具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)及其應用。其中，具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)，其為選自下列的至少一種：1）具有SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列；2）對SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列進行一個或多個氨基酸的取代、缺失或添加而獲得的且具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)；和3）與SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性且具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)。將本發(fā)明的具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)的編碼基因轉(zhuǎn)入植物，能夠顯著增強植物的耐鹽性。
【專利說明】具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。具體地，本發(fā)明涉及具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)及其應用。更具體地，本發(fā)明涉及具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)、分離的寡核苷酸、構(gòu)建體、重組細胞、制備轉(zhuǎn)基因植物細胞的方法、轉(zhuǎn)基因植物細胞，以及提高植物耐鹽性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鹽脅迫是自然界中主要的非生物脅迫之一，目前已經(jīng)嚴重影響到世界范圍內(nèi)許多重要作物的產(chǎn)量。如何提高植物的耐鹽性、鹽潰土的生物治理和綜合開發(fā)是未來農(nóng)業(yè)的重大課題，而利用基因工程技術(shù)提高作物耐鹽性是解決這一問題的最有效途徑之一。目前，通過向植物中轉(zhuǎn)入耐鹽相關(guān)基因可在一定程度上改善植物的耐鹽性。
[0003]然而，現(xiàn)階段通過轉(zhuǎn)基因提高作物耐鹽性的方法仍有待改進。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種能夠提高植物耐鹽性的手段。
[0005]需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的:
[0006]發(fā)明人通過構(gòu)建擬南芥T-DNA插入突變體庫，篩選獲得一個對鹽處理高度敏感的隱性突變體，進而利用圖位克隆法克隆到該突變體的突變基因，并通過進一步的實驗研究發(fā)現(xiàn)該突變基因的相應野生型基因即EFLl基因與植物的耐鹽性相關(guān)。具體地，發(fā)明人將EFLl基因轉(zhuǎn)入前述的對鹽處理高度敏感的隱性突變體擬南芥，能夠使其耐鹽性恢復到野生型狀態(tài)^fEFLl基因轉(zhuǎn)入野生型擬南芥，則能夠大大提高其耐鹽性。進一步，發(fā)明人對EFLl基因調(diào)控植物耐鹽性的機理進行了分析，發(fā)現(xiàn)EFLl基因?qū)χ参锬望}性的調(diào)控很可能是通過對一些耐鹽相關(guān)基因可變剪切的調(diào)控實現(xiàn)的，即EFLl基因的編碼蛋白具有mRNA剪接功能，是一種剪接因子。
[0007]由此，本發(fā)明提出了具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)及其編碼基因EFL1、包含該基因的構(gòu)建體及其在提高植物耐鹽性中的用途。
[0008]因而，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)，其為選自下列的至少一種:1)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；2)對SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列進行一個或多個氨基酸的取代、缺失或添加而獲得的且具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)；和3)與SEQ ID NO:1所不的氣基酸序列具有至少90%的序列同一性且具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)為剪接因子，其編碼基因與植物耐鹽性相關(guān)，能夠通過對一些耐鹽相關(guān)基因可變剪接的調(diào)控實現(xiàn)增強植物耐鹽性，進而，將本發(fā)明的具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)的編碼基因轉(zhuǎn)入植物，能夠顯著增強植物的耐鹽性。
[0009]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種分離的寡核苷酸，其編碼前面所述的蛋白質(zhì)。其中，該分離的寡核苷酸即為EFLl基因。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，將該分離的寡核苷酸引入受體植物例如擬南芥中，能夠顯著提高植物中EFLl基因的表達，進而能夠顯著增強該植物及其后代的耐鹽性。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述分離的寡核苷酸為選自下列的至少一種:1)具有SEQID NO:2所示的核苷酸序列；2)對SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失或添加而獲得的且能夠編碼具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)的寡核苷酸；3)與SEQID NO:2所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性且能夠編碼具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)的寡核苷酸；4)在高等嚴緊條件下能夠與SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列雜交且能夠編碼具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)的寡核苷酸；和5)與SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列互補且能夠編碼具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)的寡核苷酸。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該構(gòu)建體包含前面所述的分離的寡核苷酸。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用該構(gòu)建體能夠有效地將本發(fā)明的分離的寡核苷酸即EFLl基因引入受體植物中，進而，能夠通過在植物中過表達EFLl基因而顯著增強受體植物及其后代的耐鹽性。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的構(gòu)建體呈選自質(zhì)粒、噬菌體、人工染色體、粘粒以及病毒的至少一種的形式。根據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選實施例，本發(fā)明的構(gòu)建體呈質(zhì)粒的形式。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述構(gòu)建體為pCAMBIA系列載體，優(yōu)選為pCAMBIA1300。由此，能夠有效提高利用本發(fā)明的構(gòu)建體進行遺傳轉(zhuǎn)化的效率。 [0013]根據(jù)本發(fā)明實施例，進一步包括啟動子，所述啟動子為選自增強型、組成型、組織特異型和誘導型啟動子的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述啟動子為CAMV35S啟動子、玉米Ubiquitin啟動子、水稻actinl啟動子或2S1啟動子，優(yōu)選CAMV35S啟動子。由此，能夠有效提高利用本發(fā)明的構(gòu)建體進行遺傳轉(zhuǎn)化的效率。
[0014]根據(jù)本發(fā)明實施例，進一步包括增強子，所述增強子為ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子。由此，能夠有效提高利用本發(fā)明的構(gòu)建體進行遺傳轉(zhuǎn)化的效率。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種重組細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該重組細胞含有前面所述的分離的寡核苷酸或構(gòu)建體。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用該重組細胞轉(zhuǎn)染植物，能夠有效地將該分離的寡核苷酸即EFLl基因引入受體植物中，進而，能夠通過在植物中過表達EFLl基因而顯著增強植物及其后代的耐鹽性。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種制備轉(zhuǎn)基因植物細胞的方法。根據(jù)本發(fā)明實施例，該方法包括:使用前面所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體植物細胞；以及分離轉(zhuǎn)基因植物細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用該方法能夠有效制備包含EFLl基因的轉(zhuǎn)基因植物細胞，進而利用該轉(zhuǎn)基因植物細胞能夠有效獲得相對于野生型，耐鹽性顯著增強的轉(zhuǎn)基因植物。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，在本發(fā)明的制備轉(zhuǎn)基因植物細胞的方法中，轉(zhuǎn)化是通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染法進行的。由此，能夠顯著提高遺傳轉(zhuǎn)化效率。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，在本發(fā)明的制備轉(zhuǎn)基因植物細胞的方法中，受體植物細胞呈細胞、組織或器官的形式，優(yōu)選呈組織的形式，更優(yōu)選呈愈傷組織的形式。由此，能夠顯著提高遺傳轉(zhuǎn)化效率。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，在本發(fā)明的制備轉(zhuǎn)基因植物細胞的方法中，所述植物為擬南芥或水稻。[0020]根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因植物細胞或其培養(yǎng)物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該轉(zhuǎn)基因植物細胞或其培養(yǎng)物是通過前面所述的制備轉(zhuǎn)基因植物細胞的方法獲得的。其中，根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細胞呈細胞、組織或器官的形式。由此，利用該轉(zhuǎn)基因植物細胞或其培養(yǎng)物，能夠有效地獲得相對于野生型，耐鹽性顯著增強的轉(zhuǎn)基因植物。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種提高植物耐鹽性的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法為:使所述植物過表達前面所述的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用該方法能夠有效提高植物的耐鹽性。
[0022]根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用前面所述的構(gòu)建體，制備轉(zhuǎn)基因植物，使所述轉(zhuǎn)基因植物過表達前面所述的蛋白質(zhì)。由此，能夠有效獲得相對于野生型，耐鹽性顯著提高的轉(zhuǎn)基因植物，即提高了植物的耐鹽性。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述植物為擬南芥或水稻。由此，能夠有效獲提聞擬南芥和水稻的耐鹽性。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，在本發(fā)明的提高植物耐鹽性的方法中，通過選自下列至少之一的途徑制備轉(zhuǎn)基因植物:1)使用前面所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體植物；以及分離轉(zhuǎn)基因植株，以便獲得轉(zhuǎn)基因植物，2)利用前面所述的制備轉(zhuǎn)基因植物細胞的方法，制備轉(zhuǎn)基因植物細胞；以及對所述轉(zhuǎn)基因植物細胞進行培養(yǎng)，以便獲得轉(zhuǎn)基因植物。由此，制備轉(zhuǎn)基因植物的效率高，且獲得的轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性，相對于野生型顯著提高。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，途徑I)和2)進一步包括:收獲所述轉(zhuǎn)基因植物的種子；分離轉(zhuǎn)基因種子；以及對所述轉(zhuǎn)基因種子進行培養(yǎng)，以便獲得后代轉(zhuǎn)基因植物。由此，后代轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性進一步增強。
[0025]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0027]圖1是根據(jù)本發(fā)明一個實施例，EFLl基因突變體的耐鹽性鑒定結(jié)果，其中，
[0028]圖1A顯示了經(jīng)IOOmM NaCl處理10天后，擬南芥野生型Col-O和efll突變體幼苗的狀況，
[0029]圖1B顯示了經(jīng)IOOmM NaCl處理10天后，擬南芥野生型Col-O和efll突變體幼苗的根相對生長率統(tǒng)計結(jié)果，
[0030]圖1C顯示了經(jīng)IOOmM NaClU20mMU50mM NaCl處理10天后，擬南芥野生型Col-O和efll突變體幼苗的狀況，
[0031]圖1D顯示了經(jīng)120mM、150mM NaCl處理10天后，擬南芥野生型Col-O和efll突變體幼苗的存活率的統(tǒng)計結(jié)果，
[0032]圖1E顯示了經(jīng)80mM NaNO3>80mM KCl和80mM KNO3處理10天后，擬南芥野生型Col-O和efll突變體幼苗的狀況，
[0033]圖1F顯示了經(jīng)80mM NaNO3>80mM KCl和80mM KNO3處理10天后，擬南芥野生型Col-O和efll突變體幼 苗的根相對生長率的統(tǒng)計結(jié)果；[0034]圖2是根據(jù)本發(fā)明一個實施例，EFLl基因的圖位克隆示意圖；
[0035]圖3是根據(jù)本發(fā)明一個實施例，植物表達載體pCAMBIA35S =EFLl的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0036]圖4是EFLl蛋白結(jié)構(gòu)圖和過表達EFLl片段的植物表達載體的結(jié)構(gòu)示意圖，其中:
[0037]圖4A是EFLl蛋白的結(jié)構(gòu)圖；
[0038]圖 4B 是三個植物表達載體 pCAMBIA35S =EFLl (1-416)，pCAMBIA35S:EFL1(186-416)和 pCAMBIA35S:EFL1 (186-613)的結(jié)構(gòu)示意圖；以及
[0039]圖5是根據(jù)本發(fā)明一個實施例，EFLl基因調(diào)控植物耐鹽性研究的實驗結(jié)果，其中，
[0040]圖5A顯示了對200mM NaCl處理4小時前后的擬南芥野生型Col-O和efll突變體中，進行半定量RT-PCR法檢測部分耐鹽相關(guān)基因發(fā)生IR形式可變剪接的轉(zhuǎn)錄本水平的檢測結(jié)果，[0041]圖5B顯示了對200mM NaCl處理4小時前后的擬南芥野生型Col-O和efll突變體中，進行定量RT-PCR法檢測部分耐鹽相關(guān)基因發(fā)生IR形式可變剪接的轉(zhuǎn)錄本水平的檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0042]下面詳細描述本發(fā)明的實施例。下面描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0043]具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)及其編碼基因
[0044]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)，其為選自下列的至少一種:
[0045]I)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
[0046]2)對SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列進行一個或多個氨基酸的取代、缺失或添加而獲得的且具有mRNA到接功能的蛋白質(zhì)；和
[0047]3)與SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性且具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)。
[0048]其中，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列如下:
[0049]MKSLNDLPAP KSTTTTYYDH SNDAffFKNRV TESETVKSSS IKFKVVPAYL NRQGLRPKNP 60
[0050]EDFGDGGAFP EIHLPQYPLL MGKNKSNKPG AKTLPVTVDA QGNVVFDAIV RQNENSRKIV 120
[0051]YSQHKDIIPK FLKNEGDLGT VVDEEEELQK EIQETAEETK AAIEKIVNVR LSAAQPSNIA 180
[0052]RQS⑶SQYIK YKPSQQSSAF NSGAKERIIR MVEMPVDPLD PPKFKHKRVP RASGSPPVPV 240
[0053]MHSPPRPVTV KDQQDWKIPP CISNWKNPKG YTIPLDKRLA ADGRGLQDVQ INDNFAKLSE 300
[0054]ALYVAEQKAR EAVSMRSKVQ KEMVMKDKER KEQELRALAQ KARSERTGAA MSMPVSSDRG 360
[0055]RSESVDPRGD YDNYDQDRGR EREREEPQET REEREKRIQR EKIREERRRE RERERRLDAK 420
[0056]DMMGKKSKI TRDRDRDISE KVALGMASTG GKGGGEVMYD QRLFNQDKGM DSGFAADDQY 480
[0057]NLYDKGLFTA QPTLSTLYKP KKDNDEEMYG NADEQLDKIK NTERFKPDKA FTGASERVGS 540
[0058]KRDRPVEFEK EEEQDPFGLE KffVSDLKKGK KPLDKIGSGG TMRASGGGGS SSRDDDHGGS 600
[0059]GRTKINFERS DRR(SEQ ID NO:1) 613
[0060]發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)為剪接因子，其編碼基因與植物耐鹽性相關(guān)，能夠通過對一些耐鹽相關(guān)基因可變剪接的調(diào)控實現(xiàn)增強植物耐鹽性，進而，將本發(fā)明的具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)的編碼基因轉(zhuǎn)入植物，能夠顯著增強植物的耐鹽性。
[0061]其中，需要說明的是，在本發(fā)明中所使用的表達方式“對SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列進行一個或多個氨基酸的取代、缺失或添加而獲得的且具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)”，是指分別或同時在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列上進行一個或多個的用逐個連續(xù)整數(shù)表示的氨基酸的取代、缺失、添加修飾而獲得的蛋白質(zhì)，并且該蛋白質(zhì)具有與SEQ ID NO:I所示的氨基酸序列相同或相似的mRNA剪接功能，及促進植物耐鹽性的活性。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，可以對SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列進行一個至十個氨基酸的取代、缺失或添加，以便獲得具有mRNA到接功能的蛋白質(zhì)。
[0062]本文中所述的“與SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性且具有mRNA到接功能的蛋白質(zhì)”指的是這樣一種蛋白質(zhì):相對于SEQ ID NO:1所不的參考氣基酸序列的每100個氨基酸中，除了 10個氨基酸不同外，該蛋白質(zhì)的其他氨基酸序列與參考序列均相同，并且該蛋白質(zhì)具有與SEQ ID NO:1所不的氣基酸序列相同或相似的mRNA到接功能，及促進植物耐鹽性的活性。其中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，“與SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性的蛋白質(zhì)”可以通過下列方法的至少之一獲得:以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列為參考序列，將該參考序列中多達10%的氨基酸刪除或用另一氨基酸替代；將一些氨基酸插入到該參考序列中，其中插入的氨基酸可多達參考序列總氨基酸數(shù)的5% ;在參考序列的基礎上，選取一些氨基酸進行刪除、插入和替換的組合，其中被刪除、插 入或替換的氨基酸可多達參考序列總核苷酸數(shù)的5%。其中，需要說明的是，上述對參考序列進行的變形可發(fā)生在參考氨基酸序列的5’或3’末端位置，或在這些末端位置之間的任意地方，而與參考序列不同的氨基酸或單獨散在于參考序列的氨基酸中，或以一個或多個鄰近的組存在于參考序列中。
[0063]根據(jù)本發(fā)明的實施例，可以通過BLAST、BLAST2.0 (執(zhí)行BLAST分析的軟件可以通過國立生物技術(shù)信息中心為公眾所獲得)確定序列同一性和序列相似性百分數(shù)(例如可參見 Altschul 等(1977) Nucl.Acid.Res.25:3389-3402 和 Altschul 等(1990) J.Mol.Biol.215:403-410，通過參照將其全文并入本文)。其中，在本發(fā)明中，所述“與SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性的蛋白質(zhì)”包括與SEQ ID N0:1所公開序列基本同一的氨基酸序列，例如當通過例如采用標準參數(shù)的BLAST分析確定序列同一性時，該蛋白質(zhì)是指與SEQ ID NO:1所不的氣基酸序列相比具有至少90%序列同一性，優(yōu)選至少具有91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的序列同一性的那些序列。
[0064]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種分離的寡核苷酸，其編碼前面所述的蛋白質(zhì)。其中，該分離的寡核苷酸即為EFLl基因。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，將該分離的寡核苷酸引入受體植物例如擬南芥中，能夠顯著提高植物中EFLl基因的表達，進而能夠顯著增強該植物及其后代的耐鹽性。
[0065]根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述分離的寡核苷酸為選自下列的至少一種:
[0066]I)具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
[0067]2)對SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失或添加而獲得的且能夠編碼具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)的寡核苷酸；[0068]3)與SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性且能夠編碼具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)的寡核苷酸；
[0069]4)在高等嚴緊條件下能夠與SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列雜交且能夠編碼具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)的寡核苷酸；和
[0070]5)與SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列互補且能夠編碼具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)的寡核苷酸。
[0071]其中，SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列如下:
[0072]atgaagtctc ttaatgatct tcctgcgccc aaatcaacca ctaccacgta ttatgatcat 60
[0073]tctaatgatg cttggttcaa aaaccgagtc actgaatccg agacggtgaa atcctccagt 120
[0074]atcaaattta aagtggtgcc tgcttacctg aatcgtcaag gtttacgtcc gaagaatcca 180
[0075]gaggattttg gcgatggtgg tgctttcccg gagattcatc ttcctcagta tcctcttctt 240
[0076]atgggtaaga ataaatccaa taagcctgga gctaagactc tccctgttac tgtcgatgct 300
[0077]cagggaaacg tggtctttga cgctatagtg aggcagaatg agaactcgag gaagattgtt 360
[0078]tattctcagc ataaggatat tattccaaag tttctgaaaa acgagggaga cttgggtact 420
[0079]gttgttgatg aagaggagga attgcagaag gagattcagg agactgctga agaaacgaaa 480
[0080]gctgccattg agaagattgt gaatgtgaga ctgagtgcag cgcagcctag taatatagca 540
[0081]aggcaatcgg gagattcaca gtacattaaa tataagccat cccagcaatc ttctgccttc 600
[0082]aattctggtg ctaaagagag gatcattagg atggtggaga tgcctgtaga tccacttgat 660
[0083]ccaccaaagt tcaagcacaa gagagtccca agggcttctg gttctccgcc tgttccggtc 720
[0084]atgcattcac cgcccaggcc tgttaccgtc aaggaccagc aagactggaa aatccctcct 780
[0085]tgtatctcca attggaagaa tccgaaaggt tacacaatcc ctcttgacaa acgtctagct 840
[0086]gctgatggaa ggggcctaca agacgttcag atcaatgata actttgccaa gttatcagag 900
[0087]gccctctatg tagctgagca gaaagctaga gaggctgttt caatgcgttc caaggtgcaa 960
[0088]aaagagatgg tgatgaagga caaggaaagg aaagagcagg aattgagggc tcttgcccaa 1020
[0089]aaagctcgct ccgaaagaac cggtgctgct atgagtatgc ctgtctcatc tgacaggggt 1080
[0090]aggagtgaaa gtgttgaccc aagaggtgat tatgacaact atgaccagga tagaggaagg 1140 [0091]gaaagagaaa gggaagagcc tcaagagacg agggaggaga gggaaaaaag gattcagaga 1200
[0092]gaaaagatac gagaagagcg tcgcagggaa agagagaggg agagaaggtt ggatgccaaa 1260
[0093]gatgctgcca tggggaagaa gagcaagatc accagagaca gagaccgtga catcagtgag 1320
[0094]aaagttgctc ttggaatggc atctactgga ggaaaaggtg gtggtgaagt tatgtatgat 1380
[0095]caacgtctgt ttaaccaaga caaaggaatg gactctggtt tcgctgctga tgaccaatac 1440
[0096]aacttatacg acaaaggctt gttcactgca caaccaactc tttcgacttt gtacaagcca 1500
[0097]aagaaggata acgatgaaga aatgtatgga aacgctgatg agcagctcga taagatcaag 1560
[0098]aatactgaga ggtttaagcc tgacaaagct ttcacagggg cttcagagag ggtgggtagt 1620
[0099]aagagagacc gacctgttga gtttgagaag gaagaggaac aagatccttt cggtcttgag 1680
[0100]aagtgggttt ctgatttaaa gaagggtaag aaacctttgg acaagatcgg gtctggtgga 1740
[0101]actatgagag caagtggcgg tggtggtagc tcttcaaggg acgatgacca cggcggttct 1800
[0102]ggtcgaacca agatcaattt cgaacgcagt gaccggcgtt aa(SEQ ID NO:2) 1842。
[0103]其中，需要說明的是，可以參照前面對“對SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列進行一個或多個氨基酸的取代、缺失或添加而獲得的且具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)”的解釋說明，理解“對SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失或添加而獲得的且能夠編碼具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)的寡核苷酸”；參照前面對“與SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性且具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)”的解釋說明，理解“與SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性且能夠編碼具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)的寡核苷酸”。
[0104]另外，為了便于理解，下面將對高等嚴緊條件下進行雜交進行解釋。首先，可以根據(jù)測量雜交時所用條件的“嚴緊性”程度來對雜交條件進行分類。嚴緊性程度可以以例如核酸結(jié)合復合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據(jù)進行衡量。例如，“最大嚴緊性”典型地發(fā)生在約Tm - 50C (低于探針Tm5°C )高等嚴緊性”發(fā)生在Tm以下約5 — 10°C 中等嚴緊性”發(fā)生在探針Tm以下約10 - 200C ;“低嚴緊性”發(fā)生在Tm以下約20 — 25°C。作為替代，或者進一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或離子強度條件和/或一或多次的嚴緊性洗滌為依據(jù)。例如，6XSSC=極低嚴緊性；3XSSC=低至中等嚴緊性；1XSSC=中等嚴緊性；0.5XSSC=高等嚴緊性。從功能上說，可以采用最大嚴緊性條件確定與雜交探針嚴緊同一或近嚴緊同一的核酸序列；而采用高等嚴緊性條件確定與該探針有約80%或更多序列同一性的核酸序列。因而,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解,實驗人員能夠通過改變雜交溶液的含鹽量和/或雜交溫度等，容易地控制雜交嚴緊性。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，本發(fā)明前面所述的“在高等嚴緊條件下能夠與SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列雜交”，其所述的雜交的高嚴緊條件為:用 5XSSC、0.5%SDS、1.0mM EDTA (ρΗ8.0)溶液預洗；在 60_65°C或 65_70°C下在 5XSSC 中雜交過夜；隨后用 含0.1%SDS的2X、0.5X和0.2XSSC在65°C下各洗滌兩次20分鐘。
[0105]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該構(gòu)建體包含前面所述的分離的寡核苷酸。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用該構(gòu)建體能夠有效地將本發(fā)明的分離的寡核苷酸即EFLl基因引入受體植物中，進而，能夠通過在植物中過表達EFLl基因而顯著增強受體植物及其后代的耐鹽性。
[0106]根據(jù)本發(fā)明的實施例,本發(fā)明的構(gòu)建體呈選自質(zhì)粒、噬菌體、人工染色體、粘粒以及病毒的至少一種的形式。根據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選實施例，本發(fā)明的構(gòu)建體呈質(zhì)粒的形式。其中，所述構(gòu)建體可為任意一種可用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體，如pBin系列載體(如pBinl9等)、pBI系列載體(如ρΒΙΙΟΙ等)、Gateway? 系列載體(如 pH2GW7 等)、pCAMBIA 系列載體(如 pCAMBIA3301 等)、per8、pX6 或其它衍生植物表達載體，所述構(gòu)建體還可為能在原核生物中復制的載體，如pENTER_T0P0、pUC系列載體或pBluescript系列載體等。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述構(gòu)建體為pCAMBIA系列載體，優(yōu)選為PCAMBIA1300。由此，能夠有效提高利用本發(fā)明的構(gòu)建體進行遺傳轉(zhuǎn)化的效率。
[0107]根據(jù)本發(fā)明的實施例，構(gòu)建體中還可以包含其他的元件，從而為構(gòu)建體賦予額外的有益效果。根據(jù)本發(fā)明實施例，本發(fā)明的構(gòu)建體進一步包括啟動子。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“啟動子”指的是這樣一種核酸序列，其能夠指導與其可操縱地連接的核酸分子的轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“可操縱地”指的是核酸表達控制序列例如啟動子、信號序列、增強子等與目標核酸序列之間的功能連接，其中當合適的分子例如轉(zhuǎn)錄活化分子與表達控制序列結(jié)合時，表達控制序列影響著對應于目標核酸序列的核酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。由此，可以直接通過構(gòu)建體在植物細胞中引入特定的啟動子，并且該啟動子可以用于啟動SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列即EFLl基因的轉(zhuǎn)錄和表達，由此，可以提高所獲得的重組細胞中EFLl基因的表達效率。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述啟動子為選自增強型、組成型、組織特異型和誘導型啟動子(ΑΒΑ、干旱、鹽堿或化學誘導等)的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述啟動子為CAMV35S啟動子、玉米Ubiquitin啟動子、水稻actinl啟動子或2S1啟動子，優(yōu)選CAMV35S啟動子。由此，能夠有效提高利用本發(fā)明的構(gòu)建體進行遺傳轉(zhuǎn)化的效率。
[0108]需要說明的是，花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、玉米Ubiquitin啟動子、水稻actinl啟動子為組成性表達啟動子；所述組織特異性表達啟動子可為根特異性表達啟動子、葉片特異性表達啟動子、維管特異性表達啟動子、種子特異性表達啟動子、花特異性表達啟動子或花粉特異性表達啟動子，如2S1啟動子(GenBank號:NM_118848.2，G1:30687489)和 NapinA (GenBank 號:M64633.1，G1:349405)啟動子等；所述誘導型啟動子可為受低溫、干旱、ΑΒΑ、乙烯、鹽堿或化學等誘導的啟動子?？蓪⑸鲜鰡幼訂为毷褂没蚺c其它的植物啟動子結(jié)合使用。
[0109]此外，本發(fā)明的構(gòu)建體還可使用增強子，包括翻譯增強子和/或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。因而，根據(jù)本發(fā)明實施例，本發(fā)明的構(gòu)建體進一步包括增強子，所述增強子為ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子。由此，能夠有效提高利用本發(fā)明的構(gòu)建體進行遺傳轉(zhuǎn)化的效率。
[0110]根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，構(gòu)建體可以進一步包括篩選標記基因。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“篩選標記基因”指的是這樣的一種基因，其編碼的產(chǎn)物能夠賦予連同載體接受該基因的細胞一種特殊 的性質(zhì)，該特殊的性質(zhì)使得接受該基因的細胞與未接受該基因的細胞很容易被區(qū)分開。由此，便于篩選接受構(gòu)建體的植物細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，篩選標記基因的類型不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述篩選標記基因為藥物抗性基因。由此，容易地通過接受外源構(gòu)建體的重組細胞的抗藥性來進行篩選，例如在培養(yǎng)基中添加殺菌劑，則相應連同載體接受并表達殺菌劑抗性基因的細胞將在培養(yǎng)基上能夠存活下來。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，該篩選標記基因可以為選自新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和羧芐青霉素抗性基因的至少一種，優(yōu)選霉素抗性基因和羧芐青霉素抗性基因。由此，能夠進一步提高篩選接受外源構(gòu)建體的重組細胞的效率。
[0111]根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，構(gòu)建體可以進一步包括編碼報告蛋白的序列。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“報告蛋白”是指這樣的一種蛋白質(zhì)，其在表達后，能夠產(chǎn)生可以直接或者間接檢測的信號，進而能夠反映構(gòu)建體所攜帶的外源核酸序列是否已經(jīng)在細胞中被成功表達。根據(jù)本發(fā)明的實施例，報告蛋白的種類并不受特別限制，只要其具有可檢測的活性即可。根據(jù)本發(fā)明的實施例，報告蛋白可以是一種能夠產(chǎn)生光學信號的蛋白質(zhì)例如發(fā)光蛋白或者熒光蛋白例如綠色熒光蛋白等。由此，可以根據(jù)常規(guī)的方法，對所述報告蛋白進行監(jiān)測。例如可以采用:比色法、熒光法、生物發(fā)光法、化學發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法(ELISA)及原位染色法對報告蛋白進行檢測。從而，通過上述方法，就能夠便捷高效地確定構(gòu)建體所攜帶的外源核酸序列是否已經(jīng)在細胞中被成功表達。[0112]也即，根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的構(gòu)建體可以進一步包括能夠在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPTII)基因、慶大霉素標記物或卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。所述含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因的宿主植物細胞、組織或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等進行篩選，含潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPTII)基因的宿主植物細胞、組織或器官可由潮霉素進行篩選。由此，方便對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選。當然，也可以不加任何選擇性標記基因，直接以逆境即高濃度鹽溶液篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0113]上面對根據(jù)本發(fā)明實施例的構(gòu)建體進行了描述。當然，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的，構(gòu)建體還可以包含其他常規(guī)的元件以促進構(gòu)建體被轉(zhuǎn)入宿主細胞中并且整合到宿主細胞的基因組上，正常發(fā)揮功能，例如復制起點、多克隆位點等。在此對這些元件不再贅述。
[0114]此外，根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用本發(fā)明的構(gòu)建體，可以通過原生質(zhì)體-化學介導法(Ca2+、PEG)、Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、花粉管導入、微注射、電激、基因槍、農(nóng)桿菌介導等常規(guī)生物學方法中的任何一種或幾種方法的組合轉(zhuǎn)化植物細胞、組織或器官，或者直接轉(zhuǎn)化植株。
[0115]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種重組細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該重組細胞含有前面所述的分離的寡核苷酸或構(gòu)建體。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用該重組細胞轉(zhuǎn)染植物，能夠有效地將該分離的寡核苷酸即EFLl基因引入受體植物中，進而，能夠通過在植物中過表達EFLl基因而顯著增強植物及其后代的耐鹽性。
[0116]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種制備轉(zhuǎn)基因植物細胞的方法。根據(jù)本發(fā)明實施例，該方法包括:使用前面所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體植物細胞；以及分離轉(zhuǎn)基因植物細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用該方法能夠有效制備包含EFLl基因的轉(zhuǎn)基因植物細胞，進而利用該轉(zhuǎn)基因植物細胞能夠有效獲得相對于野生型，耐鹽性顯著增強的轉(zhuǎn)基因植物。
[0117]根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，在本發(fā)明的制備轉(zhuǎn)基因植物細胞的方法中，轉(zhuǎn)化是通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染法進行的。由此，能夠顯著提高遺傳轉(zhuǎn)化效率。
[0118] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，在本發(fā)明的制備轉(zhuǎn)基因植物細胞的方法中，受體植物細胞呈細胞、組織或器官的形式，優(yōu)選呈組織的形式，更優(yōu)選呈愈傷組織的形式。由此，能夠顯著提高遺傳轉(zhuǎn)化效率。其中，所述組織和器官可包括受體植物的果莢、愈傷組織、莖尖、葉片和種子等。
[0119]根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，在本發(fā)明的制備轉(zhuǎn)基因植物細胞的方法中，所述植物為擬南芥或水稻。
[0120]需要說明的是，在本文中所使用的表達方式“分離轉(zhuǎn)基因植物細胞”是指，根據(jù)構(gòu)建體所攜帶的核酸序列例如篩選標記基因或報告蛋白基因，以及所采用的遺傳轉(zhuǎn)化方法，選擇相應的篩選方法，以便區(qū)分接受目的基因的細胞與未接受目的基因的細胞，分離選擇出接受構(gòu)建體的植物細胞。例如，當構(gòu)建體攜帶有篩選標記基因例如藥物抗性基因時，能夠通過接受外源構(gòu)建體的重組細胞的抗藥性來進行篩選，例如在培養(yǎng)基中添加殺菌劑，則相應連同載體接受并表達殺菌劑抗性基因的細胞將在培養(yǎng)基上能夠存活下來；當構(gòu)建體攜帶有報告蛋白例如發(fā)光蛋白或者熒光蛋白時，可以采用:比色法、熒光法、生物發(fā)光法、化學發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法(ELISA)及原位染色法對報告蛋白進行檢測，則連同載體接受并表達報告蛋白基因的細胞發(fā)出熒光。從而，通過上述方法，就能夠便捷高效地區(qū)分接受目的基因的細胞與未接受目的因的細胞，進而篩選分離出轉(zhuǎn)基因植物細胞。
[0121]根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因植物細胞或其培養(yǎng)物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該轉(zhuǎn)基因植物細胞或其培養(yǎng)物是通過前面所述的制備轉(zhuǎn)基因植物細胞的方法獲得的。其中，根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細胞呈細胞、組織或器官的形式。由此，利用該轉(zhuǎn)基因植物細胞或其培養(yǎng)物，能夠有效地獲得相對于野生型，耐鹽性顯著增強的轉(zhuǎn)基因植物。這里所使用的術(shù)語“培養(yǎng)物”指的是，將轉(zhuǎn)基因植物細胞在適于生長的條件下進行培養(yǎng)，所得到的細胞衍生物，這些細胞衍生物具有與原始的轉(zhuǎn)基因植物細胞相同的基因組。
[0122]根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細胞的來源不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細胞可以來源于單子葉植物或者雙子葉植物，優(yōu)選水稻、谷子、小麥、高粱、玉米或擬南芥。[0123]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種提高植物耐鹽性的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法為:使所述植物過表達前面所述的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用該方法能夠有效增強植物的耐鹽性。
[0124]根據(jù)本發(fā)明的實施例，使所述植物過表達前面所述的蛋白質(zhì)的方法不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，利用前面所述的構(gòu)建體，制備轉(zhuǎn)基因植物，使所述轉(zhuǎn)基因植物過表達前面所述的蛋白質(zhì)。由此，能夠有效獲得相對于野生型，耐鹽性顯著提高的轉(zhuǎn)基因植物，即提高了植物的耐鹽性。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述植物為擬南芥或水稻。由此，能夠有效獲提聞擬南芥和水稻的耐鹽性。
[0125]根據(jù)本發(fā)明的實施例，制備轉(zhuǎn)基因植物的方法不受特別限制，只要能夠有效獲得轉(zhuǎn)基因植物，并且使所述轉(zhuǎn)基因植物能夠過表達EFLl基因即可。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，在本發(fā)明的提高植物耐鹽性的方法中，可以通過選自下列至少之一的途徑制備轉(zhuǎn)基因植物:
[0126]I)使用前面所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體植物；以及
[0127]分離轉(zhuǎn)基因植株，以便獲得轉(zhuǎn)基因植物，
[0128]2)利用前面所述的制備轉(zhuǎn)基因植物細胞的方法，制備轉(zhuǎn)基因植物細胞；以及
[0129]對所述轉(zhuǎn)基因植物細胞進行培養(yǎng)，以便獲得轉(zhuǎn)基因植物。
[0130]由此，制備轉(zhuǎn)基因植物的效率高，且獲得的轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性，相對于野生型顯著增強。需要說明的是，這里所使用的術(shù)語“培養(yǎng)”應作廣義理解，其涵蓋了從轉(zhuǎn)基因植物細胞獲得植物個體過程中所經(jīng)歷的各種為細胞/細胞集合體提供能量的操作。需要說明的是，對轉(zhuǎn)基因植物細胞進行培養(yǎng)的條件不受特別限制，任何能夠?qū)崿F(xiàn)“培養(yǎng)”的各種操作條件均可。
[0131]此外，還可對轉(zhuǎn)基因植株進行擴繁，以便使轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性進一步改善和提高。所述轉(zhuǎn)基因植物的擴繁包括無性繁殖和/或種子繁殖。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，可以采用種子繁殖進行轉(zhuǎn)基因植物的擴繁，具體地:途徑I)和2)進一步包括:收獲所述轉(zhuǎn)基因植物的種子；分離轉(zhuǎn)基因種子；以及對所述轉(zhuǎn)基因種子進行培養(yǎng)，以便獲得后代轉(zhuǎn)基因植物。由此，后代轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性進一步增強。[0132]需要說明的是，植物的耐鹽性是受多基因控制的復雜遺傳性狀，依賴于多個基因之間的相互作用，是多種耐鹽生理性狀的綜合體現(xiàn)，因此，轉(zhuǎn)入單個耐鹽相關(guān)基因只能部分提高植物的耐鹽性。一般認為，將多個耐鹽相關(guān)基因聚合到同一植物中才有可能會大大提高轉(zhuǎn)基因植物抵抗鹽脅迫的能力。另外，mRNA前體的剪接(包括選擇性剪接)是高等真核生物基因表達調(diào)控的重要機制。大多數(shù)真核基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA前體是按一種方式剪接產(chǎn)生出一種成熟mRNA分子，因而只翻譯成一種蛋白質(zhì)。但有些基因的一個mRNA前體通過不同的剪接方式(選擇不同的剪接位點)產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體，這一過程稱為可變剪接(或選擇性剪接，alternative splicing)。mRNA的可變剪接不牽涉到遺傳信息的永久性改變，是調(diào)芐基因表達和產(chǎn)生蛋白質(zhì)組多樣性的重要機制。mRNA前體的剪接主要通過形成剪接復合體的形式行使功能。剪接復合體包含了核小RNA蛋白質(zhì)復合體(small nuclearribonucleoprotein, snRNP)和其他多種蛋白質(zhì)因子。而本發(fā)明提供的與耐鹽性相關(guān)的擬南芥剪接因子基因EFL1，其對植物耐鹽性的調(diào)控正是通過調(diào)節(jié)全基因組多個基因(包括耐鹽相關(guān)基因)的可變剪接實現(xiàn)的。因而，與現(xiàn)有的通過轉(zhuǎn)入單個耐鹽相關(guān)基因提高植物耐鹽性的技術(shù)相比，具有轉(zhuǎn)化單個基因而調(diào)控多個耐鹽基因從而大大提高植物耐鹽性的優(yōu)點和積極效果，在提高植物的耐鹽性及相關(guān)性狀的改良方面具有重要的理論及實際意義，應用前景廣闊。
[0133]需要說明的是，本發(fā)明的EFLl基因、構(gòu)建體及其應用，是本申請的發(fā)明人經(jīng)過艱苦的創(chuàng)造性勞動和優(yōu)化的工作才發(fā)現(xiàn)以及完成的。
[0134]下面參考具體實施例，對本發(fā)明進行說明，需要說明的是，這些實施例僅僅是說明性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0135]若未特別指明，實施例中所采用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，可以參照《分子克隆實驗指南》第三版或者相關(guān)產(chǎn)品進行，所采用的試劑和產(chǎn)品也均為可商業(yè)獲得的。未詳細描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法，所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均與首次標明的內(nèi)容相同。
[0136]實施例1.EFLl基因突變體的獲得和耐鹽性鑒定
[0137]為了尋找新的與耐鹽相關(guān)的基因，發(fā)明人建立了擬南芥Col-O的T-DNA插入突變體庫，進行大規(guī)模的敏鹽突變體的遺傳篩選。在篩選過程中，發(fā)現(xiàn)了一個隱性突變體efll對鹽處理高度敏感，具體見圖1。
[0138]先將野生型Col-O (本發(fā)明中也直接用“WT”表示)和efll突變體在MS培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)5天，再將其轉(zhuǎn)入不含有NaCl的MS培養(yǎng)基和含有IOOmM NaCl的MS培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)10天，對兩種植物材料NaCl處理后根相對生長率進行統(tǒng)計比較。如圖1A所示，經(jīng)NaCl處理的野生型Col-O的根相對生長率為未經(jīng)處理的野生型Col-O的63%，而NaCl處理的efll突變體的根相對生長率為未經(jīng)處理的efll突變體的30%，說明efll突變體對NaCl處理更敏感。
[0139]將野生型Col-O和efll突變體在MS培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)5天后，再將其轉(zhuǎn)入不含有NaCl的MS培養(yǎng)基和分別含有120mM NaCl、150mM NaCl的MS培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)10天，對兩種植物材料不同濃度NaCl處理后存活率進行統(tǒng)計比較。如圖1B所示，經(jīng)120mM NaCl處理的野生型Col-O的存活率為86%，經(jīng)150mM NaCl處理的野生型Col-O的存活率為64%，而經(jīng)同樣濃度NaCl處理的efll突變體的存活率分別為40%和10%，該實驗也說明efll突變體對NaCl處理更敏感。
[0140]先將野生型Col-O和efll突變體在MS培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)5天，再將其轉(zhuǎn)入不含有NaCl的MS培養(yǎng)基和分別含有80mM NaN03>80mM KCl和80mM KNO3的MS培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)10天，對兩種植物材料在不同處理條件下的根相對生長率進行統(tǒng)計比較。如圖1C所示，經(jīng)80mM NaNO3>80mM KCl和80mM KNO3處理的野生型Col-O的根相對生長率分別為未經(jīng)處理的野生型 Col-O 的 75%, ,70% 和 68%，而 80mM NaNO3>80mM KCl 和 80mM KNO3 處理的 efll突變體的根相對生長率分別為未經(jīng)處理的efll突變體的41%、38%和32%，說明efll突變體不僅對NaCl處理更敏感，對NaN03、KCl和KNO3等多種鹽的處理都比野生型Col-O敏感。
[0141]實施例2.EFLl基因的獲得
[0142]利用圖位克隆法對擬南芥efll突變體突變基因進行克隆，其中，EFLl基因的圖位克隆示意圖見圖2。如圖2所示，用于圖位克隆的分子標記標于圖中；L12B-57和L12B-108是利用CAPS分子標記N5-7和N5-4獲得的兩個重組體，兩個CAPS分子標記間相距25kb。紫色表示Col-O等位基因純合，綠色表示Col-0/Ler等位基因雜合。通過測序在EFLl位點發(fā)現(xiàn)22bp的缺失。
[0143]為了構(gòu)建遺傳作圖群體,將efll突變體與Landsbergerecta(Ler)雜交，在F2群體的467株具有敏鹽表型的efll植株中，通過PCR尋找與efll突變共分離的分子標記。efll最初被定為 于一號染色體短臂AthATPASE和K14-1之間。
[0144]再利用SSLP型分子標記和CAPS型分子標記進行精細定位。進一步將efll突變位點定位于2個CAPS型分子標記N5-7和N5-4之間，這2個標記將突變基因界定在一個25kb長的區(qū)域內(nèi)。對該區(qū)域內(nèi)的開放閱讀框進行測序，發(fā)現(xiàn)其中一個基因存在22bp的缺失，該缺失突變導致了編碼蛋白的提前終止。該基因的野生型EFLl基因編碼的氨基酸序列如SEQID NO:1所示，對應的核酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0145]進一步，發(fā)明人將具有SEQ ID NO:3所示核酸序列的野生型EFLl基因(該序列除SEQ ID NO:2所示的核酸序列外還包含上下游調(diào)控序列)轉(zhuǎn)入前述的efll突變體中。SEQID NO:3所示的核苷酸序列如下:
[0146]ttttattttt aaataatctc ttcttttaaa aacatttagc ctccaaacct ctgaagttta 60
[0147]tttaattatt ggattcagac cagagtttaa tatacttgat taaacctgat agtaccatat 120
[0148]aatgtttatt gctctctttt ttttgatcgg atcttctaga tattttgtac gaacacgcca 180
[0149]attgtgattg gacgataaat ggttttttgt ttatattttg ctaattaact tatatagttt 240
[0150]aggtgaccat tttttatact ttaggtgaac atttgagaat taaactattt atatcaaagt 300
[0151]agcggtagat aaaagtatta tctgagatgg tttgttagtt gacatatatt gaatcttttc 360
[0152]aacttggtat ttattatcac cctctgtatt taattcacaa aatttctact gttagcttca 420
[0153]tataaccaac tttttcaatt taaattattg tttacagtga atgagaaata caagtacaat 480
[0154]gcaatattta ggaaatacac ttttgagaag aaaaatagaa actcattttc tttccctaat 540
[0155]taaaaacaat ttgtaccaga gaagtaaaag attatcgttc taccaaaacg aatttgcagg 600
[0156]ttaaggatta tttatcattt cctcttgttt gactttgttt gcattagtca gacataatta 660
[0157]atggcttgac ccttaattta acatgtccat gcactaactc atatgcaaat ccaacgatgt 720
[0158]gaaatttaaa accttttttt tattcatttt taatctttgt aaaacgaact tatattatgt 780[0159]ttgaacaaat attttttcat acgcaatcct tagatgggga aattaatacc tttgtaacaa 840
[0160]aaaaaaaaaa aaaatgttaa atcaactaag tattgggtga gtcttctcaa cgaaaacatc 900
[0161]aatcaacacc ggcctcataa gttgattaaa ttaacacatt tattataatc atcgtacatt 960
[0162]gatttgaatc aaaattaattgttacgttaa ttagtaatgc atctaactat cccgtaggaa1020
[0163]aaggccatta tattgggatccgcggtcaac ggaggttcca cccacgagca cggtctttat1080
[0164]ttgttttttc ctttctcaaa tatatatacg gatgtatgat tttttgcttt tggggttaaa1140
[0165]caaatatgaa ttactgtgcttagatcagaa atagacactt ttatacaaat gattatatga1200
[0166]ttactgttca tagcataagctcctatgaaa acaaataata atcgcaacag ccgtttaacc1260
[0167]taatcgaatg ctgaaaagccctcaaaatag ttcatctaat ccatgaatcg atttaacaga1320
[0168]aaaagttgaa aattgtatgcatatgatata ctcaagtata ttccgagttt tgagttgtgt1380
[0169]aatgcaagga gtcaaggaccatagtttgtc gttgaacaca accacgccaa gttgtccacc1440
[0170]aaaactggaa actaactaccatgccgttgt ttccatagaa gcaaaaccat taaccttccc1500
[0171]attatcccgc atggccacatatatgtttaa taatatttct caccatacat ttaagtctct1560
[0172]ctcgtagtcg ttatttacatagcctacgta gttcattcat atcatttttg tttctttacc1620
[0173] ttatatcaaa caaattggttgttgattaga aaaacataaa ttggttcatt aaatatcaaa1680
[0174]ctaacgccat caatctattg tttttttata aaaaaatgaa agagaagaaa gtttgttgat1740
[0175]atgaaactta cacttgctttgagttttgat agacaaacca aagcctaact agtatttcct1800
[0176]ctattggtac ttgaattctg aactttttca ccttcccttt cgaggtggtt taacagtata1860
[0177]ccagttgaga tgtaccaaca ccaaattctt atactttttt ttcttttaac cttgaattca1920
[0178]gtattttaaa cgaaactatg ggaatgtgtt tgagacggat tttcattaag gacaatgcaa1980
[0179]ataattatga gatgctcaga attgttgtat atatcaaaaa gccaacacct atagttatat2040
[0180]atataacttt cttcgattta aaaacaataa gtcgctttgg ccgagtggtt aaggcgtgtg2100
[0181]cctgctaagt acatgggctctgcccgcgag agttcgaatc tctcaggcga cgttatcctt2160
[0182]ttcgtttttt cgtctatttttaaaccgact tacatagaca ctgcgtataa gacaattgat2220
[0183]tccttttttt tgttgttaatcctatcaacc ctagaaaagg cttcacgccc gatttctttt2280
[0184]ttccccagaa aaaggcttca cttccgttcg ttgttcttca tcggtctgcg ccgcctcgca2340
[0185]catcgtttca cctttctcag aatctctctt cccgtcgatt agtttcctca gaggttagct2400
[0186]tcttcgattt ctcagattca attctgcttt ttgctttcct cctgttgttt ttaggttttt2460
[0187]gtcgatctct atgttcagcg attcctaaac cctacttgtt ttccgctcta ttgtagtgaa2520
[0188]tccaacccag atttttcaga ttttaatcgg aattattcgg gatctaatgc tcgcgtcgag2580
[0189]tttatcgcta gaaaacccta atttcggagg atctgtcact tttattatca gaagcttgtt2640
[0190]gttgtaatta cggattaggtatgtcctgat cgttattgtt ctttgtttgc aggttgcgat2700
[0191]ttgttgaaaa ccttgattta gactatgaag tctcttaatg atcttcctgc gcccaaatca2760
[0192]accactacca cgtattatga tcattctaat gatgcttggt tcaaaaaccg agtcactgaa2820
[0193]tccgagacgg tgaaatcctccagtatcaaa tttaaagtgg tgcctgctta cctgaatcgt2880
[0194]caaggtttac gtccgaagaa tccagaggat tttggcgatg gtggtgcttt cccggagatt2940
[0195]catcttcctc agtatcctcttcttatgggt aagaataaat ccaataagcc tggagctaag3000
[0196]actctccctg ttactgtcga tgctcaggga aacgtggtct ttgacgctat agtgaggcag3060
[0197]aatgagaact cgaggaagattgtttattct cagcataagg atattattcc aaagtttctg3120[0198]aaaaacgagggagacttggg tactgttgtt gatgaagagg aggaattgcagaaggagatt3180
[0199]caggagactgctgaagaaac gaaagctgcc attgagaaga ttgtgaatgtgagactgagt3240
[0200]gcagcgcagcctagtaatat agcaaggcaa tcgggagatt cacagtacattaaatataag3300
[0201]ccatcccagcaatcttctgc cttcaattct ggtgctaaag agaggatcattaggatggtg3360
[0202]gagatgcctgtagatccact tgatccacca aagttcaagc acaagagagtcccaagggct3420
[0203]tctggttctccgcctgttcc ggtcatgcat tcaccgccca ggcctgttaccgtcaaggac3480
[0204]cagcaagactggaaaatccc tccttgtatc tccaattgga agaatccgaaaggttacaca3540 [0205]atccctcttgacaaacgtct agctgctgat ggaaggggcc tacaagacgttcagatcaat3600
[0206]gataactttgccaagttatc agaggccctc tatgtagctg agcagaaagctagagaggct3660
[0207]gtttcaatgcgttccaaggt gcaaaaagag atggtgatga aggacaaggaaaggaaagag3720
[0208]caggaattgagggctcttgc ccaaaaagct cgctccgaaa gaaccggtgctgctatgagt3780
[0209]atgcctgtctcatctgacag gggtaggagt gaaagtgttg acccaagaggtgattatgac3840
[0210]aactatgaccaggatagagg aagggaaaga gaaagggaag agcctcaagagacgagggag3900
[0211]gagagggaaaaaaggattca gagagaaaag atacgagaag agcgtcgcagggaaagagag3960
[0212]agggagagaaggttggatgc caaagatgct gccatgggga agaagagcaagatcaccaga4020
[0213]gacagagaccgtgacatcag tgagaaagtt gctcttggaa tggcatctactggaggaaaa4080
[0214]ggtggtggtgaagttatgta tgatcaacgt ctgtttaacc aagacaaaggaatggactct4140
[0215]ggtttcgctgctgatgacca atacaactta tacgacaaag gcttgttcactgcacaacca4200
[0216]actctttcgactttgtacaa gccaaagaag gataacgatg aagaaatgtatggaaacgct4260
[0217]gatgagcagctcgataagat caagaatact gagaggttta agcctgacaaagctttcaca4320
[0218]ggggcttcagagagggtggg tagtaagaga gaccgacctg ttgagtttgagaaggaagag4380
[0219]gaacaagatcctttcggtct tgagaagtgg gtttctgatt taaagaagggtaagaaacct4440
[0220]ttggacaagatcgggtctgg tggaactatg agagcaagtg gcggtggtggtagctcttca4500
[0221]agggacgatgaccacggcgg ttctggtcga accaagatca atttcgaacgcagtgaccgg4560
[0222]cgttaaaagtcaagacaaag aaaaagctca gtaactgatc tttgatttcaatatataact4620
[0223]tgttattttggatctgttaa aacagtttgc tttggattat cagtatttatgttgttgtga4680
[0224]gtctcttaaactactcgaat acaatctttc agcttcataa tatcagatcttttgagctta4740
[0225]ttttagtttctttttcactg ttacaacttt gtgtacttaa gaatcttagttttgaatcag4800
[0226]gacaacaacaaaaaagacac atgttcttct ctggtcttat ctccaagcttcatgttcatg4860
[0227]gtactaagagaacaaatcac ttcacgatct ttcaccgttt gaatcatttcgtcactacat4920
[0228]catcttcctcggttacgcct ctttcgcctc aagatcgaaa caaactcttagctactctgt4980
[0229]tatcaaactgcactagccta gctcgtgttc gtcggatcca tggtgacatcttccgttcac5040
[0230]gaatcctcgatcaatatccg atcgctttct tatggaacaa catcatgcgatcttacattc5100
[0231]gccatgagtctcctctcgat gcaattcaag tatatctcgg tatggtgagatcgactgttt5160
[0232]tacccgatcgatattctctt ccgattgtaa tcaaagcagc cgttcaaattcatgatttta5220
[0233]cgttgggaaaggagcttcat tccgtcgccg ttaggttagg gttcgtcggagatgagttct5280
[0234]gcgagagtgggttcattaca ttgtattgta aagcagggga atttgagaacgcacgtaagg5340
[0235]tgttcgatgaaaatcctgag agaaagctgg ggtcttggaa cgccattatcggagggttga5400
[0236]atcacgctggtcgagctaac gaggcggtgg aaatgtttgt ggatatgaaaaggagtggac5460[0237]ttgagcctga tgatttcact atggttagtg tgactgcttc ttgtggagga ttaggtgact 5520
[0238]tgagcttggc ttttcagttg cataaatgcg ttctacaagc taagaccgaa gagaagtctg 5580
[0239]atatcatgat gctgaat (SEQ ID NO:3) 5597。
[0240]對轉(zhuǎn)基因植株進行分子鑒定，獲得PCR陽性的轉(zhuǎn)基因植株。鑒定引物如下:
[0241]引物1:5’ -CAAGCCAAAGAAGGATAACGA-3’ (SEQ ID NO:4)；
[0242]引物2:5’ -TTAACGCCGGTCACTGCGT-3，(SEQ ID NO:5)；
[0243]引物3:5’ -CTTTCACAGGGGCTTCAGAG-3’ (SEQ ID NO:6)；
[0244]引物4:5，-CGTCACGGCTCAATAGATCA-3’ (SEQ ID NO:7)。[0245]其中，引物I和引物2分別位于22bp缺失的上下游，引物3和引物4分別位于22bp缺失區(qū)域和SEQ IN N0:3外的基因組區(qū)域。因此，引物I和引物2擴增產(chǎn)物為兩條帶(349bp和327bp)的植株，且引物3和引物4無擴增產(chǎn)物的植株為efll純合且轉(zhuǎn)基因為陽性的植株。其中，由于efll突變體非常弱小，所以向其中轉(zhuǎn)基因時只能轉(zhuǎn)efll雜合，轉(zhuǎn)基因后需對efll位點和外源轉(zhuǎn)入EFLl基因進行鑒定。轉(zhuǎn)基因引物3和引物4分別位于22bp缺失區(qū)域和SEQ IN N0:3外的基因組區(qū)域，該對引物用于鑒定efll背景，PCR無擴增條帶的植株為efll突變位點純合。引物I和引物2分別位于22bp缺失的上下游，引物I和引物2擴增產(chǎn)物為兩條帶的植株，為轉(zhuǎn)基因陽性植株，其中327bp的條帶是以純合突變的efll位點(缺失22bp)所在的基因組DNA為模板獲得的擴增產(chǎn)物，349bp的條帶是以外源轉(zhuǎn)入的EFLl為模板獲得的擴增產(chǎn)物。
[0246]然后，對獲得的轉(zhuǎn)基因株系進行與實施例1同樣的鹽處理，處理是以WT和efll作為對照，結(jié)果表明，EFLl基因組DNA的轉(zhuǎn)入，能夠?qū)fll突變體的耐鹽性恢復到野生型狀態(tài)，說明SEQ ID NO:2所示的核酸序列是EFLl的核酸序列，而SEQ ID NO:1所示的是EFLl基因編碼的氨基酸序列。
[0247]實施例3.過表達全長EFLl轉(zhuǎn)基因植株的獲得和耐鹽性鑒定
[0248]在實施例1-2研究結(jié)果的基礎上，通過以下步驟制備EFLl轉(zhuǎn)基因植株，并對其進行耐鹽性鑒定:
[0249](I)植物表達載體pCAMBIA35S =EFLl的構(gòu)建
[0250]將植物表達載體pBI 121用限制性內(nèi)切酶Hindi 11和EcoRI雙酶切，得到的35S:⑶S片段用T4DNA Iigase連入同樣用HindIII和EcoRI雙酶切的CAMBIA公司的PCAMBIA1300載體,新的載體被命名為pl30035S:⑶S。
[0251]從EFLl基因的編碼起始位點ATG開始設計5’端引物，于終止密碼處設計3’端引物:
[0252]引物5:5，-tctagaATGAAGTCTCTTAATGATCTTCCTGC-3，(SEQ ID NO:8)；
[0253]引物6:5，-gagctcTTAACGCCGGTCACTGCGTTCG-3’ (SEQ ID NO:9)。
[0254]其中，引物5中序列tctaga是XbaI的酶切位點，引物6中序列g(shù)agctc是SacI的酶切位點。
[0255]提取擬南芥野生型Col-O幼苗的總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA作為模板，用以上引物擴增EFLl基因的全長，其大小為1842bp，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列表中的SEQ ID N0:1所示。
[0256]具體反應條件是:94°C預變性5分鐘；94°C變性30秒；60°C退火30秒；72°C延伸2分鐘；30個循環(huán)；72°C延伸10分鐘。反應結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收，產(chǎn)物連入PEASY-T-Blunt載體中，篩選陽性克隆并進行測序驗證，序列如SEQ ID NO:2所示，該質(zhì)粒稱為pT-EFLl。
[0257]用限制性內(nèi)切酶XbaI和SacI雙酶切pT-EFLl，得到的EFLl基因用T4DNA Iigase連入同樣用XbaI和SacI雙酶切的pl30035S:⑶S載體，得到植物表達載體pCAMBIA35S:EFLl，該質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)如圖3所示。在圖3中，LB和RB分別為T-DNA的左邊界和右邊界；HPTII表示潮霉素抗性；P35S表示CaMV35S基因的啟動子；T35S表示CaMV35S基因的終止子；Tnos表示NOS基因的終止子；HindII1、Xba1、SacI和EcoRI分別表示限制性內(nèi)切酶的酶切位點。
[0258](2)過表達全長EFLl轉(zhuǎn)基因植株的獲得和分子鑒定
[0259]利用熱激法將植物表達載體pCAMBIA35S =EFLl轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101菌株。
[0260]利用蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥野生型Col-Ο。對收獲的Tl代種子進行潮霉素抗性篩選，獲得抗性植株。對轉(zhuǎn)基因 植株進行分子鑒定，獲得PCR陽性的轉(zhuǎn)基因植株。鑒定引物如下:
[0261]引物7:5，-CACTATCCTTCGCAAGACCCTTCC-3，(SEQ ID NO:10)；
[0262]引物2:5，-TTAACGCCGGTCACTGCGT-3，(SEQ ID NO:5)
[0263]引物7位于CaMV35S啟動子中，引物2位于EFLl編碼區(qū)，引物7和引物2的擴增產(chǎn)物為1916bp，有此擴增產(chǎn)物的植株為轉(zhuǎn)基因陽性植株。
[0264](3)轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性鑒定
[0265]先將野生型Col-O和上步獲得的3個過表達株系(即轉(zhuǎn)基因陽性植株)在MS培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)5天，再轉(zhuǎn)入不含有NaCl的MS培養(yǎng)基和含有150mM NaCl的MS培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)10天，對四組植物材料NaCl處理后的存活率進行統(tǒng)計比較。結(jié)果表明，經(jīng)NaCl處理的野生型Col-O的存活率為49%，而經(jīng)同樣濃度NaCl處理的3個過表達株系的存活率分別為87%、90%和85%，EFLl轉(zhuǎn)基因株系的存活率均高于對照的存活率。該實驗說明EFLl基因具有增強擬南芥耐鹽性的作用。
[0266]實施例4.過表達EFLl片段轉(zhuǎn)基因植株的獲得和耐鹽性鑒定
[0267](1)EFLl蛋白結(jié)構(gòu)分析和過表達EFLl片段植物表達載體的構(gòu)建
[0268]EFLl蛋白全長613個氨基酸，其中186-416個氨基酸是保守的SNW結(jié)構(gòu)域和NLS(核定位)序列，N末端為1-185個氨基酸，C末端為416-613個氨基酸。EFLl蛋白全長和片段的結(jié)構(gòu)，如圖4A所示。在圖4中，SNW domain表示保守的SNW結(jié)構(gòu)域,NLS表示核定位序列，數(shù)字表示氨基酸的位置。
[0269]以擬南芥幼苗cDNA為模板，利用PCR方法獲得不同EFLl蛋白片段的編碼序列。其中，
[0270]1.1擴增蛋白片段EFLl (1-416)的編碼序列的引物為:
[0271]引物5:5，-tctagaATGAAGTCTCTTAATGATCTTCCTGC-3，(SEQ ID NO:8)；
[0272]引物8:5，-gagctcTTACCTTCTCTCCCTCTCTCTTTCCCTG-3，(SEQ ID NO:11)；
[0273]弓丨物5位于EFLl基因起始密碼子ATG的位置，引物8對應于SNW結(jié)構(gòu)域和核定位(NLS)序列的末端并人為加入終止密碼子TAA，擴增片段長度為1251bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示，編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示，為蛋白片段EFLl (1-416)，即EFLl的N末端和SNW結(jié)構(gòu)域及核定位序列。
[0274]SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列如下:
【權(quán)利要求】
1.一種具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì),其為選自下列的至少一種: 1)具有SEQID NO:1所不的氣基酸序列； 2)對SEQID NO:1所示的氨基酸序列進行一個或多個氨基酸的取代、缺失或添加而獲得的且具有mRNA到接功能的蛋白質(zhì)；和 3)與SEQID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性且具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)。
2.一種分離的寡核苷酸，其編碼權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)， 任選地，所述分離的寡核苷酸為選自下列的至少一種: 1)具有SEQID NO:2所示的核苷酸序列； 2)對SEQID NO:2所示的核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失或添加而獲得的且能夠編碼具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)的寡核苷酸； 3)與SEQID NO:2所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性且能夠編碼具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)的寡核苷酸； 4)在高等嚴緊條件下能夠與SEQID NO:2所示的核苷酸序列雜交且能夠編碼具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)的寡核苷酸；和 5)與SEQID NO:2所示的核苷酸序列互補且能夠編碼具有mRNA剪接功能的蛋白質(zhì)的寡核苷酸。
3.一種構(gòu)建體，其特征在于，包含權(quán)利要求2所述的分離的寡核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體呈選自質(zhì)粒、噬菌體、人工染色體、粘粒以及病毒的至少一種的形式， 任選地，所述構(gòu)建體呈質(zhì)粒的形式， 任選地，所述構(gòu)建體為pCAMBIA系列載體，優(yōu)選為pCAMBIA1300。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建體，其特征在于，進一步包括啟動子，所述啟動子為選自增強型、組成型、組織特異型和誘導型啟動子的至少一種， 任選地，所述啟動子為CAMV35S啟動子、玉米Ubiquitin啟動子、水稻actinl啟動子或2S1啟動子，優(yōu)選CAMV35S啟動子， 任選地，進一步包括增強子，所述增強子為ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子。
6.一種重組細胞，其特征在于，所述重組細胞含有權(quán)利要求2所述的分離的寡核苷酸或權(quán)利要求3-5任一項所述的構(gòu)建體， 任選地，所述重組細胞為大腸桿菌細胞或農(nóng)桿菌細胞，優(yōu)選為農(nóng)桿菌細胞。
7.一種制備轉(zhuǎn)基因植物細胞的方法，其特征在于，包括: 使用權(quán)利要求3-5任一項所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體植物細胞；以及 分離轉(zhuǎn)基因植物細胞， 任選地，所述轉(zhuǎn)化是通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染法進行的， 任選地，所述受體植物細胞呈細胞、組織或器官的形式，優(yōu)選呈組織的形式，更優(yōu)選呈愈傷組織的形式， 任選地，所述植物為擬南芥或水稻。
8.—種轉(zhuǎn)基因植物細胞或其培養(yǎng)物，其是通過權(quán)利要求7所述的方法制備獲得的， 任選地，所述轉(zhuǎn)基因植物細胞呈細胞、組織或器官的形式。
9.一種提高植物耐鹽性的方法，其特征在于， 使所述植物過表達權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于， 利用權(quán)利要求3-5任一項所述的構(gòu)建體，制備轉(zhuǎn)基因植物，使所述轉(zhuǎn)基因植物過表達權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)， 任選地，所述植物為擬南芥或水稻。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，通過選自下列至少之一的途徑制備轉(zhuǎn)基因植物: O使用權(quán)利要求3-5任一項所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體植物；以及 分離轉(zhuǎn)基因植株，以便獲得轉(zhuǎn)基因植物， 2)利用權(quán)利要求7所述的方法，制備轉(zhuǎn)基因植物細胞；以及 對所述轉(zhuǎn)基因植物細胞進行培養(yǎng)，以便獲得轉(zhuǎn)基因植物， 任選地，途徑1)和2)進一步包括: 收獲所述轉(zhuǎn)基因植物的種子； 分離轉(zhuǎn)基因種子；以及 對所述轉(zhuǎn)基因種子進行培養(yǎng)，以便獲得后代轉(zhuǎn)基因植物。
【文檔編號】C12N5/10GK103910788SQ201410154933
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月17日
【發(fā)明者】馬力耕, 朱正歌, 馮金林 申請人:首都師范大學