本發(fā)明涉及疫苗
技術(shù)領(lǐng)域：
，同時(shí)涉及基因工程技術(shù)，具體涉及一種重組雞新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎三聯(lián)滅活疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
：禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus，AIV)屬于正黏病毒科中的A型流感病毒屬，基因組由8個(gè)單股負(fù)鏈的RNA片段組成，片段1～8由大到小依次命名為PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS基因，根據(jù)其表面抗原血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同劃分亞型，迄今已發(fā)現(xiàn)16種HA和9種NA亞型，該病毒感染禽類(lèi)從輕度上呼吸道疾病、產(chǎn)蛋量降低，直至急性全身致死性疾病，對(duì)公共衛(wèi)生也造成了威脅。IBV屬冠狀病毒科冠狀病毒屬，基因組全長(zhǎng)大小約為27.4kb～27.7kb，為不分節(jié)段的單股正鏈RNA。編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白；其中，纖突蛋白(S)位于病毒粒子表層囊膜上，是構(gòu)成IBV表面纖突的主要成分，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體及血凝抑制抗體，并能夠與細(xì)胞受體結(jié)合并引起病毒和細(xì)胞膜的融合。新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus，NDV)為副粘病毒科、腮腺炎病毒屬、禽副粘病毒1型病毒，為單股負(fù)鏈不分節(jié)段的RNA病毒，基因組長(zhǎng)約15kb，其結(jié)構(gòu)為3′-NP-P-M-F-HN-L-5′。NDV的反向遺傳操作系統(tǒng)是Peeters等在1999年建立的，該技術(shù)是通過(guò)在體外構(gòu)建RNA病毒的感染性分子克隆，將病毒基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在DNA分子水平上對(duì)其進(jìn)行各種體外人工操作，由病毒基因組cDNA和各種輔助蛋白來(lái)組裝新的RNA病毒。該操作系統(tǒng)的核心是構(gòu)建基因組全長(zhǎng)感染性cDNA克隆，可通過(guò)中間過(guò)程人為加入DNA環(huán)節(jié)，在DNA水平上對(duì)RNA病毒基因組進(jìn)行各種體外人工改造，如基因突變、基因插入、基因敲除、基因置換等，為新型疫苗的研制和開(kāi)發(fā)提供了新的思路?，F(xiàn)有技術(shù)中AIV、IBV、NDV三聯(lián)疫苗多為三種抗原的混合苗，需要分別制備三種抗原，這一方面加大了制備難度，同時(shí)，由于三種抗原均屬于全病毒抗原，因此免疫效果容易相互影響。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種重組雞新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎三聯(lián)滅活疫苗的制備方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中缺乏一種上述疫苗的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有技術(shù)中上述三聯(lián)疫苗的制備過(guò)程中需要分別制備三種抗原。本發(fā)明要解決的再一技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有技術(shù)中上述三聯(lián)疫苗的滴度較低。為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種重組雞新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎三聯(lián)滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：將雞傳染性支氣管炎病毒S1基因插入至新城疫病毒基因組的F-HN之間，得到重組新城疫病毒rLaSota/S1，而后將禽流感病毒HA基因插入至重組新城疫病毒rLaSota/S1基因組的P-M之間，即得到重組新城疫病毒rLaSota/S1-HA；利用所述重組新城疫病毒rLaSota/S1-HA表達(dá)抗原，而后制備疫苗。作為優(yōu)選，所述rLaSota/S1是通過(guò)以下方法制備的：1)將新城疫病毒的NP、P、L三個(gè)基因通過(guò)RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增，而后將三者分別克隆到表達(dá)質(zhì)粒載體pTM1，分別得到重組質(zhì)粒pTM-NP、pTM-P、pTM-L；2)通過(guò)特異性引物使TOPOTACloning載體線性化，利用IBV-M41株為模板，通過(guò)特異性引物擴(kuò)增S1基因，得到rLaSota/S1重組亞克??；而后將rLaSota/S1亞克隆線性化后連接到LaSota全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒中，將其轉(zhuǎn)化到Stbl2感受態(tài)細(xì)胞，30℃培養(yǎng)24小時(shí)再通過(guò)DNA核苷酸序列分析鑒定篩選出陽(yáng)性克隆，再將陽(yáng)性克隆株純化，即得到重組質(zhì)粒pLaSota/S1；3)在細(xì)胞板上以每孔106個(gè)的加入量鋪入HEp-2細(xì)胞，預(yù)先用MVA/T7A感染；通過(guò)轉(zhuǎn)染試劑，將pTM-NP、pTM-P、pTM-L和pLaSota/S1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEp-2細(xì)胞上，轉(zhuǎn)染后6小時(shí)后去掉轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，并加入新鮮的5％FBS的DMEM培養(yǎng)基；72小時(shí)，通過(guò)將轉(zhuǎn)染細(xì)胞反復(fù)凍融3次收獲重組病毒rLaSota/S1。作為優(yōu)選，所述rLaSota/S1-HA是通過(guò)以下方法制備的：A)將新城疫病毒的NP、P、L三個(gè)基因通過(guò)RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增，而后將三者分別克隆到表達(dá)質(zhì)粒載體pTM1，分別得到重組質(zhì)粒pTM-NP、pTM-P、pTM-L；B)通過(guò)特異性引物使TOPOTACloning載體線性化，利用禽流感病毒為模板，通過(guò)特異性引物擴(kuò)增S1基因，得到rLaSota/HA重組亞克??；而后將rLaSota/HA重組亞克隆線性化后連接到rLaSota/S1的全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒中，將其轉(zhuǎn)化到Stbl2感受態(tài)細(xì)胞，30℃培養(yǎng)24小時(shí)再通過(guò)DNA核苷酸序列分析鑒定篩選出陽(yáng)性克隆，再將陽(yáng)性克隆株純化，命名為pLaSota/S1-HA，即得到重組質(zhì)粒pLaSota/S1-HA；C)在細(xì)胞板上以每孔106個(gè)的加入量鋪入HEp-2細(xì)胞，預(yù)先用MVA/T7A感染；通過(guò)轉(zhuǎn)染試劑，將pTM-NP、pTM-P、pTM-L和pLaSota/S1-HA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEp-2細(xì)胞上，轉(zhuǎn)染后6小時(shí)后去掉轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，并加入新鮮的5％FBS的DMEM培養(yǎng)基；72小時(shí)，通過(guò)將轉(zhuǎn)染細(xì)胞反復(fù)凍融3次收獲重組病毒rLaSota/S1-HA。作為優(yōu)選，所述表達(dá)抗原包括以下步驟：將重組新城疫病毒rLaSota/S1-HA株以1:8000倍稀釋?zhuān)蚰仪唤臃N10日齡SPF雞胚，每胚0.1mL，置相對(duì)濕度60～65％，溫度33～35℃條件下孵育，收集120～144h死亡胚的尿囊液，即得到抗原溶液。作為優(yōu)選，所述抗原溶液中EID50≥108.7/0.1ml。作為優(yōu)選，所述制備疫苗包括以下步驟：抗原溶液滅活后作為水相，與疫苗油相以1:3的比例混合，乳化，即得到所述重組雞新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎三聯(lián)滅活疫苗。作為優(yōu)選，所述抗原溶液滅活包括以下步驟：按0.2％(v/v)的終濃度為加入甲醛，混合后于2～8℃條件下下滅活24小時(shí)，期間每6小時(shí)攪拌1次，而后于37℃保持2小時(shí)。本發(fā)明提供了一種重組雞新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎三聯(lián)滅活疫苗的制備方法，該技術(shù)方案通過(guò)對(duì)雞新城疫病毒LaSota株的基因改造而實(shí)現(xiàn)。以重組NDV弱毒株rLaSota株為載體，首先將雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)S1基因插入F-HN之間，經(jīng)利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建表達(dá)S1蛋白的重組新城疫病毒rLaSota/S1,結(jié)果表明，rLaSota可作為活載體穩(wěn)定表達(dá)S1蛋白。而后構(gòu)建表達(dá)HA基因的重組新城疫病毒rLaSota/S1-HA,即在重組新城疫病毒rLaSota/S1的P-M之間插入HA基因。對(duì)其進(jìn)行免疫原性評(píng)估。結(jié)果表明通過(guò)常規(guī)滅活疫苗工藝制備出的重組雞新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎三聯(lián)滅活疫苗其新城疫、禽流感和傳染性支氣管炎均有較強(qiáng)的保護(hù)作用。該構(gòu)建重組疫苗策略可增強(qiáng)重組子的表達(dá)，最大程度減少其位于序列后部蛋白表達(dá)損失量。該重組疫苗具有載體病毒繁殖滴度高，易于生產(chǎn)；免疫一次可有效預(yù)防三種動(dòng)物疫?。蛔⑸浜?jiǎn)單；填補(bǔ)了活載體疫苗類(lèi)基因工程疫苗的空白，具有廣泛的應(yīng)用前景。具體實(shí)施方式以下將對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過(guò)多不必要的細(xì)節(jié)，在以下實(shí)施例中對(duì)屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。除有定義外，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。實(shí)施例1(重組雞新城疫病毒的構(gòu)建)1、輔助性質(zhì)粒NP、P、L基因的構(gòu)建將NP、P、L三個(gè)基因通過(guò)RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增，然后分別將三個(gè)基因克隆到表達(dá)質(zhì)粒載體pTM1,所構(gòu)建的輔助質(zhì)粒經(jīng)DNA序列分析鑒定，將陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pTM-NP、pTM-P、pTM-L。2、表達(dá)S1蛋白的重組新城疫病毒的構(gòu)建通過(guò)一對(duì)特異性引物pM-s和pM-r使和TOPOTACloning載體線性化，利用IBV-M41株為模板，用一對(duì)特異性引物S1-F和S1-R擴(kuò)增S1基因，，得到rLaSota/S1重組亞克隆。最后通過(guò)In-fusionPCRCloningKit將rLaSota/S1亞克隆線性化后連接到LaSota全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒中，將其轉(zhuǎn)化到Stbl2感受態(tài)細(xì)胞，30℃培養(yǎng)24小時(shí)再通過(guò)DNA核苷酸序列分析鑒定篩選出陽(yáng)性克隆，再將陽(yáng)性克隆株用QIAprepSpinMiniprepKit純化，命名為pLaSota/S1。3、重組rLaSota/S1病毒的拯救鋪約1*106個(gè)HEp-2細(xì)胞至每孔細(xì)胞板中，預(yù)先用MVA/T7A感染。通過(guò)轉(zhuǎn)染試劑，按說(shuō)明書(shū)將pTM-NP、pTM-P、pTM-L和pLaSota/S1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEp-2細(xì)胞上，轉(zhuǎn)染后6小時(shí)，去掉轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，并加入新鮮的5％FBS的DMEM培養(yǎng)基。72小時(shí)，通過(guò)將轉(zhuǎn)染細(xì)胞反復(fù)凍融3次收獲重組病毒，將重組病毒命名為rLaSota/S1，在10日齡SPF胚上增殖三代后保存在-80℃冰箱中。4、S1蛋白表達(dá)鑒定及病毒生物學(xué)特性檢測(cè)首先通過(guò)RT-PCR方法用一對(duì)特異性引物檢查插入片段的大小，同時(shí)送測(cè)序進(jìn)行序列分析。然后利用紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)、半數(shù)雞胚感染量試驗(yàn)、雞胚平均死亡時(shí)間及腦內(nèi)致病指數(shù)試驗(yàn)和生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)，對(duì)rLaSota/S1重組病毒的滴度及生物學(xué)特性進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果如表1所示。其結(jié)果表明，該重組病毒的雞胚平均死亡時(shí)間有所增加和腦內(nèi)致病指數(shù)為0.1，以上兩項(xiàng)指標(biāo)表明其病毒已被致弱，但對(duì)雞胚仍有較強(qiáng)的感染能力。表1rLaSota/S1重組病毒的滴度及致病作用檢測(cè)結(jié)果MDTICPIEID50HALaSota96h0.15109EID50/0.1ml29rLaSota/S1120h0.1108.7EID50/0.1ml295、表達(dá)HA蛋白的重組新城疫病毒的構(gòu)建此處插入的HA基因序列來(lái)自禽流感病毒H9亞型。通過(guò)一對(duì)特異性引物pNP-s和pNP-r使和TOPOTACloning載體線性化，用一對(duì)特異性引物HA1和HA2擴(kuò)增HA基因，得到rLaSota/HA重組亞克隆。最后通過(guò)In-fusionPCRCloningKit將rLaSota/HA亞克隆線性化后連接到rLaSota/S1的全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒中，將其轉(zhuǎn)化到Stbl2感受態(tài)細(xì)胞，30℃培養(yǎng)24小時(shí)再通過(guò)DNA核苷酸序列分析鑒定篩選出陽(yáng)性克隆，再將陽(yáng)性克隆株用QIAprepSpinMiniprepKit純化，命名為pLaSota/S1-HA。6、重組rLaSota/S1-HA病毒的拯救鋪約1*106個(gè)HEp-2細(xì)胞至每孔細(xì)胞板中，預(yù)先用MVA/T7A感染。通過(guò)轉(zhuǎn)染試劑，按說(shuō)明書(shū)將pTM-NP、pTM-P、pTM-L和pLaSota/S1-HA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEp-2細(xì)胞上，轉(zhuǎn)染后6小時(shí)，去掉轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，并加入新鮮的5％FBS的DMEM培養(yǎng)基。72小時(shí)，通過(guò)將轉(zhuǎn)染細(xì)胞反復(fù)凍融3次收獲重組病毒，將重組病毒命名為rLaSota/S1-HA，在10日齡SPF胚上增殖三代后保存在-80℃冰箱中。7、S1蛋白表達(dá)鑒定及病毒生物學(xué)特性檢測(cè)首先通過(guò)RT-PCR方法用一對(duì)特異性引物檢查插入片段的大小，同時(shí)送測(cè)序進(jìn)行序列分析。然后利用半數(shù)雞胚感染量試驗(yàn)、雞胚平均死亡時(shí)間及腦內(nèi)致病指數(shù)試驗(yàn)和生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)，對(duì)rLaSota/S1-HA重組病毒的滴度及生物學(xué)特性進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果如表2所示。其結(jié)果表明，該重組病毒的雞胚平均死亡時(shí)間有所增加和腦內(nèi)致病指數(shù)為0，以上兩項(xiàng)指標(biāo)表明其病毒已被致弱，但對(duì)雞胚仍有較強(qiáng)的感染能力。表2rLaSota/S1-HA重組病毒的滴度及致病作用檢測(cè)結(jié)果MDTICPIEID50LaSota96h0.15109EID50/0.1mlrLaSota/S1120h0.1108.7EID50/0.1mlrLaSota/S1-HA1200108.5EID50/0.1ml實(shí)施例2(重組新城疫病毒的繁殖及三聯(lián)滅活疫苗的制備)1、病毒繁殖雞胚的選用來(lái)自飼養(yǎng)管理良好的健康雞群所產(chǎn)的雞蛋，每批雞胚要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格篩選。外檢共4項(xiàng)：白殼、大小、破損及臟胚，內(nèi)檢共9項(xiàng)：去除沙殼、偏氣室、游氣室、倒置胚、無(wú)精蛋、終止胚、弱胚、污染胚、裂縫胚。檢驗(yàn)合格的雞胚可以作為制苗材料。將重組新城疫病毒rLaSota/S1-HA株，以1:8000倍稀釋?zhuān)蚰仪唤臃N10日齡SPF雞胚，每胚0.1mL，置相對(duì)濕度60％～65％，溫度33～35℃條件下孵育，不必翻蛋，收集120-144h死亡胚的尿囊液，氣室向上直立，4℃冷胚24h，收獲將冷卻的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，以無(wú)菌剝除氣室部位囊膜殼，在收獲胚液前，應(yīng)逐個(gè)檢查雞胚，如胎兒腐敗、胚液渾濁及有任何污染可疑者棄去不用，收獲雞胚尿囊液于滅菌容器中，測(cè)得EID50可達(dá)到108.7/0.1ml。檢測(cè)：對(duì)收獲的病毒樣品進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)和病毒含量測(cè)定，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，HA效價(jià)≥9lg2，每0.1ml病毒含量應(yīng)≥108.5EID50。對(duì)檢驗(yàn)合格的樣品注明名稱(chēng)、收獲日期、代次等。收獲的胚液滅活前置4℃保存。2、滅活滅活經(jīng)濃縮檢驗(yàn)合格后的兩種病毒雞胚尿囊液分別注入滅活罐，按0.2％的終濃度為加入甲醛(或其他滅活劑)溶液，邊加邊攪拌，使其充分混合，置2～8℃下滅活24小時(shí)，期間6小時(shí)攪拌1次，再取出置于37℃作用2小時(shí)。滅活完成后取樣做滅活檢驗(yàn)及無(wú)菌檢驗(yàn)，置2～8℃下保存過(guò)夜，保存時(shí)間應(yīng)不超過(guò)7日。3、滅活檢驗(yàn)取滅活的病毒液接種10日齡易感雞胚10枚，每胚0.1ml，置33～35℃培養(yǎng)96小時(shí)。24小時(shí)內(nèi)死亡的不計(jì)數(shù)，收獲雞胚液，測(cè)定HA價(jià)，應(yīng)為陰性，并盲傳1代，測(cè)定HA價(jià)，如為陰性，即滅活完全。4、二聯(lián)苗的制備取注射用白油94份，加司盤(pán)-806份，混合后，加硬脂酸鋁2份，隨加熱隨攪拌至透明為止，高壓滅菌備用。。取吐溫-804份裝入帶玻璃珠的瓶中滅菌，冷卻后加入混合的滅活病毒液96份，充分振搖，至吐溫-80完全溶解為止。使油相與水相的比例為3:1乳化程序?yàn)椋喝∮拖嘀媚z體磨內(nèi)，開(kāi)動(dòng)電機(jī)慢速攪拌，同時(shí)分別緩慢加入水相，加完后再以10000r/min攪拌2min～5min，在終止攪拌前加入1％硫柳汞溶液，使其最終濃度為0.01％以下。5、分裝、檢驗(yàn)將乳化好的疫苗定量分裝，加蓋密封，并貼上標(biāo)簽。其性狀呈乳白色均勻乳狀液。劑型為油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，呈現(xiàn)團(tuán)狀，不擴(kuò)散。吸取疫苗10ml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，應(yīng)不出現(xiàn)分層現(xiàn)象、管底析出水相應(yīng)不多于0.5ml。黏度按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)符合規(guī)定。裝量檢查按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合規(guī)定。無(wú)菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。實(shí)施例3(重組雞新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎三聯(lián)滅活疫苗的免疫效果)將60只21日齡SPF雞隨機(jī)分為2大組，其中A組30只為接種重組雞新城疫、禽流感、傳染性支氣管炎三聯(lián)滅活疫苗組，B組30只為空白對(duì)照組。免疫后14天分別肌肉注射北京株1ml(含104ELD50)、傳染性支氣管炎M41株攻毒劑量為104.0EID50、測(cè)AIV-HI抗體效價(jià)。攻毒組觀察10天，觀察其發(fā)病情況和死亡情況。采血組只測(cè)定抗體效價(jià)。具體結(jié)果如表3所示：表3二聯(lián)疫苗免疫有效性實(shí)驗(yàn)結(jié)果以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請(qǐng)范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3