一種流感病毒血凝素rna干擾序列及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種流感病毒血凝素RNA干擾序列及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種流感病毒血凝素RNA干擾序列，以及能表達(dá)該序列的載體。本發(fā)明RNA干擾序列及其表達(dá)載體能夠有效抑制動(dòng)物體內(nèi)流感病毒的復(fù)制，并且在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)沒有明顯的副作用，為流感病毒的防治提供了一種新的有效選擇，在制備抗流感藥物中有很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種流感病毒血凝素RNA干擾序列及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種RNA干擾序列及其應(yīng)用，具體涉及一種流感病毒血凝素RNA干擾序列及其應(yīng)用，屬于流感病毒防治領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]流感病毒(Influenza viruses)能夠引起人類急性呼吸道傳染病，并具有高度傳染性，可以發(fā)生流行，甚至是世界范圍的大流行。如1918年的“西班牙大流感”，它在全球范圍內(nèi)造成了大約4000萬人死亡，死亡人數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于一戰(zhàn)的死亡人數(shù)。目前每年仍有數(shù)十萬人死于季節(jié)性流感感染。對(duì)于流感病毒的防治，現(xiàn)在主要有疫苗接種以及藥物治療，如奧司他韋，扎那米韋和金剛烷胺等。但流感病毒的高變異性使其突破了宿主免疫屏障，并對(duì)疫苗和上述藥物產(chǎn)生了耐藥性。
[0003]流感病毒屬于正粘病毒科，是分節(jié)段的負(fù)鏈ssRNA病毒。根據(jù)其基質(zhì)蛋白和核蛋白的抗原性可以分為甲型、乙型和丙型流感病毒，以甲型的流行規(guī)模最大，乙型次之，丙型極少引起流行。完整的流感病毒包含內(nèi)中外3層結(jié)構(gòu)，其中外層為來自于宿主細(xì)胞的脂質(zhì)雙層膜，其表面主要有兩種糖蛋白刺突，即血凝素(Hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase, NA);核心是分節(jié)段的RNA片段,與核蛋白(NP)組成核糖核蛋白(RNP),含有RNA多聚酶；基質(zhì)蛋白位于外層包膜與核心之間。其中，血凝素膜蛋白在流感病毒的生命周期中發(fā)揮了重要作用。通過血凝素和細(xì)胞表面受體的結(jié)合，使病毒吸附在細(xì)胞上，然后經(jīng)胞吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞。它就好比病毒手中的“鑰匙”，病毒以此來打開及入侵人和動(dòng)物的細(xì)胞。如果血凝素的表達(dá)受到抑制，則會(huì)很大程度上影響流感病毒的感染及復(fù)制過程。
[0004]RNA干擾是由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默。利用該方法可以設(shè)計(jì)靶向流感病毒血凝素基因的RNA干擾序列，從而抑制流感病毒的感染和復(fù)制。經(jīng)過檢索，目前尚無流感病毒血凝素基因的RNA干擾序列的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種流感病毒血凝素RNA干擾序列及其應(yīng)用。
[0006]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案如下:
一種流感病毒血凝素RNA干擾序列，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體。該表達(dá)載體能表達(dá)如SEQ ID N0.1所示的流感病毒血凝素RNA干擾序列，該RNA干擾序列是短發(fā)夾shRNA序列。所述載體中表達(dá)流感病毒血凝素RNA干擾序列的表達(dá)框架的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，或者如反義鏈SEQID N0.3 所示。 [0008]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果:
本發(fā)明的流感病毒血凝素RNA干擾序列及其表達(dá)載體在細(xì)胞和動(dòng)物水平都證明能夠有效地抑制流感病毒的復(fù)制，并且在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)沒有明顯的副作用，這為流感病毒的防治提供了一種新的有效選擇，在制備抗流感藥物中有很好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1為流感病毒感染穩(wěn)定表達(dá)血凝素shRNA和luciferase shRNA的細(xì)胞中血凝素蛋白的表達(dá)不意圖。
[0010]圖2為流感病毒感染穩(wěn)定表達(dá)血凝素shRNA和luciferase shRNA的細(xì)胞后上清中的病毒滴度示意圖。
[0011]圖3為轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠交配得到的子代小鼠基因型鑒定示意圖。其中，M為Marker，P為陽性對(duì)照，N為陰性對(duì)照，1-11分別代表11只子代小鼠。
[0012]圖4為流感病毒感染的野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠肺臟中血凝素蛋白的表達(dá)示意圖。
[0013]圖5為流感病毒感染的野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠肺臟中病毒滴度示意圖。
[0014]圖6為流感 病毒感染野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠的生存曲線。實(shí)線代表野生型小鼠，虛線代表轉(zhuǎn)基因小鼠。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0016]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0017]實(shí)施例1、一種流感病毒血凝素RNA干擾序列在細(xì)胞水平對(duì)流感病毒復(fù)制的影響 一、RNA干擾序列的設(shè)計(jì)
用流感病毒A/WSN/1933 (HlNl)的血凝素mRNA (GenBank登錄號(hào):CY034132)序列作為模版來設(shè)計(jì)shRNA目標(biāo)序列。設(shè)計(jì)時(shí)祀向序列落在血凝素的保守區(qū)段。通過Invitrogen公司的在線合成軟件合成的RNA干擾序列為5’ -GGGAGGATGAACTATTACT-3’。
[0018]二、穩(wěn)定表達(dá)流感病毒血凝素shRNA的A549細(xì)胞系的構(gòu)建
1、攜帶流感病毒血凝素特異性shRNA的質(zhì)粒構(gòu)建
選用慢病毒表達(dá)載體pSIH-Hl-GFP (System Biosciences)構(gòu)建能表達(dá)流感病毒血凝素RNA干擾序列的質(zhì)粒。首先，用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI (Takara)酶切慢病毒表達(dá)載體pSIH-Hl-GFP，37°C水浴4 h后，用DNA純化回收試劑盒(天根生化科技有限公司)回收載體骨架。然后，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成如SEQ ID N0.2和SEQ IDN0.3所示的兩條單鏈DNA，這兩條單鏈DNA的5’端分別直接引入了 BamHI和EcoRI這兩個(gè)酶切位點(diǎn)的粘性末端，將合成的單鏈DNA退火后得到雙鏈DNA。最后，將此雙鏈DNA與之前經(jīng)BamHI和EcoRI酶切處理的載體骨架連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，篩選陽性克隆，用質(zhì)粒小提試劑盒(天根生化科技有限公司)提取質(zhì)粒。再將質(zhì)粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒名稱為pSIH-HA shRNA。陰性對(duì)照 shRNA 序列(SEQ ID N0.4)為 5’-CTTACGCTGAGTACTTCGA-3’，名稱為 pSIH-luciferase shRNA。
[0019]2、病毒包裝
選用293T細(xì)胞系包裝病毒。接種適量293T細(xì)胞于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，添加DMEM(Gibco)完全培養(yǎng)基8 ml(完全培養(yǎng)基中含有100 units/mL的青鏈霉素和10%的Gibco胎牛血清)，然后置于37°C，5% CO2濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)293T細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%時(shí)，將 pSIH-HA shRNA、pSIH-luciferase shRNA 分別與慢病毒載體包裝質(zhì)粒 PLPl、PLP2和PLP-VSVG (Invitrogen)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，使用的轉(zhuǎn)染試劑是Lipofectamine 2000(Invitrogen)。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞置于37°C，5% CO2濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，隨后收集細(xì)胞上清，此時(shí)上清中分別含有編碼血凝素shRNA和luciferase shRNA的假病毒顆粒。
[0020]3、細(xì)胞感染
首先，將經(jīng)過0.25%的胰酶(Sigma)消化后的A549細(xì)胞適量分裝于15 ml離心管內(nèi)；然后選用0.22μπι的濾器，把收集到的病毒液過濾于已含有A549細(xì)胞的15 ml離心管中；再避光加入終濃度為8 μ g/ml的Polybrene(Sigma),增強(qiáng)病毒的感染效率；最后用移液器吹吸病毒液數(shù)次，使其充分混勻，分裝于12孔板內(nèi)。將12孔板置于水平離心機(jī)內(nèi)，32 V,2200 rpm，懸浮離心感染2h。離心結(jié)束后，每孔添加DMEM完全培養(yǎng)基0.5 ml，再置于37 °C，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，傳代細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀分選GFP陽性的細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)shRNA的A549細(xì)胞系。穩(wěn)定表達(dá)血凝素shRNA和luciferase shRNA的細(xì)胞系生長(zhǎng)正常，且在傳代10次后未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性作用。
[0021]三、細(xì)胞水平檢測(cè)血凝素shRNA對(duì)流感病毒血凝素的干擾效果及對(duì)流感病毒復(fù)制的影響
為了分析血凝素shRNA對(duì)血凝素蛋白表達(dá)及病毒復(fù)制的影響，用流感病毒感染穩(wěn)定表達(dá)血凝素shRNA和luciferase shRNA的細(xì)胞系，18 h后分別收集上清和細(xì)胞。細(xì)胞收集后裂解，Western blot分析流感病毒血凝素蛋白的表達(dá)情況，同時(shí)以β-actin基因的表達(dá)水平作為蛋白定量的參照。如圖1所示，穩(wěn)定表達(dá)血凝素shRNA的細(xì)胞系中血凝素的蛋白表達(dá)明顯少于對(duì)照細(xì)胞。
[0022]收集到的上清用 空斑試驗(yàn)檢測(cè)病毒粒子數(shù)量:將MDCK細(xì)胞鋪于六孔板中，細(xì)胞濃度為5X10S/^L，37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24h。吸去培養(yǎng)基，用PBS洗細(xì)胞2_3次，然后加入收集到的上清液(需經(jīng)過10倍梯度稀釋，每個(gè)稀釋度設(shè)置2個(gè)平行孔)，置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱，使病毒吸附lh，每20min傾斜搖晃細(xì)胞板一次。吸附Ih后，吸去上清，用PBS洗細(xì)胞2-3次。微波融化1.6%瓊脂(Promega)后置56°C水浴中，37°C溫育2XDMEM液。混合
1.6%瓊脂和2 XDMEM，使其室溫冷卻至40°C，加終濃度為I μ g/mL的TPCK-胰酶(Sigma),然后將混合液2mL/孔加入6孔板中。將細(xì)胞板置于生物安全柜內(nèi)直至膠板凝固，顛倒放置于37°C，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中2-3天。當(dāng)白色斑點(diǎn)出現(xiàn)后，計(jì)數(shù)空斑。如圖2所示，穩(wěn)定表達(dá)血凝素shRNA的細(xì)胞上清中病毒數(shù)量明顯少于對(duì)照細(xì)胞。
[0023]實(shí)施例2、一種流感病毒血凝素RNA干擾序列在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物水平對(duì)流感病毒復(fù)制的影響
一、穩(wěn)定表達(dá)血凝素shRNA轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建
實(shí)驗(yàn)中所用小鼠全部來自于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。將pSIH-HA shRNA質(zhì)粒用Sca I (Takara)單酶切，線性化的質(zhì)粒純化后用顯微注射法注射到BALB/C小鼠受精卵的原核內(nèi)，將注射后狀態(tài)良好的胚胎移植到代孕鼠的輸卵管中，飼養(yǎng)后鑒定是否受孕以及個(gè)體發(fā)育狀況。將發(fā)育良好的受孕鼠的子代鼠通過PCR方法檢測(cè)篩選出轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。用于PCR擴(kuò)增的引物序列如下:
上游引物:5’_ AAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATG-3’ (SEQ ID N0.5)
下游引物:5’_ GGAAGGTCCGCTGGATTGA-3’ (SEQ ID N0.6)轉(zhuǎn)基因陽性小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且與野生型小鼠交配后，能夠產(chǎn)下轉(zhuǎn)基因陽性的子代小鼠，genotyping結(jié)果如圖3所示。
[0024]二、血凝素shRNA在轉(zhuǎn)基因小鼠中對(duì)流感病毒復(fù)制的影響
為了分析血凝素shRNA在動(dòng)物水平對(duì)流感病毒復(fù)制的影響，用流感病毒感染體重18-20g，6-8周齡野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠。感染3天后，脫頸處死小鼠，取出小鼠肺臟，檢測(cè)小鼠肺臟中病毒滴度和血凝素蛋白表達(dá)情況。檢測(cè)蛋白表達(dá)情況時(shí)，用組織裂解液研磨小鼠肺臟，離心得到的上清準(zhǔn)備樣品，Western blot分析血凝素蛋白的表達(dá)情況。如圖4所示，與野生型小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠肺臟中血凝素蛋白的表達(dá)量明顯減少。檢測(cè)小鼠肺臟中病毒滴度時(shí)，用PBS研磨后離心取上清，空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上清中的病毒粒子數(shù)量。如圖5所示，與野生型小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠肺臟中病毒載量也明顯減少。另外感染野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠各15只，統(tǒng)計(jì)小鼠的生存時(shí)間。當(dāng)小鼠體重下降到接近原來體重的75%時(shí)，處死小鼠且記為死亡。通過觀察發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠的生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)(圖6)，說明小鼠對(duì)流感病毒的抵抗能力增強(qiáng)。
[0025]以上所述僅為本發(fā)明的 較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種流感病毒血凝素RNA干擾序列，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種表達(dá)載體pSIH-HA shRNA，其特征在于能表達(dá)如SEQ ID N0.1所示的流感病毒血凝素RNA干擾序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其特征在于所述載體中表達(dá)流感病毒血凝素RNA干擾序列的表達(dá)框架的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，或者如反義鏈SEQ ID N0.3所示。
4.一種如權(quán)利要求1所述的流感病毒血凝素RNA干擾序列，或者如權(quán)利要求2-3任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體，在構(gòu)建干擾流感病毒血凝素的細(xì)胞系中的應(yīng)用。
5.一種如權(quán)利要求1所述的流感病毒血凝素RNA干擾序列，在構(gòu)建干擾流感病毒血凝素的BALB/C轉(zhuǎn)基因小鼠中的應(yīng)用。
6.一種如權(quán)利要求1所述的流感病毒血凝素RNA干擾序列，在構(gòu)建干擾流感病毒血凝素的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK103923921SQ201410154832
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】陳吉龍, 王松, 池曉娟, 羅小琴 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)