對(duì)于各個(gè)模板，如為質(zhì)粒時(shí)添加10ng，為染色體DNA時(shí)添加100ng，各個(gè)引物添加30pmo1、附帶的IOXPCR緩沖液10ii1，lmMMgCl2、0.2mMdNTPs、2單位KODplus，總量為100ii1。DNA的變性條件為94°CT15秒鐘，引物的退火條件為55°CT30秒鐘，延伸條件為68°C，3060秒鐘的條件下，使用Perkin-Elmer公司的DNA熱循環(huán)儀，進(jìn)行30循環(huán)反應(yīng)。將這些反應(yīng)液用11.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，按照常規(guī)方法分別提取、制備貓干擾素"基因中的約580bp、絲膠蛋白-1啟動(dòng)子中的約lkbp、絲心蛋白H鏈啟動(dòng)子中的約320bp、牛生長(zhǎng)激素基因多聚A中約230bp的DNA片段。將這些DNA片段通過(guò)多核苷酸激酶(寶酒造(株)生產(chǎn))進(jìn)行磷酸化后，使用寶酒造(株)的DNALigatonkitVer.2于16t:下進(jìn)行過(guò)夜反應(yīng)，與用HincII切斷后進(jìn)行了脫磷酸化處理的pUC19載體進(jìn)行連接。按照常規(guī)方法，使用連接的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，可以通過(guò)與上述同樣條件對(duì)得到菌落進(jìn)行PCR來(lái)確認(rèn)得到的轉(zhuǎn)化體中插入了PCR片段，通過(guò)常規(guī)方法制備插入了PCR片段的質(zhì)粒。通過(guò)對(duì)這些質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)得到的片段是各個(gè)基因的堿基序列。實(shí)施例3.基因?qū)胗觅|(zhì)粒的制作對(duì)于基因?qū)胗觅|(zhì)?？梢允褂胮igA3GFP(NatureBiotechnology18，81-84，2000)。即，從美國(guó)專(zhuān)利第6218185號(hào)公布的質(zhì)粒p3E1.2中將編碼轉(zhuǎn)座酶的區(qū)域除去，向該部分插入了A3啟動(dòng)子(GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄編號(hào)U49854的堿基編號(hào)17642595)和來(lái)自pEGFP-N1載體(Clontech公司生產(chǎn))的GFP和來(lái)自SV40的多聚A付加序歹lj(GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄編號(hào)U55762的堿基編號(hào)6592578)的載體是pigA3GFP(NatureBiotechnology18，81-84，2000)。將貓干擾素"基因的表達(dá)單位插入到位于該A3啟動(dòng)子的上游側(cè)的XhoI部位。作為進(jìn)行導(dǎo)入的基因的表達(dá)單位使用絲膠蛋白-l基因啟動(dòng)子-貓干擾素"-牛生長(zhǎng)激素多聚A付加序列(序列編號(hào)l)、或絲心蛋白H鏈基因啟動(dòng)子-貓干擾素"-牛生長(zhǎng)激素多聚A付加序列(序列編號(hào)2)。以下給出具體的方法。利用預(yù)先設(shè)定在引物內(nèi)的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)從實(shí)施例2制備的質(zhì)粒中切出基因。即，如果是絲膠蛋白-1基因啟動(dòng)子和絲心蛋白H鏈基因啟動(dòng)子使用EcoRI，SalI，如果是貓干擾素"基因使用SalI，XbaI，如果是牛生長(zhǎng)激素多聚A使用XbaI，BamHI，切出插入片段，用11.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后，通過(guò)常規(guī)方法提取、純化片段。將絲膠蛋白-1基因啟動(dòng)子片段200ng、貓干擾素"基因片段100ng、牛生長(zhǎng)激素多聚A50ng進(jìn)行混合，加等量的寶酒造(株)的DNALigatonkitVer.2于16。C下進(jìn)行過(guò)夜反應(yīng)。對(duì)反應(yīng)液0.5iU使用引物ll(序列編號(hào)11)和引物12(序列編號(hào)12)在與實(shí)施例2同樣的條件下，延伸條件2分鐘進(jìn)行PCR。將這些反應(yīng)液用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，通過(guò)常規(guī)方法提取、調(diào)制擴(kuò)增的約1.9kb的DNA片段(SIB片段)。同樣將絲心蛋白H鏈基因啟動(dòng)子片段70ng、貓干擾素"基因片段100ng、牛生長(zhǎng)激素多聚A50ng進(jìn)行混合，加等量的寶酒造(株)的DNALigatonkitVer.2于16"下進(jìn)行過(guò)夜反應(yīng)。對(duì)反應(yīng)液0.5iU使用引物13(序列編號(hào)13)和引物12(序列編號(hào)12)在與實(shí)施例1同樣的條件下，延伸條件2分鐘進(jìn)行PCR。將這些反應(yīng)液用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，通過(guò)常規(guī)方法提取、調(diào)制擴(kuò)增的約1.15kb的DNA片段(FIB片段)。這些片段經(jīng)Xhol消化后，使用寶酒造(株)的DNALigatonkitVer.2，于16°C下進(jìn)行過(guò)夜反應(yīng)，與用Xhol切斷后進(jìn)行了脫磷酸化處理的pigA3GFP進(jìn)行連接。將插入了SIB片段的質(zhì)粒定為pigSIB(圖1)，將插入了FIB片段的質(zhì)粒定為pigFIB(圖2)，通過(guò)氯化銫超離心2次，進(jìn)行純化，用于基因?qū)雽?shí)驗(yàn)。實(shí)施例4.基因重組蠶的制作(絲心蛋白H鏈基因啟動(dòng)子)用0.5mM磷酸緩沖液(pH7.0)、5mMKC1將pigFIB和輔助質(zhì)粒pHA3PIG(圖3、NatureBiotechnology18，81-84，2000)分別調(diào)整到200ng/ml的濃度，將其中的15_20nl微注射入產(chǎn)卵后4小時(shí)以?xún)?nèi)的蠶卵中。對(duì)由這樣的卵孵化的幼蟲(chóng)進(jìn)行飼養(yǎng)，得到的成蟲(chóng)(GO)在組內(nèi)進(jìn)行交配得到的次世代(Gl)，通過(guò)對(duì)與貓干擾素"基因同時(shí)導(dǎo)入的綠色熒光蛋白質(zhì)的熒光進(jìn)行觀(guān)察，從G1中篩選染色體導(dǎo)入了貓干擾素"基因的蠶。表l給出了導(dǎo)入基因蠶得到的蛾區(qū)的比例。對(duì)蠶卵實(shí)施2次注射，在第2次由1蛾區(qū)得到了基因重組蠶。表l.基因重組蠶的獲得狀況(絲心蛋白重鏈啟動(dòng)子)實(shí)驗(yàn)區(qū)注射卵數(shù)孵化卵數(shù)成蟲(chóng)數(shù)同胞交配蛾數(shù)貓干擾素co基因陽(yáng)性蛾區(qū)數(shù)112152922201000213263742501231圖4給出了從該蛾區(qū)得到的基因重組蠶的Southern印跡法的結(jié)果。Southern印跡法是通過(guò)從G1世代的蛾提取染色體DNA，將進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶處理的樣品進(jìn)行電泳后，使用貓干擾素"特異的核酸探針通過(guò)使用AlkphosDirectLabellingandDetection15System(AmershamPharmacia)的化學(xué)發(fā)光對(duì)使DNA轉(zhuǎn)印的膜進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)G1蛾11頭研究結(jié)果可以確認(rèn)10頭蠶中導(dǎo)入了貓干擾素"基因。實(shí)施例5.貓干擾素產(chǎn)生的確認(rèn)(絲心蛋白H鏈啟動(dòng)子)貓干擾素"由于具有抗病毒活性，由其效價(jià)可以知道貓干擾素"的存在。在將實(shí)施例4得到的陽(yáng)性蛾區(qū)的蠶(Gl)與野生蠶交配得到的世代(G2)中，摘出確認(rèn)貓干擾素"基因?qū)氲男Q的5齡幼蟲(chóng)的中部絲腺和后部絲腺。用20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)對(duì)這些絲腺進(jìn)行勻漿，通過(guò)使用貓細(xì)胞的抗病毒活性測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定得到的提取液。結(jié)果由導(dǎo)入基因蠶的絲腺提取液中對(duì)中部絲腺、后部絲腺都檢測(cè)到抗病毒活性，但從作為對(duì)照的野生蠶的絲腺提取液中沒(méi)有檢測(cè)到抗病毒活性。圖5給出了測(cè)定結(jié)果。認(rèn)為在絲心蛋白H鏈啟動(dòng)子調(diào)控下，貓干擾素"主要在后部絲腺中被表達(dá)，然后與絲心蛋白同樣移動(dòng)到中部、前部絲腺，生理活性的分布也與此一致。另外，從沒(méi)有導(dǎo)入基因的蠶中完全沒(méi)有檢測(cè)到抗病毒活性。由此表明在導(dǎo)入貓干擾素o基因的蠶中，貓干擾素"蛋白質(zhì)是保持著生理活性表達(dá)的。實(shí)施例6.貓干擾素的純化由實(shí)施例5得到的G2世代5齡蠶的后部絲腺的提取液進(jìn)行貓干擾素的純化。將提取液1ml通過(guò)HiTrapBlues印harose柱(Amershampharmacia公司生產(chǎn))，然后用10ml的20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)洗凈。然后連續(xù)用10ml的20mM磷酸鈉緩沖液(pH8.O)-O.5MNaCl，再用10ml的20mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)-lMNaCl進(jìn)行洗脫。分別收集清洗級(jí)分、0.5M洗脫級(jí)分、以及1M洗脫級(jí)分，進(jìn)行脫鹽、濃縮到約lml。表2給出了提取液和各個(gè)純化級(jí)分的抗病毒活性和蛋白質(zhì)定量。表2.通過(guò)Blues印harose層析進(jìn)行的貓干擾素"的純化<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>通過(guò)純化操作，在1M洗脫級(jí)分可回收抗病毒活性，即貓干擾素"，其比活性與提取液相比，約為10倍。實(shí)施例7.基因重組蠶的制作(絲膠蛋白1啟動(dòng)子)用0.5mM磷酸緩沖液(pH7.0)、5mMKC1將pigSIB和輔助質(zhì)粒分別調(diào)整到200ng/ml的濃度，將其中15-20nl微注射入產(chǎn)卵后4小時(shí)以?xún)?nèi)的蠶卵中。對(duì)由這樣的卵孵化的幼蟲(chóng)進(jìn)行飼養(yǎng)，通過(guò)對(duì)來(lái)自得到的成蟲(chóng)(GO)在內(nèi)進(jìn)行交配得到的次世代(Gl)的綠色熒光蛋白質(zhì)的熒光進(jìn)行觀(guān)察，研究貓干擾素o基因向染色體導(dǎo)入的情況。在2次實(shí)驗(yàn)中，對(duì)1218和1375個(gè)卵分別微注射含有與絲膠蛋白啟動(dòng)子連接的貓干擾素"基因的基因重組載體，分別可以得到各12個(gè)蛾區(qū)的陽(yáng)性蛾區(qū)(表3)。表3.基因重組蠶的獲得狀況(絲膠蛋白啟動(dòng)子)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>在得到的陽(yáng)性蛾區(qū)中，從第1次實(shí)驗(yàn)的3蛾區(qū)、第2次實(shí)驗(yàn)的2蛾區(qū)分別各挑選1頭確認(rèn)導(dǎo)入了基因的蠶(Gl)，由其絲腺中提取基因組DNA。然后用EcoRI和BglII進(jìn)行處理后，將貓干擾素"基因作為探針，進(jìn)行Southern印跡法解析，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果確認(rèn)所有的蠶的基因組中都導(dǎo)入了貓干擾素"基因。另外由于檢測(cè)位置的不同，可知由于蛾區(qū)不同，基因向基因組導(dǎo)入的基因?qū)氩课徊煌?。然后研究貓干擾素"基因的mRNA表達(dá)。任意挑選7頭通過(guò)Southern印跡法確認(rèn)貓干擾素"基因?qū)氲腉l世代蠶，提取他們的mRNA，通過(guò)RT-PCR研究貓干擾素"基因mRNA的表達(dá)。在mRNA的提取、純化中使用IS0GEN(二'7水>-一>)和OligotexdT30(口-〉工亍、7夕"乂于<夕)，對(duì)于cDNA合成使用Ready-To-GoT—PrimedFirst—StrandKit(AmershamPharmacia)，按照附帶的程序進(jìn)行。PCR在實(shí)施例2的貓干擾素"基因獲得時(shí)的條件下進(jìn)行，結(jié)果確認(rèn)所有蠶都有貓干擾素"基因的mRNA的表達(dá)(圖7)。實(shí)施例8.在中部絲腺和繭絲中貓干擾素產(chǎn)生的確認(rèn)摘出實(shí)施例7得到的基因重組蠶3頭、野生蠶1頭的中部絲腺，用20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)進(jìn)行勻漿，離心分離制備提取液。另外就來(lái)自基因重組蠶和野生蠶的繭各1個(gè)也同樣進(jìn)行提取。對(duì)這些提取液進(jìn)行抗病毒測(cè)定，結(jié)果由所有的重組蠶的中部絲腺檢測(cè)到抗病毒活性，而從野生蠶的絲腺中沒(méi)有檢測(cè)到。另外從基因重組蠶的繭中也檢測(cè)到了抗病毒活性(圖8)。由結(jié)果可知在基因重組蠶中貓干擾素"保持著原有生理活性進(jìn)行表達(dá)，即使以絲吐出也殘存著其活性。實(shí)施例9.人干擾素13基因?qū)胗觅|(zhì)粒的制作人干擾素|3基因?qū)胗觅|(zhì)粒的制作通過(guò)與實(shí)施例2至4所示的貓干擾素"基因的場(chǎng)合同樣的方法進(jìn)行。g卩，以編碼人干擾素13基因的質(zhì)粒p0RF-hlFN-l3(Invivogen公司)為模板，使用引物14(序列編號(hào)14)和引物15(序列編號(hào)15)進(jìn)行PCR，得到人干擾素13基因片段。該片段經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶Sail和Xbal處理后，構(gòu)建含有5'末端側(cè)連接絲心蛋白H鏈基因啟動(dòng)子或絲膠蛋白基因啟動(dòng)子，3'末端側(cè)連接來(lái)自牛生長(zhǎng)激素基因的多聚A信號(hào)的基因表達(dá)用序列(絲心蛋白H鏈基因啟動(dòng)子-人干擾素13基因-牛生長(zhǎng)激素基因多聚A信號(hào)(FhIB):序列16、絲膠蛋白基因啟動(dòng)子-人干擾素13基因-牛生長(zhǎng)激素基因多聚A信號(hào)(ShIB):序列17)的質(zhì)粒。由這些質(zhì)粒分別通過(guò)XhoI處理切出上述基因表達(dá)用序列FhIB和ShIB，與用Xhol切斷后進(jìn)行了脫磷酸化處理的pigA3GFP進(jìn)行連接。將插入了FhIB片段的質(zhì)粒定為pigFhIB，將插入了ShIB片段的質(zhì)粒定為pigShIB，通過(guò)氯化銫法超離心2次，進(jìn)行純化，用于基因?qū)雽?shí)驗(yàn)。實(shí)施例10.人干擾素13基因重組蠶的制作人干擾素13基因重組蠶的制作通過(guò)使用實(shí)施例9中制作的基因?qū)胗觅|(zhì)粒，與實(shí)施例4所示的貓干擾素"基因重組蠶的制作同樣的方法進(jìn)行。g卩，將pigFhIB和pigShIB分別與輔助質(zhì)粒pHA3PIG—起微注射到蠶卵中，對(duì)得到的成蟲(chóng)進(jìn)行交配得到的次世代進(jìn)行篩選。當(dāng)對(duì)各600個(gè)卵進(jìn)行微注射時(shí)，由pigFhIB導(dǎo)入蠶中7蛾區(qū)，pigShlB導(dǎo)入蠶中5蛾區(qū)得到綠色熒光陽(yáng)性的蠶，通過(guò)PCR確認(rèn)基因?qū)肴旧w。采取這些蠶的絲腺和蠶絲，使用其提取液，測(cè)定作為人干擾素13的生理活性的抗病毒活性。測(cè)定值用樣品中的全蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行修正后表示。表4.人干擾素13基因重組蠶組織提取液中的抗病毒活性啟動(dòng)子蛾區(qū)編號(hào)-抗病毒活性(單位/g蛋白質(zhì))個(gè)體編號(hào)后部絲腺中部絲腺蠶絲絲心蛋白H鏈3-1599723825913-265611041545未試驗(yàn)11-l5027501985911-211556039130絲膠蛋白1-l53884421871-2未試驗(yàn)6489531017135-14372911332885-254110692749正常蠶未檢出未檢出未檢出檢測(cè)限界約1000單位/g蛋白質(zhì)結(jié)果由于由pigFhIB導(dǎo)入蠶的后部絲腺和中部絲腺檢測(cè)到抗病毒活性，由pigShIB導(dǎo)入蠶的中部絲腺和蠶絲檢測(cè)到抗病毒活性，可以確認(rèn)人干擾素13在蠶絲腺組織中產(chǎn)生。實(shí)施例11.貓粒細(xì)胞菌落剌激因子基因?qū)胗觅|(zhì)粒的制作貓粒細(xì)胞菌落剌激因子基因?qū)胗觅|(zhì)粒的制作通過(guò)與實(shí)施例2至4所示的貓干擾素"基因的場(chǎng)合同樣的方法進(jìn)行。貓粒細(xì)胞菌落剌激因子基因根據(jù)Yamamoto等人的報(bào)告(Gene，274，263-269，182001)，使用引物18(序列編號(hào)18)和引物19(序列編號(hào)19)從用lOiig/ml的LPS剌激24小時(shí)的CRFK細(xì)胞得到的cDNA進(jìn)行PCR，得到貓粒細(xì)胞菌落剌激因子基因片段。該片段經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶SalI和Xbal處理后，構(gòu)建含有5'末端側(cè)連接絲心蛋白H鏈基因啟動(dòng)子或絲膠蛋白基因啟動(dòng)子，3'末端側(cè)連接來(lái)自牛生長(zhǎng)激素基因的多聚A信號(hào)肽的基因表達(dá)用序列(絲心蛋白H鏈基因啟動(dòng)子-貓粒細(xì)胞菌落剌激因子基因_牛生長(zhǎng)激素基因多聚A信號(hào)(FGB):序列20、絲膠蛋白基因啟動(dòng)子-貓粒細(xì)胞菌落剌激因子基因_牛生長(zhǎng)激素基因多聚A信號(hào)(SGB):序列21)的質(zhì)粒。由這些質(zhì)粒分別通過(guò)XhoI處理切出上述基因表達(dá)用序列FGB和SGB，與用Xhol切后進(jìn)行脫磷酸化處理的pigA3GFP進(jìn)行連接。將插入了FGB片段的質(zhì)粒定為pigFGB，將插入了SGB片段的質(zhì)粒定為pigSGB，通過(guò)氯化銫法超離心2次，進(jìn)行純化，用于基因?qū)雽?shí)驗(yàn)。實(shí)施例12.貓粒細(xì)胞菌落剌激因子基因重組蠶的制作貓粒細(xì)胞菌落剌激因子基因重組蠶的制作通過(guò)使用實(shí)施例11中制作的基因?qū)胗觅|(zhì)粒，與實(shí)施例4所示的貓干擾素"基因重組蠶的制作同樣的方法進(jìn)行。g卩，將pigFGB和pigSGB分別與輔助質(zhì)粒pHA3PIG—起微注射到蠶卵中，對(duì)得到的成蟲(chóng)進(jìn)行交配得到的次世代進(jìn)行篩選。當(dāng)對(duì)各600個(gè)卵進(jìn)行微注射時(shí)，由pigFGB導(dǎo)入蠶中3蛾區(qū)，pigSGB導(dǎo)入蠶中7蛾區(qū)得到綠色熒光陽(yáng)性的蠶，通過(guò)PCR確認(rèn)基因?qū)肴旧w。采取這些蠶的絲腺和蠶絲，使用其提取液，測(cè)定作為貓粒細(xì)胞菌落剌激因子的生理活性的NFS-60細(xì)胞(ATCC)的增殖促進(jìn)活性。增殖促進(jìn)活性的測(cè)定如下那樣進(jìn)行。首先將NFS-60細(xì)胞在沒(méi)有M-CSF存在下鋪在96孔板，每孔2乂104個(gè)，30分鐘后力口10iU樣品，再培養(yǎng)24小時(shí)，然后使用Ce11CountingKit-8(Dojindo)測(cè)定細(xì)胞增殖活性。將表現(xiàn)出增殖最大效果的50%的樣品量(ED50)作為1單位/ml，乘以稀釋倍數(shù)，算出樣品中的生理活性。值用樣品中的總蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行修正后表示。表5.貓粒細(xì)胞菌落剌激因子基因重組蠶組織提取液中的增殖促進(jìn)活性<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>檢測(cè)限界約20單位/g蛋白質(zhì)結(jié)果由于由pigFGB導(dǎo)入蠶的后部絲腺和中部絲腺檢測(cè)到增殖促進(jìn)活性，由pigSGB導(dǎo)入蠶的中部絲腺和蠶絲檢測(cè)到增殖促進(jìn)活性，可以確認(rèn)貓粒細(xì)胞菌落剌激因子在蠶絲腺組織中產(chǎn)生。實(shí)施例13.基因制備以下，以貓干擾素"作為生理活性蛋白質(zhì)的模型，進(jìn)行在絲腺組織和蠶絲中的產(chǎn)量提高研究。使用的基因可以通過(guò)利用已知的序列制作其兩端序列的引物，以適當(dāng)?shù)腄NA源作為模板，進(jìn)行PCR獲得。在引物的端側(cè)付加用于下面的基因構(gòu)建操作的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)。絲心蛋白H鏈啟動(dòng)子(GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄編號(hào)AF226688的堿基編號(hào)6211862437:以下稱(chēng)為P區(qū))是通過(guò)以家蠶(Bombyxmori)genomiDNA作為模板，使用引物25(序列編號(hào)25)和引物26(序列編號(hào)26)兩種引物通過(guò)PCR獲得的。絲心蛋白H鏈的啟動(dòng)子絲心蛋白H鏈基因第一外顯子第一內(nèi)含子區(qū)第二外顯子區(qū)(GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄編號(hào)AF226688的堿基編號(hào)6211863513:以下稱(chēng)為HP區(qū))是通過(guò)以家蠶(Bombyxmori)genomiDNA作為模板，使用引物25(序列編號(hào)25)和引物31(序列編號(hào)31)兩種引物通過(guò)PCR獲得的。絲心蛋白H鏈上游啟動(dòng)子*絲心蛋白H鏈基因第一外顯子*第一內(nèi)含子(GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄編號(hào)AF226688的堿基編號(hào)5744462927:以下稱(chēng)為HUP區(qū))是通過(guò)以Bombyxmorige謹(jǐn)iDNA作為模板，使用引物33(序列編號(hào)33)和引物34(序列編號(hào)34)兩種引物通過(guò)PCR獲得的。貓干擾素"基因(GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄編號(hào)S62636的堿基編號(hào)9593:以下稱(chēng)為IC區(qū))可以通過(guò)以編碼貓干擾素"基因的桿狀病毒rBNV100為模板，使用引物27(序列編號(hào)27)和引物28(序列編號(hào)28)2種引物進(jìn)行PCR獲得。從由例如E.Coli(pFeIFNl(微工研條寄第1633號(hào))提取的質(zhì)粒切出貓干擾素"的基因，與蠶的克隆載體(T.Horiuchi等人，Agric.Biol.Chem.，51，1573-1580，1987)連接制作重組質(zhì)粒，然后將該重組質(zhì)粒與蠶多[核殼體]核型多角體病毒DNA共轉(zhuǎn)染蠶樹(shù)立細(xì)胞可制作rBNVlOO。絲心蛋白H鏈多聚A信號(hào)區(qū)(GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄編號(hào)AF226688的堿基編號(hào)7920179995:以下稱(chēng)為A區(qū))是通過(guò)以家蠶(Bombyxmori)genomiDNA作為模板，使用引物29(序列編號(hào)29)和引物30(序列編號(hào)30)兩種引物通過(guò)PCR獲得的。絲心蛋白H鏈C末端區(qū)基因絲心蛋白H鏈多聚A信號(hào)區(qū)(GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄編號(hào)AF226688的堿基編號(hào)7909979995:以下稱(chēng)為HA區(qū))是通過(guò)以家蠶(Bombyxmori)genomiDNA作為模板，使用引物32(序列編號(hào)32)和引物30(序列編號(hào)30)兩種引物通過(guò)PCR獲得的。P-半乳糖苷酶(P-gal)基因是以pPgal-Basicvector(Clontech公司)為模板，使用引物37(序列編號(hào)37)和引物38(序列編號(hào)38)兩種引物通過(guò)PCR獲得的。PCR使用K0Dplus(東洋紡(株)生產(chǎn))，按照附帶的程序進(jìn)行。即，添加各種試劑，對(duì)于各個(gè)模板，如為家蠶(Bombyxmori)genomiDNA時(shí)添力B100ng，為家蠶(Bombyxmori)后部絲腺cDNA和pPgal-Basicvector時(shí)添加10ng，各個(gè)引物添加50pmol、附帶的10XPCR緩沖液10ii1，ImMMgCl2、0.2mMdNTPs、2單位K0Dplus，總量為100ii1。DNA的變性條件為94°CT15秒鐘，引物的退火條件為55°CT30秒鐘，延伸條件為68°C，60300秒鐘的條件下，使用Perkin-Elmer公司的DNA熱循環(huán)儀，進(jìn)行30循環(huán)反應(yīng)。將這些反應(yīng)液用1X瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，按照常規(guī)方法提取、制備P區(qū)中的約0.3kbp、HP區(qū)中的約1.4kbp、HUP區(qū)中的約5.5kbp、IC區(qū)中的約580bp、A區(qū)中的約0.8bp、HA區(qū)中的約0.9bp、P-gal基因中約3.2kbp的DNA片段。將這些DNA片段通過(guò)多核苷酸激酶(寶酒造(株))進(jìn)行磷酸化后，使用寶酒造(株)的DNALigatonkitVer.2于16°C下進(jìn)行過(guò)夜反應(yīng)，與用HincII切后進(jìn)行脫磷酸化處理的pUC19載體進(jìn)行連接。按照常規(guī)方法，使用連接的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，可以通過(guò)與上述同樣條件對(duì)得到菌落進(jìn)行PCR確認(rèn)得到的轉(zhuǎn)化體插入了PCR片段，通過(guò)常規(guī)方法制備插入了PCR片段的質(zhì)粒。通過(guò)對(duì)這些質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)得到的片段是各個(gè)基因的堿基序列。實(shí)施例14.13-半乳糖苷酶表達(dá)用質(zhì)粒的制作將實(shí)施例13制備的帶有13-gal基因的質(zhì)粒用SalI和HindIII切斷，然后插入通過(guò)SalI和HindIII從帶有絲心蛋白H鏈啟動(dòng)子的質(zhì)粒切出的約0.3kbp片段(P區(qū))。再經(jīng)BamHI切斷，插入通過(guò)BamHI從帶有絲心蛋白H鏈多聚A信號(hào)區(qū)的質(zhì)粒切出的約0.8kbp片段(A區(qū))，使用QIAGENPlasmidMaxiKit,按照附帶的程序?qū)Φ玫降膸в蠵-gal基因的質(zhì)粒進(jìn)行純化。得到的質(zhì)粒命名為pPgalA，通過(guò)PCR和測(cè)序確認(rèn)目的質(zhì)粒。同樣將實(shí)施例13制備的帶有P-gal基因的質(zhì)粒用SalI和HindIII切斷，然后插入通過(guò)SalI和HindIII從帶有絲心蛋白H鏈啟動(dòng)子.絲心蛋白H鏈基因第一外顯子*第一內(nèi)含子*第二外顯子區(qū)的質(zhì)粒切出的約1.4kbp片段(HP區(qū))。再經(jīng)BamHI切斷，插入通過(guò)BamHI從帶有絲心蛋白H鏈C末端區(qū)絲心蛋白H鏈多聚A信號(hào)區(qū)的質(zhì)粒切出的約0.9kbp片段(HA區(qū))，使用QIAGENPlasmidMaxiKit,按照附帶的程序?qū)Φ玫降膸в蠵-gal基因的質(zhì)粒進(jìn)行純化。得到的質(zhì)粒命名為pHPgalHA，通過(guò)PCR和測(cè)序確認(rèn)目的質(zhì)粒。實(shí)施例15.基因?qū)胗觅|(zhì)粒的制作對(duì)于基因?qū)胗觅|(zhì)?？梢允褂胮igA3GFP(NatureBiotechnology18，81-84，2000)。即，從美國(guó)專(zhuān)利第6218185號(hào)公布的質(zhì)粒p3E1.2中將編碼轉(zhuǎn)座酶的區(qū)域除去，向該部分插入了A3啟動(dòng)子(GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄編號(hào)U49854的堿基編號(hào)17642595)和來(lái)自pEGFP-N1載體(Clontech公司生產(chǎn))的GFP和來(lái)自SV40的多聚A付加序歹lj(GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄編號(hào)U55762的堿基編號(hào)6592578)的載體是pigA3GFP。對(duì)處于該A3啟動(dòng)子的上游側(cè)的XhoI部位進(jìn)行鈍端化，插入貓干擾素"基因表達(dá)[序列]盒。本實(shí)施例中的基因表達(dá)[序列]盒的構(gòu)成是絲心蛋白H鏈啟動(dòng)子貓干擾素"基因絲心蛋白H鏈多聚A信號(hào)區(qū)(P.IC.A)，或絲心蛋白H鏈啟動(dòng)子絲心蛋白H鏈基因第一外顯子第一內(nèi)含子第二外顯子區(qū)貓干擾素"基因絲心蛋白H鏈C末端區(qū)絲心蛋白H鏈多聚A信號(hào)區(qū)(HP.IC.HA)，或絲心蛋白H鏈上游啟動(dòng)子絲心蛋白H鏈基因第一外顯子第一內(nèi)含子第二外顯子區(qū)貓干擾素"絲心蛋白H鏈C末端區(qū)絲心蛋白H鏈多聚A信號(hào)區(qū)(HUP.IC.HA)，或絲心蛋白H鏈啟動(dòng)子絲心蛋白H鏈基因第一外顯子第一內(nèi)含子第二外顯子區(qū)貓干擾素"絲心蛋白H鏈多聚A信號(hào)區(qū)(HP.IC.A)。以下給出了具體的方法。P.IC.A構(gòu)建物的制作通過(guò)以下手法進(jìn)行。將實(shí)施例13制備的帶有貓干擾素"(IC區(qū))的質(zhì)粒用SalI和HindIII切斷，然后插入通過(guò)SalI和HindIII從帶有絲心蛋白H鏈啟動(dòng)子的質(zhì)粒切出的約0.3kbp片段(P區(qū))。再經(jīng)BamHI切斷，插入通過(guò)BamHI從帶有絲心蛋白H鏈多聚A信號(hào)區(qū)的質(zhì)粒切出的約0.8kbp片段(A區(qū))，將該帶有P.IC.A的質(zhì)粒用AscI切斷，將切出的約1.7kbp片段通過(guò)寶酒造(株)T4DNA聚合酶進(jìn)行鈍端化后的片段與用Xhol切斷后鈍端化、進(jìn)行了脫磷酸化處理的pigA3GFP連接，制作含有P.IC.A基因[序列]盒的基因?qū)胗脴?gòu)建物。圖9和圖IO給出了構(gòu)建的手法。HP.IC.HA構(gòu)建物的制作通過(guò)以下手法進(jìn)行。將實(shí)施例13制備的帶有貓干擾素"(IC區(qū))的質(zhì)粒用SalI和HindIII切斷，然后插入通過(guò)SalI和HindIII從帶有絲心蛋白H鏈啟動(dòng)子絲心蛋白H鏈基因第一外顯子第一內(nèi)含子第二外顯子區(qū)的質(zhì)粒切出的約1.4kbp片段(HP區(qū))。再經(jīng)BamHI切斷，插入通過(guò)BamHI從帶有絲心蛋白H鏈C末端區(qū)絲心蛋白H鏈多聚A信號(hào)區(qū)的質(zhì)粒切出的約0.9kbp片段(HA區(qū))。將帶有該HP.IC.HA的質(zhì)粒用AscI切斷，將切出的約2.9kbp片段通過(guò)寶酒造(株)T4DNA聚合酶進(jìn)行鈍端化后的片段與用XhoI切斷后鈍端化、進(jìn)行脫磷酸化處理的pigA3GFP連接，制作含有HP.IC.HA基因[序列]盒的基因?qū)胗脴?gòu)建物。圖ll和圖12給出了構(gòu)建的手法。HUP.IC.HA構(gòu)建物的制作通過(guò)以下手法進(jìn)行。通過(guò)以HP.IC.HA構(gòu)建物lng為模板，使用引物35(序列編號(hào)35)和引物36(序列編號(hào)36)兩種引物進(jìn)行PCR，獲得絲心蛋白H鏈第一內(nèi)含子第二外顯子區(qū)貓干擾素"絲心蛋白H鏈C末端區(qū)絲心蛋白H鏈多聚A信號(hào)區(qū)約2.lkbp。然后用XhoI和SphI切斷，插入通過(guò)XhoI和SphI從帶有絲心蛋白H鏈上游啟動(dòng)子*絲心蛋白H鏈基因第一外顯子*第一內(nèi)含子的質(zhì)粒切出的約5.5kbp片段(HUP區(qū))。將這個(gè)帶有HUP.IC.HA的質(zhì)粒用AscI切斷，將切出的約7.6kbp片段通過(guò)寶酒造(株)T4DNA聚合酶進(jìn)行鈍端化后的片段與用Xhol切斷后鈍端化、進(jìn)行脫磷酸化處理的pigA3GFP連接，制作含有HUP.IC.HA基因[序列]盒的基因?qū)胗脴?gòu)建物。圖13和圖14給出了構(gòu)建的手法。HP.IC.A構(gòu)建物的制作通過(guò)以下手法進(jìn)行。將實(shí)施例13制備的帶有貓干擾素22"(IC區(qū))的質(zhì)粒用SalI和HindIII切斷，然后插入通過(guò)SalI和HindIII從帶有絲心蛋白H鏈啟動(dòng)子絲心蛋白H鏈基因第一外顯子第一內(nèi)含子第二外顯子區(qū)的質(zhì)粒切出的約1.4kbp片段(HP區(qū))。再經(jīng)BamHI切斷，插入通過(guò)BamHI從帶有絲心蛋白H鏈多聚A信號(hào)區(qū)的質(zhì)粒切出的約0.8kbp片段(A區(qū))。將帶有該HP.IC.A的質(zhì)粒用AscI切斷，將切出的約2.8kbp片段通過(guò)寶酒造(株)T4DNA聚合酶進(jìn)行鈍端化后的片段與用Xhol切斷后鈍端化、進(jìn)行脫磷酸化處理的pigA3GFP連接，制作含有HP.IC.A基因[序列]盒的基因?qū)胗脴?gòu)建物。圖15和圖16給出了構(gòu)建的手法。用QIAGENPlasmidMaxiKit，按照附帶的程序?qū).IC.A基因?qū)胗脴?gòu)建物、HP.IC.HA基因?qū)胗脴?gòu)建物、HUP.IC.HA基因?qū)胗脴?gòu)建物、HP.IC.A基因?qū)胗脴?gòu)建物進(jìn)行純化。實(shí)施例16.在蠶絲腺中的13-半乳糖苷酶的表達(dá)將直徑1.6咖的金粒子用100%乙醇洗凈滅菌，懸浮于滅菌蒸餾水中(60mg/ml)。P-gal基因表達(dá)[序列]盒向蠶絲腺中的導(dǎo)入用基因槍進(jìn)行。即，將金粒子50ul(0.3mg)、實(shí)施例14得到的表達(dá)用質(zhì)粒pPgalA或pHPgalHA10ug和2.5M氯化鈣50u1、0.1M精胺20ul依次混合，于室溫下放置30分鐘后，經(jīng)離心分離，回收pHgalC包被的金粒子。得到的金粒子用70%乙醇清洗2次后，分散于100%乙醇50ul中。將10ul的金粒子懸浮液加到微載體上，使其干燥?；驑屖褂肂I0-RAD制PDS-1000/He。將從5齡第3日的蠶幼蟲(chóng)摘出的后部絲腺用PBS輕輕洗2次后，設(shè)置在1%瓊脂板上，用1，100psi的壓力使包被了DNA的金粒子噴射。DNA導(dǎo)入后，將絲腺移至20mlGrace昆蟲(chóng)培養(yǎng)基，于25t:下培養(yǎng)2日。培養(yǎng)后，回收培養(yǎng)上清和絲腺細(xì)胞，對(duì)P-gal的表達(dá)進(jìn)行了確認(rèn)。表達(dá)的確認(rèn)通過(guò)Western解析進(jìn)行。將絲腺細(xì)胞于PBS中進(jìn)行勻漿，提取細(xì)胞內(nèi)含物。將培養(yǎng)上清和細(xì)胞提取液都調(diào)整到總蛋白質(zhì)濃度為1.0mg/ml，以他們作為樣品進(jìn)行SDS-PAGE。(印跡)轉(zhuǎn)移到膜上后，使用ECLPlusTMWesternblottingKit(AmershamPharmacia公司生產(chǎn))，按照附帶的程序進(jìn)行P-gal蛋白質(zhì)的檢測(cè)。艮卩，將印跡后的膜于封閉液(5%脫脂乳、0.1%Tween20PBS)中在4。C下封閉過(guò)夜。然后將膜用TPBS(O.1%Tween20PBS)清洗2次，用TPBS稀釋1000倍的抗P-gal蛋白質(zhì)抗體(Sigma公司生產(chǎn))于室溫下處理1小時(shí)。將膜用TPBS清洗2次，再用TPBS在5分鐘內(nèi)洗3次。然后用TPBS稀釋10000倍后，用HRP標(biāo)記的抗家兔IgG抗體于室溫處理1小時(shí)后，將膜用TPBS清洗2次，再用TPBS在5分鐘內(nèi)洗3次。然后加ECLPlusTMWesternblottingDetectionSystem(AmershamPharmacia公司生產(chǎn))的檢測(cè)試齊U(溶液A+溶液B)。對(duì)HyperfilmTMECLTM曝光、顯影。由于只在導(dǎo)入pHPgalHA的絲腺細(xì)胞和培養(yǎng)上清中檢測(cè)到P-gal蛋白質(zhì)，所以表明絲心蛋白H鏈啟動(dòng)子以外的區(qū)域，即絲心蛋白H鏈基因第一外顯子第一內(nèi)含子第二外顯子區(qū)對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成或基因的表達(dá)起著重要的作用。另外也確認(rèn)向細(xì)胞外的分泌。圖17給出了該結(jié)果。實(shí)施例17.基因重組蠶的制作制備含有實(shí)施例15所述的基因?qū)胗觅|(zhì)粒和生產(chǎn)piggyBac轉(zhuǎn)座酶蛋白質(zhì)的DNA(pHA3PIG)各200iig/ml的0.5mM磷酸緩沖液(pH7.0)'5mMKCl溶液，將其中3_20nl微注射入產(chǎn)卵后4小時(shí)以?xún)?nèi)的500個(gè)蠶卵中。對(duì)由這樣的卵孵化的幼蟲(chóng)進(jìn)行飼養(yǎng)，得到的成蟲(chóng)(GO)在組內(nèi)進(jìn)行交配得到的次世代(Gl)，通過(guò)對(duì)水母綠色熒光蛋白質(zhì)的熒光觀(guān)察，篩選染色體導(dǎo)入了水母綠色熒光蛋白質(zhì)基因的蠶。結(jié)果得到了通過(guò)水母綠色熒光蛋白質(zhì)的作用發(fā)出熒光的基因重組蠶。實(shí)施例18.通過(guò)Western解析進(jìn)行絲腺組織中的重組蛋白質(zhì)的表達(dá)解析表達(dá)的確認(rèn)通過(guò)Western解析進(jìn)行?；厥辗寝D(zhuǎn)化蠶、轉(zhuǎn)化蠶(HP.IC.A轉(zhuǎn)化蠶、HP.IC.HA轉(zhuǎn)化蠶、HUP.IC.HA轉(zhuǎn)化蠶)的后部絲腺組織，通過(guò)Western解析研究組織中的貓干擾素"的表達(dá)。將后部絲腺組織于lOOmM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中勻漿，回收離心分離后的上清，使用ECLPlusT麗esternblottingKit(AmershamPharmacia公司生產(chǎn))，按照附帶的程序進(jìn)行貓干擾素的檢測(cè)。即，將印跡后的膜于封閉液(5%脫脂乳、0.1%Tween20PBS)中在4。C下封閉過(guò)夜。然后將膜用TPBS(O.1%Tween20PBS)清洗2次，用TPBS稀釋1000倍的抗貓干擾素抗體于室溫下處理1小時(shí)。將膜用TPBS清洗2次，再用TPBS在5分鐘內(nèi)洗3次。然后用TPBS稀釋10000倍后，用HRP標(biāo)記的抗家兔IgG抗體于室溫處理1小時(shí)后，將膜用TPBS清洗2次，再用TPBS在5分鐘內(nèi)洗3次。之后加ECLPlusTMWesternblottingDetectionSystem(AmershamPharmacia公司生產(chǎn))的檢領(lǐng)lj試齊ll(溶液A+溶液B)。對(duì)HyperfilmTMECLTM曝光、顯影。結(jié)果非轉(zhuǎn)化蠶和P.IC.A構(gòu)建物導(dǎo)入轉(zhuǎn)化蠶的后部絲腺組織沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)，而與此相反，HP.IC.A構(gòu)建物、HP.IC.HA構(gòu)建物和HUP.IC.HA構(gòu)建物導(dǎo)入轉(zhuǎn)化蠶的絲腺組織檢測(cè)到信號(hào)。由本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果再次確認(rèn)，絲心蛋白H鏈啟動(dòng)子以外的區(qū)域，即絲心蛋白H鏈基因第一外顯子第一內(nèi)含子第二外顯子區(qū)對(duì)于蠶后部絲腺細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成或基因的表達(dá)的飛躍上升起著重要的作用。圖18給出了該結(jié)果。在含有絲心蛋白H鏈的5'末端啟動(dòng)子區(qū)約5.5kbp和貓干擾素基因和絲心蛋白H鏈的3'末端的HUP.IC.HA基因[序列]盒的轉(zhuǎn)化蠶中的貓干擾素在后部絲腺組織內(nèi)的蓄積量比含有絲心蛋白H鏈的5'末端啟動(dòng)子區(qū)和貓干擾素基因和絲心蛋白H鏈的3'末端的HP.IC.HA基因[序列]盒的轉(zhuǎn)化蠶中的貓干擾素在后部絲腺組織內(nèi)的蓄積量高?？梢哉J(rèn)為在H鏈5'末端上游區(qū)域存在使蛋白質(zhì)產(chǎn)量提高的基因區(qū)域。實(shí)施例19.通過(guò)Western解析進(jìn)行蠶絲中的重組蛋白質(zhì)的測(cè)定以下對(duì)外源蛋白質(zhì)即貓干擾素"向蠶絲的分泌進(jìn)行研究。各取10mg量的非轉(zhuǎn)化蠶、轉(zhuǎn)化蠶(HP.IC.A基因?qū)朕D(zhuǎn)化蠶、HP.IC.HA基因?qū)朕D(zhuǎn)化蠶、HUP.IC.HA基因?qū)朕D(zhuǎn)化蠶)的繭，加4ml60%LiSCN攪拌后，于室溫下靜置過(guò)夜溶解繭。將溶解液用8M尿素2%SDS5%2-巰基乙醇稀釋10倍后的溶液作為樣品，使用ECLPlusTMWesternblottingKit(AmershamPharmacia公司生產(chǎn))，按照附帶的程序進(jìn)行貓干擾素的檢測(cè)，使用分子成像儀(BioRad公司生產(chǎn))對(duì)該結(jié)果進(jìn)行信號(hào)強(qiáng)度測(cè)定，與濃度已知的貓干擾素的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行比較，測(cè)定蛋白質(zhì)含量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明由非轉(zhuǎn)化蠶和HP.IC.A基因?qū)朕D(zhuǎn)化蠶的蠶繭中沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)，與此相反，由HP.IC.HA基因?qū)朕D(zhuǎn)化蠶和HUP.IC.HA基因?qū)朕D(zhuǎn)化蠶的蠶繭中檢測(cè)到信號(hào)，可以確認(rèn)貓干擾素蛋白質(zhì)向蠶絲中分泌。另外其含量，對(duì)于HP.IC.HA轉(zhuǎn)化蠶是約0.82.0%，對(duì)于HUP.IC.HA轉(zhuǎn)化蠶約為1.85.4%。該值如果換算為每頭蠶的重量是0.42mg。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明絲心蛋白H鏈基因的3'末端部分對(duì)在后部絲腺細(xì)胞內(nèi)合成的蛋白質(zhì)向蠶絲分泌具有重要的作用。圖19給出了該結(jié)果。在含有絲心蛋白H鏈的5'末端24啟動(dòng)子區(qū)約5.5kbp和貓干擾素基因和絲心蛋白H鏈的3'末端的HUP.IC.HA基因[序列]盒的轉(zhuǎn)化蠶中的貓干擾素產(chǎn)量比含有絲心蛋白H鏈的5'末端啟動(dòng)子區(qū)和貓干擾素基因和絲心蛋白H鏈的3'末端的HP.IC.HA基因[序列]盒的轉(zhuǎn)化蠶中的貓干擾素的產(chǎn)量高?？梢哉J(rèn)為在H鏈5'末端上游區(qū)域存在使蛋白質(zhì)產(chǎn)量提高的基因區(qū)域。實(shí)施例20.通過(guò)ELISA法測(cè)定蠶絲中的重組蛋白質(zhì)。通過(guò)ELISA法對(duì)蠶絲中的貓干擾素"進(jìn)行定量。各取10iig量的非轉(zhuǎn)化蠶、轉(zhuǎn)化蠶(HP.IC.A基因?qū)朕D(zhuǎn)化蠶、HP.IC.HA基因?qū)朕D(zhuǎn)化蠶、HUP.IC.HA基因?qū)朕D(zhuǎn)化蠶)的繭，加4ml60%LiSCN攪拌后，于室溫下靜置過(guò)夜溶解繭。然后用PBS稀釋8倍或16倍，鋪在微量反應(yīng)板上。用PBS依次稀釋濃度已知的貓干擾素作為標(biāo)準(zhǔn)使用。結(jié)果在蠶絲中的貓干擾素"在HP.IC.A基因?qū)朕D(zhuǎn)化蠶中沒(méi)有檢測(cè)到，而在HP.IC.HA基因?qū)朕D(zhuǎn)化蠶中約為1.12.2X，在HUP.IC.HA基因?qū)朕D(zhuǎn)化蠶約為1.04.9%。產(chǎn)業(yè)上利用的可能性制作將細(xì)胞因子基因與在蠶絲腺中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子連接的質(zhì)粒載體，由通過(guò)向蠶染色體導(dǎo)入基因得到的基因重組蠶的絲腺或繭絲可以大量回收保持著原來(lái)生理活性的細(xì)胞因子。另外得到的細(xì)胞因子提取液由于夾雜蛋白少，與以往方法比較，純化容易。通過(guò)將使絲心蛋白H鏈的5'末端部分的DNA序列和3'末端部分的DNA序列與外源蛋白質(zhì)融合的表達(dá)用基因[序列]盒導(dǎo)入絲腺細(xì)胞等，可以使大量的外源蛋白質(zhì)產(chǎn)生在絲腺細(xì)胞內(nèi)、絲腺細(xì)胞外，甚至產(chǎn)生在繭絲中。通過(guò)這一新手法不使用重組桿狀病毒，利用絲腺使外源蛋白質(zhì)生產(chǎn)，確立了純化容易的外源蛋白質(zhì)生產(chǎn)技術(shù)。序列表〈110〉東麗株式會(huì)社和獨(dú)立行政法人農(nóng)藥生物資源研究所〈120〉利用基因重組蠶生產(chǎn)生理活性蛋白質(zhì)的方法〈130〉〈160>38〈170〉Patentln版本3.1〈210>1〈211>1910〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列〈220〉〈221>CDS〈222〉(1071)(1652)〈223〉〈220〉〈221>sig_peptide112411721220〈222〉(1071).(1139)〈223〉〈220〉〈221>mat_peptide〈222〉(1140).(1652)〈223〉〈400>1ctcgagggtcgagcca^tetegtteacac60ttettcgtgtattgtttetegcctttgtcaagtcttttec皿ggc皿gat120皿teagteatattccgtgattggacgteacatttcccggaagatccttegccgateagtc180g皿gagccgcatgtggctegag卿cgcgggtttccgaccactggctteggcgcttettc240cgccateategatgtecgtgttcacaattegC3CCCg皿3ttcgteategctecgag皿g300tetcgaatetcgtg皿gc皿aaactttgtetcccttttte360g郷3Cgg3ggagtetg^atttcccacacttetegag皿tecagag^g420tgcteatettagatecttte■c3C3cactecateccatgtetttgacgcacacacgcatgt540ttgtcaaacttttgttcttgacgtctgtgt皿tegatteaatettgtttg600tctttetteatetttttteategtgtegtcttggcga皿tttgtgattetag皿gtetea660teategtgteattcccaattaattetegtcgaatttcgac720tectgcgggacctctegtetteateattctc111aaaaaatcaaatectg780tcacaaatgtc皿gcgggtctcaacgagcc840aaccatttecategag皿cgtttgttgaac■acttgtetecattgtttgcacaaatgtttgttettectctctecgteagc960ttgatcaaacttcgttttcgtetea朋cgcgttggcccaaccactttggcategtcgtct1020tetcatcgggtctcteaggatcaagcgatcC皿3g3CCgCc皿cgtcgacatggcg1076MetAla1ctgccctcttecttcttggtggecctggtggcgctgggctgcaactecLeuProSerSerPheLeuValAlaLeuValAlaLeuGlyCysAsnSer51015gtctgcgtgctgggctgtgacctgcctcagacccacggcctgctgaacValCysValLeuGlyCysAspLeuProGinThrHisGlyLeuLeuAsn2025303gg3gggCCttg3CgCtCCtggg33tg3ggetccctgecageArgArgAlaLeuThrLeuLeuGlyGinMetArgArgLeuProAlaSer3540455026tectgtcagaaggacagaaatgacttcgccttcccccaggacgtgttc1268SerCysGinLysAspArgAsnAspPheAlaPheProGinAspValPhe556065ggtg￡lCCElgteccacaaggcccaagccetcteggtggtgcacgtg1316GlyGlyAspGinSerHisLysAlaGinAlaLeuSerValValHisVal7075803Cg朋cCElg朋gatettccacttcttctgcacagaggcgtectegtct1364ThrAsnGinLysliePheHisPhePheCysThrGluAlaSerSerSer859095getgettggaccaccetcctggaggaattttgcacgggacttgat1412AlaAlaTrpAsnThrThrLeuLeuGluGluPheCysThrGlyLeuAsp100105110eggCElgctg3CCcgcctggaagcctgtgtcctgcaggaggtggaggag1460ArgGinLeuThrArgLeuGluAlaCysValLeuGinGluValGluGlu115120125130gaggetcccctgacgaacgaggacattcatcccgaggactecate1508GlyGluAlaProLeuThrAsnGluAsplieHisProGluAspSerlie135140145ctg￡lgg朋ctacttccaaagaetctecetctacctgcaagagaagaaa1556LeuArgAsnTyrPheGinArgLeuSerLeuTyrLeuGinGluLysLys150155160tacageccttgtgcctgggagategtc3g3gcag朋ate3tg3g3tec1604TyrSerProCysAlaTrpGlulieValArgAlaGlulieMetArgSer165170175ttgtattatteateaseagccttgcaga朋3gatteaggagegaga朋1652LeuTyrTyrSerSerThrAlaLeuGinLysArgLeuArgSerGluLys180185190tg￡ltctegaccgctgatcagectcgactgtgccttctegttgccagccatctg1705ttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtccttt1765ccteate朋3tgagga朋ttgeategcattgtctgagteggtgtcattctattctggggg1825gtggggtggggc郷織gc朋ggggg郷3ttggg3卿c朋tegc3ggC3tgctgggg1885atgcggtgggctctetggcctcgag1910〈210>2〈211>1172〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列〈220〉〈221>CDS〈222〉(333).(914)〈223〉〈220〉〈221>sig_peptide〈222〉(333).(401)〈223〉〈220〉〈221>mat_peptide〈222〉(402)(914)〈223〉〈400>2ctcgaggggagaaagcatgaacattgttcatgatcacaatagatteatttctetgteatt朋gte朋tecgtc朋朋ctcgcatcagttcggttccaactttgLeutgtCysetcLeu403gaArgcacHisttcPheagteagttcttte朋tettec朋a朋朋ttg朋cgatett朋朋gteag33c朋te3gatc朋tte朋tcateatteatctteatttecttcatecgttgtettgttetgtteaateaaagtetctgtecaatecaatgtgtegatgtttattctetcgag朋朋ttttcagtete朋朋ggttc朋ctttttc3朋tcactcaaggtcgacatggcgctgccctcttecttcMetAlaLeuProSerSerPhe15gtggccctggtggcgctgggctgcaactecgtctgcgtgctgggcValAlaLeuValAlaLeuGlyCysAsnSerValCysValLeuGlyg￡lCAsp25ctgLeu朋tAsn朋gLyscacHis10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