一種雞傳染性支氣管炎、禽腺病毒二聯(lián)滅活疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雞傳染性支氣管炎、禽腺病毒 二聯(lián)滅活疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞傳染性支氣管炎（Infectious Bronchitis, IB)感染可導(dǎo)致雛雞、肉雞發(fā)育緩 慢，產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋減少和蛋品質(zhì)下降等。OIE將其列為B類疫病。
[0003] 通過對I群禽腺病毒的流行病學(xué)調(diào)查，該病在我國雞群中發(fā)病率較高，可通過水平 和垂直兩種途徑傳播，且呈逐年上升趨勢。發(fā)病的宿主范圍也越來越廣，白羽肉雞、肉種雞、 蛋雞、黃羽雞均可感染發(fā)病，特別是2010年以后發(fā)病呈現(xiàn)增加趨勢，在全國范圍內(nèi)均有流 行。許多I群禽腺病毒可在健康禽體內(nèi)復(fù)制，癥狀非常輕微或不表現(xiàn)感染癥狀，但是I群4型 禽腺病毒例外，可直接引起雞群發(fā)病，主要病變表現(xiàn)為心包積液和肝、腎腫大，本病于1963 年首次在美國發(fā)生，隨后在世界各地相繼出現(xiàn)，是全世界家禽和野禽常見的傳染病原。1976 年我國臺灣省首次發(fā)生本病，之后全國各地均有發(fā)生本病的報道，且呈逐年上升趨勢，給雞 養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的危害。
[0004] 近些年來，傳染性支氣管炎是較為常見的嚴(yán)重威脅家禽的重要疾病;而雞群對I群 4型禽腺病毒的感染愈來愈多，此病很容易引起繼發(fā)感染疫病，給禽業(yè)養(yǎng)殖戶帶來很多煩 惱，而且多次使用疫苗尤其是滅活疫苗，不僅增加雞場人力和物力負(fù)擔(dān)，同時多次抓雞的注 射應(yīng)激，還會影響生產(chǎn)性能，致使雞群對疾病的易感性增大。加之近年來毒株的不斷變異， 使得雖然推出的多種選擇的疫苗，但仍然出現(xiàn)控制不住疫情發(fā)展的局面，所以需要篩選獲 得新的流行毒株來應(yīng)對變異所造成的新的危害。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種雞傳染性支氣管炎、禽腺病毒二聯(lián)滅活疫苗，從而彌補(bǔ) 現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0006] 本發(fā)明的二聯(lián)滅活疫苗，其中抗原為滅活的傳染性支氣管炎和禽腺病毒；
[0007] 其中傳染性支氣管炎病毒優(yōu)選為傳染性支氣管炎M41株；
[0008] 禽腺病毒為I群4型禽腺病毒YBAV-4株，其保藏編號為CCTCC NO.V201541。
[0009] 上述的滅活疫苗，其中病毒的滅活采用甲醛滅活；
[0010] 本發(fā)明的滅活疫苗的制備方法如下：
[0011] 1)油相制備：
[0012] 取礦物油95份，硬脂酸鋁1份，在油相制備罐中混合均勻并加熱至80°C后，再加5份 司本80 (Span-80 )，至溫度達(dá)到115 °C時維持40分鐘，冷卻后完成油相制備；
[0013] 2)水相制備：
[0014]將滅活的傳染性支氣管炎病毒液、I群禽腺病毒毒液混合;取混合抗原液95份，滅 菌的5份吐溫80，充分混勻；
[0015] 其中傳染性支氣管炎病毒液、I群禽腺病毒的數(shù)量比優(yōu)選為1:2;
[0016] 3)乳化
[0017] 取油相2份放入乳化罐中，加入水相1份后，再以3500r/min攪拌30~40分鐘完成乳 化制備。
[0018] 本發(fā)明的疫苗所使用的I群4型禽腺病毒YBAV-4株新毒株的TCID5O效價高、免疫原 性好并能抵御禽腺病毒病各地方分尚毒的攻擊。本發(fā)明制備的疫苗的安全性良好，未出現(xiàn) 由疫苗引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。保存期試驗(yàn)中經(jīng)過性狀、安全性試驗(yàn)、效力試驗(yàn)數(shù) 據(jù)的分析，結(jié)果與同類產(chǎn)品的單苗相比較，二聯(lián)苗無明顯差異，均穩(wěn)定有效;效力試驗(yàn)結(jié)果 證明，二聯(lián)苗和二種單苗抗體均保持高水平，比同類產(chǎn)品產(chǎn)生抗體快，而對照組抗體為陰 性。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 申請人篩選獲得了一株新型變異的I群4型禽腺病毒，將該病毒與傳染性支氣管炎 一起來制備聯(lián)合疫苗，從而促成了本發(fā)明。
[0020] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0021] 實(shí)施例1:YBAV_4株毒株的篩選
[0022] 1、流行病學(xué)調(diào)查自2010年以來，山東、江蘇等地區(qū)的部分肉種雞、蛋雞及麻雞出現(xiàn) 了一種以死亡率高，解剖主要表現(xiàn)為肝臟腫大、心包積水為特點(diǎn)的疾病，經(jīng)臨床調(diào)查和實(shí)驗(yàn) 室檢測，初步診斷為I群C-4型禽腺病毒引起的心包積水肝炎綜合征。2010年，發(fā)明人從山東 淄博某養(yǎng)殖場有包涵體肝炎和心包積水典型癥狀的病死雞肝臟中成功分離到1株病毒。 [0023] 2、病毒分離取病死雞的肝臟研碎后，用按1:5的比例加入滅菌生理鹽水制成懸液； 反復(fù)凍融3次后，3000r/min離心30min，取上清;加入青霉素和鏈霉素各10000IU/ml，4°C過 夜，經(jīng)微孔濾器過濾，無菌檢驗(yàn)合格后保存?zhèn)溆?。將上述制備的病毒液?.2ml/胚的劑量， 經(jīng)卵黃囊途徑接種6.5日齡SPF雞胚，棄24h內(nèi)死胚，取接種48h~168h內(nèi)死亡雞胚的尿囊液 和胎兒，用上述方法處理后連續(xù)傳代，觀察第3代死胚的肝組織，雞胚表現(xiàn)為死胚、胚體矮 小、發(fā)育遲緩、胎兒卷曲、肝臟腫大和質(zhì)脆，胚胎充血。收集死胚尿囊液和胎兒，一20°C保存。 [0024] 3、病毒的鑒定
[0025] 3.1血凝特性鑒定無菌采集SPF雞和鴨血液5~10ml，反復(fù)洗3~5次，末次用生理鹽 水將血細(xì)胞泥稀釋成0.8 %、1 %和2%濃度，4°C保存?zhèn)溆?。按常?guī)方法檢測分離毒株是否具 有凝集這些紅細(xì)胞的特性。同時設(shè)m群禽腺病毒EDSV-76為凝集反應(yīng)陽性對照。結(jié)果:分離 毒不能凝集SPF雞和鴨紅細(xì)胞，即使改變紅細(xì)胞的濃度，也不能使之凝集。m群禽腺病毒 EDSV-76能夠凝集雞、鴨的紅細(xì)胞。
[0026] 3.2理化特性檢驗(yàn)參照《動物病毒學(xué)》介紹的方法，病毒液分別以5-溴尿嘧啶-2 ' - 脫氧核苷(BUDR)、氯仿、乙醚、鹽酸(pH3)、氫氧化鈉(pHl0)、溫度(60 °C、Ih)處理后，接種雞 胚(0.2ml/胚），另設(shè)生理鹽水處理組作為對照。接種5d后觀察雞胚病變。結(jié)果:分離毒分別 經(jīng)BUDR、氫氧化鈉(pHl0)和60 °C、Ih處理后，接種雞胚，雞胚表現(xiàn)正常，PCR檢測陰性。表明 BUDR能抑制病毒在雞胚中的復(fù)制，分離毒株的核酸類型為DNA，病毒不耐堿，對熱敏感，60 °C，Ih可被滅活。而經(jīng)乙醚、氯仿和鹽酸(pH3)處理的毒株，不影響病毒在雞胚中的增殖，出 現(xiàn)明顯的雞胚病變，PCR檢測結(jié)果陽性。表明病毒沒有脂質(zhì)囊膜，對乙醚和氯仿有抵抗力，耐 酸。
[0027] 3.3血清學(xué)鑒定
[0028] 3.3.1群特異性鑒定利用瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)制備瓊脂凝膠平板對分離毒株 進(jìn)行群特異性鑒定。瓊脂凝固后，用打孔器打孔，打孔圖案為中央1孔四周6孔，孔徑4mm，孔 距為4mm，孔底封閉。待檢病毒置于中間孔，周圍孔加 I群禽腺病毒標(biāo)準(zhǔn)株、EDSV-76京911株 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清及陰性血清。將瓊擴(kuò)板放置于加蓋濕盒中37°C作用，24~48h觀察是否出現(xiàn)凝 集沉淀線。結(jié)果:分離毒抗原僅能與I群禽腺病毒4型陽性血清出現(xiàn)明顯沉淀線，而與m群禽 腺病毒H)SV-76京911株標(biāo)準(zhǔn)陽性血清及陰性血清之間均未出現(xiàn)沉淀線。
[0029] 3.3.2型特異性鑒定I群禽腺病毒1~12型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清首先作1:10稀釋，再按 2010年版《中國獸藥典》附錄固定病毒稀釋血清法，將I群禽腺病毒1~12型標(biāo)準(zhǔn)毒株、分離 毒對I群禽腺病毒1~12型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行交叉中和試驗(yàn)，記錄中和效價結(jié)果。結(jié)果:分離 毒測4型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的中和效價（1: 501)與4型標(biāo)準(zhǔn)毒株測4型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的中和效價 (1:537)較接近;分離毒株測其它型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的中和效價均在1:10以下。表明分離株是 血清4型。
[0030] 3.4PCR檢測及基因測序病雞肝臟無菌研磨，反復(fù)凍融3次，利用柱式動物DNA提取 試劑盒提取病毒DNA，進(jìn)行PCR檢測。1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。將陽性樣品進(jìn)行Hexon基 因測序，并進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。根據(jù)Hexon基因序列比對和遺傳進(jìn)化分析結(jié)果可以看出，分 離毒與I群禽腺病毒屬于同一分支，與血清4型同源性最接近，但也存在序列上的差異;與血 清6型、7型、8a和8b型同源性更低。
[0031] 該病毒株于2015年10月15日保藏于武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保 藏編號為CCTCC NO.V201541。
[0032] 實(shí)施例2:YBAV_4株毒種的制備 [0033](一)雞肝細(xì)胞最佳培養(yǎng)條件研究
[0034] 1、細(xì)胞密度對細(xì)胞生長的影響將5種不同密度（1~5萬個/ml，5~10萬個/ml，10~ 15萬個/ml，15~20萬個/ml，20~25萬個/ml)的雞肝細(xì)胞分別接種同一批次的25cm2細(xì)胞 瓶、225cm2細(xì)胞瓶、3000ml轉(zhuǎn)瓶、10層細(xì)胞工廠中，用同批次的DMEM營養(yǎng)液在同條件下培養(yǎng)， 每個密度接種5瓶/2個，在同條件下培養(yǎng)、觀察細(xì)胞長成致密單層所需時間及細(xì)胞的形態(tài)。
[0035] 2、新生牛血清含量對細(xì)胞生長的影響用同一廠家生產(chǎn)的新生牛血清，分別按6%、 8%、10%、12%的比例加入DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)同一批雞肝細(xì)胞，細(xì)胞的終密度均為15~20 萬個/ml，每種血清濃度的營養(yǎng)液接種同一批次25cm2細(xì)胞瓶、225cm2細(xì)胞瓶、3000ml轉(zhuǎn)瓶、10 層細(xì)胞工廠各5瓶/2個，觀察細(xì)胞長成致密單層所需時間及細(xì)胞形態(tài)。
[0036] 3、胰酶對細(xì)胞生長的影響所用細(xì)胞消化液為0.02 %EDTA-0.25%胰酶溶液，待細(xì) 胞消化好后，一部分細(xì)胞培養(yǎng)容器倒去消化液加入營養(yǎng)液，另一部分細(xì)胞培養(yǎng)容器不棄去 消化液直接加入營養(yǎng)液。營養(yǎng)液為pH值為7.0~7.2、含10 %新生牛血清的DMEM營養(yǎng)液，細(xì)胞 密度均為15~20萬個/ml。接種同一批次25cm2細(xì)胞瓶、225cm 2細(xì)胞瓶、3000ml轉(zhuǎn)瓶、10層細(xì)胞 工廠各5瓶/2個，在同條件下培養(yǎng)、觀察細(xì)胞長成致密單層所需時間及細(xì)胞形態(tài)。
[0037] 4、營養(yǎng)液pH值對細(xì)胞生長的影響其它條件均相同，僅營養(yǎng)液的pH值分別調(diào)整為 6.8、7.0、7.2、7.4,不同pH值的營養(yǎng)液分別接種25cm2細(xì)胞瓶、225cm