一種基于對稱構(gòu)象免疫原的艾滋病疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于疫苗領(lǐng)域，具體涉及一種基于對稱構(gòu)象免疫原的艾滋病疫苗以及其制 備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有技術(shù)公開了艾滋?。ˋIDS)是由人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus, HIV)感染后引起的獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)。從1981年發(fā)現(xiàn)首例艾滋?。ˋIDS)病例來，至今30多年間，艾滋病迅速 在全球范圍內(nèi)蔓延擴散。該疾患已經(jīng)成為全球的健康危機，也是全球所面臨的重大挑戰(zhàn)之 一；其嚴(yán)重危害社會進步和經(jīng)濟增長。據(jù)報道，目前，全球大約6000多萬人被HIV感染，其 中3000萬人死于艾滋病以及由艾滋病引發(fā)的相關(guān)疾病。鑒于此，如何有效防止HIV-I感染， 降低發(fā)病率和死亡率是我國乃至全球面臨的緊迫任務(wù)。研究顯示，疫苗是控制HIV-I傳播 和感染的有效手段，然而，艾滋病疫苗研制過程中碰到一個難以克服的困難一即HIV-I具 有高度變異性；很多疫苗所選擇的位點主要是自然感染中優(yōu)勢抗原表位，而這些表位大多 是HIV-I變異頻率最高的位點。因此，利用這些抗原構(gòu)建疫苗很難夠克服同時存在的HIV-I 亞型。如何利用和選擇HIV-I的保守區(qū)域設(shè)計疫苗成為艾滋病疫苗研究領(lǐng)域中存在的一個 重要的問題。
[0003] MPER即HIV-I gp41近膜區(qū)（氨基酸序列號：660-683 ;參考株為HXB2)是gp41上 一段富含色氨酸的保守區(qū)域。MPER在病毒膜融合的過程中起重要的作用（1)。有研究實驗 表明MPER缺失的HIV毒株喪失感染靶細(xì)胞的能力。很多廣譜中和抗體如10E8,4E10,2F5 等均識別這個位點，其中，10E8是第二代從病人體內(nèi)分離出來的廣譜中和抗體，其晶體結(jié)構(gòu) 顯示MPER區(qū)的結(jié)合構(gòu)象是螺旋構(gòu)象（2)，進一步暗示MPER區(qū)天然構(gòu)象可能為螺旋構(gòu)象，這 跟之前研究結(jié)果相一致，所以，這提示MPER作為免疫原來設(shè)計疫苗是一個很好的選擇。然 而，根據(jù)MPER區(qū)作為抗原來設(shè)計疫苗面臨很大的挑戰(zhàn)。研究表明，天然狀態(tài)下MPER呈螺旋 結(jié)構(gòu)且富含色氨酸以及其他許多疏水氨基酸，MPER區(qū)的很多重要的廣譜中和抗體識別氨基 酸由于疏水作用均埋在細(xì)胞膜中，如L669, W670, W672, F673, 1675, W678, L679, Y681，1682 和K683等（3)。這也可能是導(dǎo)致MPER區(qū)作為免疫原免疫原性較弱的原因之一。所以，目 前利用MPER作為抗原設(shè)計的疫苗很難誘導(dǎo)出中和抗體。然而，有研究表明利用MPER區(qū)作 為抗原在猴子上免疫取得保護性，但亦未能夠誘導(dǎo)出識別MPER區(qū)的中和抗體。分析發(fā)現(xiàn)， MPER區(qū)誘導(dǎo)的抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，以下簡稱ADCC)作用是產(chǎn)生保護效果的主要原因。所以能否誘導(dǎo)更強的 ADCC作用在疫苗設(shè)計中也很關(guān)鍵。綜上所述，如何根據(jù)MPER區(qū)設(shè)計免疫原，使其能夠模擬 天然構(gòu)象并且讓其主要氨基酸位點在細(xì)胞膜環(huán)境中外露，從而更好的產(chǎn)生抗體，形成中和 作用和ADCC作用，是利用MPER區(qū)設(shè)計HIV疫苗的一個關(guān)鍵技術(shù)問題。本申請的發(fā)明人為 了解決以上的技術(shù)難點，通過蛋白結(jié)構(gòu)模擬技術(shù)，設(shè)計了含有長序列的新型對稱構(gòu)象免疫 原4sMPER，實驗結(jié)果顯示該抗原更接近天然的螺旋構(gòu)象，關(guān)鍵的疏水氨基酸朝向不同的方 向，從而使其部分外露出膜，以其為基礎(chǔ)的HIV疫苗誘導(dǎo)了更多的識別天然構(gòu)象的抗體，以 及增強了中和作用和ADCC作用。
[0004] 與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)有：
[0005] I. Apellanizj B. , E. Rujasj P. Carravillaj J. Requejo-Isidroj N. Huartej C. Domenej and J. L. Nieva. 2014. Cholesterol-dependent membrane fusion induced by the Gp41 MPER-TMD connection suggests a mechanism for broad HIV-I neutralization. J Virol. 15 ;88 (22) :13367-77. ·
[0006] 2. Jinghe Huang, G. 0. , Leo Laubj Mark K. Louder, Nicole A. Doria-Rosej Nancy S. Longoj Hiromi Imamichij , B. C.Robert T. Bailer, Shailendra K. Sharmaj S.Munir Alamj Taoffangj Yongping Yang, Baoshan Zhang，，and R. ff. Stephen A. Miguelesj Barton F. Haynes, Peter D. Kwongj John R. Mascola & Mark Connors. 2012. Broad and potent neutralization of HIV-I by a gp41_specific human antibody. Nature 15; 491(7424) :406-12.
[0007] 3. Sun, Z. -Y. J. , K. J. Ohj M. Kimj J. Yuj V. Brusicj L. Song, Z. Qiao, J. -h. Wang, G. Wagner, and E. L. Reinherz. 2008. HIV-I broadly neutralizing antibody extracts its epitope from a kinked gp41 ectodomain region on the viral membrane. Immunity 28:52-63. 〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是為了解決MPER多肽由于構(gòu)象問題而導(dǎo)致誘導(dǎo)識別天然構(gòu)象抗體 能力弱的問題，提供一種基于對稱構(gòu)象免疫原的艾滋病疫苗以及其制備方法。具體涉及 一種氨基酸序列可作為免疫原，所述氨基酸序列中包括HIV-I gp41中近膜區(qū)（Membrane proximal external region, MPER)，氛基酸序列號為660-683 (HXB2為參考株）的4重復(fù)序 列，其能夠更好的模擬HIV-I病毒gp41上MPER區(qū)融合前的天然狀態(tài)。HIV-1MPER區(qū)非常保 守，這與其參與膜融合過程并起到重要作用有密切關(guān)系（1);可識別該表位的廣譜中和抗 體2F5能夠中和大約67%左右的病毒，而另外一株識別該表位的廣譜中和抗體10E8能以 很低的濃度中和98%的臨床株（2)，提示該區(qū)域是很好的疫苗設(shè)計靶點；但MPER區(qū)免疫原 性相對較弱，特別是以全病毒作為免疫原免疫；因此利用假病毒或者VLP誘導(dǎo)出識別MPER 區(qū)的特異性抗體較難。此外，MPER的天然構(gòu)象為螺旋結(jié)構(gòu)（2)，而合成和表達的MPER表位 單體基本上為無規(guī)則卷曲。加之天然構(gòu)象的MPER區(qū)抗原中的很多關(guān)鍵表位由于疏水作用 而插入到細(xì)胞膜中，給MPER區(qū)作為免疫原設(shè)計疫苗增加了很多困難。為解決MPER免疫原 性較弱以及構(gòu)象問題，本發(fā)明利用蛋白結(jié)構(gòu)模擬技術(shù)設(shè)計了串聯(lián)型長表位MPER新免疫原 4sMPER，該免疫原具有對稱構(gòu)象特征，計算機模擬顯示該抗原具有螺旋構(gòu)象，使其表位的關(guān) 鍵氨基酸（W672和F673)位于不同的方向（如圖1所示），由此可解決上述所提到的MPER 區(qū)與膜脂結(jié)合后重要氨基酸隱藏到細(xì)胞膜的關(guān)鍵問題，實驗結(jié)果也證明該設(shè)計的4sMPER 免疫原具有螺旋結(jié)構(gòu)（如圖2,圖3所示），能夠更好的與廣譜中和抗體結(jié)合（圖4)，同時其 在細(xì)胞膜上也可更好的暴露出之前隱藏的10E8抗體關(guān)鍵結(jié)合位點（圖5)，并可誘導(dǎo)出更多 的識別天然構(gòu)象的特異性抗體（圖6)，這些抗體具有中和活性及ADCC效應(yīng)（表1，圖7)。
[0009] 本發(fā)明包括下述技術(shù)方案：
[0010] 1.構(gòu)象模擬技術(shù)所獲得的4sMPER免疫原結(jié)構(gòu)，
[0011] 利用計算機模擬技術(shù)對MPER區(qū)抗原進行模擬，選擇具有中心對稱構(gòu)象為螺旋構(gòu) 象的模擬體；
[0012] 2.圓二色光譜儀檢測4sMPER的二級結(jié)構(gòu)
[0013] 利用圓二色光譜儀（J-815型，Jascolnc, Japan)通過圓二色譜法測定4sMPER抗 原，和MPER單體肽的二級結(jié)構(gòu)；
[0014] 3.圓二色光譜儀檢測4sMPER的熱穩(wěn)定性分析
[0015] 熱變性分析（Tm值）用以評價4sMPER抗原的熱穩(wěn)定性；
[0016] 4.針對MPER區(qū)表位的廣譜中和抗體10E8和4E10對4sMPER結(jié)合能力檢測
[0017] 本發(fā)明利用10E8、4E10單抗檢測4sMPER的構(gòu)象；
[0018] 5.高內(nèi)涵檢測4sMPER的關(guān)鍵氨基酸位點能更容易暴露于細(xì)胞膜外面；
[0019] 流式細(xì)胞儀檢測Ab-4sMPER(4sMPER抗原免疫動物后純化的對4sMPER特異性抗 體）更容易識別天然HIV-I包膜蛋白Env ;
[0020] 10Ab-4sMPER誘導(dǎo)抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒（ADCC)作用；
[0021] 7.測Ab-4sMPER和Ab-MPER對假病毒的抑制活性。
[0022] 在本發(fā)明的一個實施方式中，上述4sMPER多肽免疫原可直接或以組合免疫原中 一部分的形式，作為蛋白疫苗用于誘導(dǎo)可識別病毒MPER區(qū)保守表位天然構(gòu)象的抗體，從而 以中和病毒和ADCC效應(yīng)達到艾滋病防治的目的。
[0023] 在本發(fā)明另一個實施方式中，編碼4sMPER免疫原的DNA序列可以進一步克隆至其 他載體中，如AAV、vaccinia virus, ALVAC，MVA，Ad5作為疫苗以增強其免疫原性。
[0024] 本發(fā)明所述的該HIV疫苗可進一步跟佐劑配合使用，佐劑包括弗氏佐劑、氫氧化 鋁佐劑』?5945(^，〇4-21，短小棒狀桿菌、脂多糖、細(xì)胞因子或明礬、以及油佐劑或者水型 佐劑。
[0025] 發(fā)明的HIV疫苗可用于肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、腹腔注射、鼻腔給藥、口腔 給藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用本領(lǐng)域公知的技術(shù)隊其進行配方，以使其適合相應(yīng)的給藥 方式。
【附圖說明】
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