0026] 圖1.構(gòu)象模擬技術(shù)所獲得的4sMPER免疫原結(jié)構(gòu)。
[0027] 圖2.圓二色光譜儀檢測4sMPER的二級結(jié)構(gòu)。
[0028] 圖3.圓二色光譜儀檢測4sMPER的熱穩(wěn)定性分析。
[0029] 圖4· 10E8 (A)、4E10⑶對4sMPER結(jié)合能力的檢測。
[0030] 圖5.高內(nèi)涵檢測4sMPER的關(guān)鍵氨基酸位點能更容易暴露于細胞膜外面，其中，圖 5A為熒光圖像結(jié)果，圖5B為高內(nèi)涵熒光定量結(jié)果。
[0031] 圖6.流式細胞儀檢測Ab-4sMPER(4sMPER抗原免疫動物后純化的對4sMPER特異 性抗體）更容易識別HIV-I天然構(gòu)象的包膜蛋白Env。
[0032] 圖7. Ab-4sMPER能夠更好的介導ADCC作用。
【具體實施方式】
[0033] 實施例1
[0034] 構(gòu)象模擬技術(shù)所獲得的4sMPER免疫原結(jié)構(gòu)：
[0035] 利用計算機模擬技術(shù)對MPER區(qū)抗原進行模擬，選擇具有中心對稱構(gòu)象為螺旋構(gòu) 象的模擬體；如圖1所示，本發(fā)明設(shè)計的抗原4sMPER為螺旋構(gòu)象，其中關(guān)鍵疏水氨基酸位點 672W為綠色，673F為粉紅色，。但由所設(shè)計抗原具有中心對稱結(jié)構(gòu)，關(guān)鍵疏水氨基酸672W 和673F的方向各不相同，以此解決MPER區(qū)抗原關(guān)鍵位點埋入到細胞膜中的問題；
[0036] 圓二色光譜儀檢測4sMPER的二級結(jié)構(gòu)：
[0037] 利用圓二色光譜儀（J-815型，Jascolnc, Japan)通過圓二色譜法測定4sMPER抗 原，和MPER單體肽的二級結(jié)構(gòu)（如圖2所示），4sMPER抗原和MPER單體肽均用50mM的pH 7. 2的PBS稀釋至終濃度為10 μ M備用，在0.1 cm的石英樣品杯中加入PBS做空白對照，樣 品檢測使用下列參數(shù)設(shè)置：檢測溫度4°C,帶寬5nm,解析度0· Inm,光徑0· Icm,反應(yīng)時間 4. Os,掃描速度50nm/min，波長范圍從190nm到280nm，最后使用儀器自帶的軟件，將⑶信 號根據(jù)樣品中的氨基酸摩爾濃度轉(zhuǎn)換為摩爾橢變率（molar ellipticity，[Θ])，結(jié)果顯示 4sMPER抗原在208和222nM有強的吸收峰，具有顯著的螺旋結(jié)構(gòu)，而MPER抗原為無規(guī)則卷 曲；
[0038] 圓二色光譜儀檢測4sMPER的熱穩(wěn)定性分析：
[0039] 熱變性分析（Tm值）用以評價4sMPER抗原的熱穩(wěn)定性，圓二色光譜儀（J-815型， Jascolnc，Japan)上檢測222nm的吸光度，以5°C /min的溫度梯度變化檢測多肽的熱變性， 溫度設(shè)置范圍從4°C掃描到99°C，使用軟件計算熱解離轉(zhuǎn)變中點溫度，即Tm值；結(jié)果顯示， 4sMPER抗原具有很穩(wěn)定的螺旋結(jié)構(gòu)（如圖3所示），其Tm值約為95°C ;
[0040] 針對MPER區(qū)表位的廣譜中和抗體10E8和4E10對4sMPER結(jié)合能力的檢測：
[0041] 本發(fā)明利用10E8、4E10單抗檢測4sMPER的構(gòu)象，利用5μ g/ml的MPER多肽和 4sMPER多肽進行包被，4°C過夜，2 %的脫脂奶粉封閉2個小時，封閉后，加入起始濃度為 20 μ g/ml 4倍稀釋系列的10E8和4E10, 37°C溫育一個小時，利用含有0. 05 %吐溫20的PBS 洗3遍，然后加入羊抗人HRP標記的二抗（1:3000稀釋），37°C溫育一個小時，利用TMB進 行顯色，測其0D450,結(jié)果顯示隨著10E8和4E10抗體濃度的提高，0D450的值也隨之升高， 10E8能在很低濃度下識別4sMPER肽，對MPER識別卻需要較高的濃度（如圖4A所示），表 明10E8對4sMPER的結(jié)合能力更強；4E10抗體顯示類似的結(jié)果（如圖4B所示）；結(jié)果表明， 對稱表位的構(gòu)象更容易被結(jié)合天然構(gòu)象的10E8和4E10單抗識別，提示其構(gòu)象更接近于天 然構(gòu)象；
[0042] 高內(nèi)涵檢測4sMPER的關(guān)鍵氨基酸位點能更容易暴露于細胞膜外面：
[0043] 利用高內(nèi)涵檢測4sMPER抗原在細胞膜環(huán)境中關(guān)鍵氨基酸是否能夠暴露于細胞膜 外面，20 μ g/ml的4sMPER和MPER跟細胞在37°C溫育1小時，然后加入5 μ g/ml的識別MPER 區(qū)表位的廣譜中和抗體10E8 (含有1 % BSA)室溫溫育30分鐘，用PBS洗2遍，然后加入二 抗山羊抗人IgG-FITC(K) μ g/ml)室溫溫育40分鐘，用PBS洗2遍，然后用高內(nèi)涵（Opera， PE)進行拍照，并計算定量的熒光值（如圖5B所示），如圖5A所示，在細胞膜環(huán)境下，MPER 很難被10E8識別，而4sMPER與10E8的結(jié)合能力顯著提高，其中細胞對照（Cell)只加二抗， 細胞抗體組對照（Cell-Ab)分別加入等量的10E8和二抗做平行對照，圖5B為高內(nèi)涵儀器 可定量計算單個細胞的熒光強度，結(jié)果顯示，相對于MPER單表位，10E8對對稱抗原4sMPER 具有更強的結(jié)合，兩者具有顯著性差異（P = 0. 012〈0. 05);
[0044] 流式細胞儀檢測Ab-4sMPER(4sMPER抗原免疫動物后純化的對4sMPER特異性抗 體）更容易識別天然HIV-I包膜蛋白Env :
[0045] 10 μ g/ml 的 Ab-4sMPER 和 Ab-MPER (1 % 的 BSA)跟穩(wěn)定表達 HIV-I 包膜蛋白 Env 的 H9/IIIB細胞在室溫溫育30分鐘，用PBS洗兩遍，然后加入10 μ g/ml的山羊抗兔-FITC (含 有1 % BSA)室溫溫育30分鐘，用PBS洗2遍，用PBS洗2遍，然后用流式細胞儀（Accuri C6, BD)進行檢測，如圖6所示，Ab-4sMPER對H9IIIB表面表達的天然構(gòu)象Env具有更好的 結(jié)合（30% )，而Ab-MPER的結(jié)合相對較弱（18% );
[0046] Ab-4sMPER能夠更好的誘導抗體介導的細胞毒（ADCC)作用：
[0047] 將25以1的!191118(2.5\104個）細胞鋪至96孔板，然后將413-48]\0^1?和413-]\0^1? 梯度稀釋，加入到穩(wěn)定表達HIV包膜蛋白的H9/IIIB細胞中（50μ 1)，然后將ADCC效應(yīng)細胞 (promega) 25 μ I (I. 5Χ IO5 個）加入到 Η9/ΙΙΙΒ 中，37°C溫育 24h 后測其 luciferase，結(jié)果 如圖7所示，Ab-4sMPER相對于Ab-MPER顯示了更強ADCC效果；
[0048] Ab_4sMPER和Ab-MPER對假病毒的抑制活性：
[0049] 利用設(shè)計的構(gòu)象對稱抗原4sMPER肽和MPER肽免疫新西蘭大耳兔，經(jīng)過4免后，測 抗體滴度，然后利用特異性偶聯(lián)柱材分別將抗4sMPER的抗體（Ab-4sMPER)和抗MPER的抗 體（Ab-MPER)進行純化，利用假病毒測Ab-4sMPER和Ab-MPER的效果，具體包括：按照每孔 8000個U87細胞，100 μ 1體系進行鋪板，將病毒跟系列稀釋的抗體各50 μ 1體系進行混合， 放至37°C，孵育30分鐘，孵育后，將其加入U87細胞中，37°C溫育72h后，測其luciferase， 實驗結(jié)果如表1所示，Ab-MPER-4對假病毒SC422661. 8、ZM109F. PB4、AE03、SC19-15具有顯 著的抑制活性，其 ICO 分別為 14. 64±3. 31、5. 69±2. 10、50. 78±4. 13、31. 92±6. 19(μ g/ ml)，而抗體Ab-MPER對所有假病毒均沒有明顯的抑制活性。
[0050] 表1是Ab-4sMPER和Ab-MPER(MPER肽免疫動物后純化的對MPER特意性抗體）對 假病毒的抑制活性。
[0051] 表 1
[0052]
?:
【主權(quán)項】
1. 一種基于對稱構(gòu)象免疫原的艾滋病疫苗，其特征在于，其含有一種艾滋病病毒 (HIV)免疫原，其中包括一種氨基酸序列，所述氨基酸序列包括HIV gp41近膜區(qū)MPER的 660-683區(qū)氨基酸序列（根據(jù)HXB2編號，簡稱為MPER表位）的4重復串聯(lián)序列，其結(jié)構(gòu)特 征為形成了對稱構(gòu)象，其中W672和F673在抗原中朝向不同的方向，具有一定的對稱性。2. 如權(quán)利要求1所述的艾滋病疫苗，其特征在于，所述的的HIV免疫原，其中所述氨基 酸序列進一步與包括Th細胞表位序列的可增強其免疫原性的氨基酸序列串聯(lián)，以增強其 免疫原性。3. 如權(quán)利要求2所述的艾滋病疫苗，其特征在于，所述的串聯(lián)氨基酸序列，為同向串 聯(lián)，或者逆向串聯(lián)，亦或同向逆向間隔串聯(lián)，其核心為所產(chǎn)生的免疫原中MPER表位具有對 稱構(gòu)象，使其更接近天然構(gòu)象，使其關(guān)鍵氨基酸充分暴露。4. 如權(quán)利要求1-3中任意一項所述的艾滋病疫苗，其特征在于，所述的HIV免疫原，其 所編碼的DNA序列可克隆至其它載體，如AAV、vaccinia virus, ALVAC，MVA, Ad5,在體內(nèi)外 表達出對應(yīng)的免疫原。5. 如權(quán)利要求1-3中任意一項所述的艾滋病疫苗，其特征在于，所述的HIV疫苗，進一 步包括佐劑，所述的佐劑選自弗氏佐劑、氫氧化鋁佐劑、MF59、AS02A，QA-21，短小棒狀桿菌、 脂多糖、細胞因子或明礬、以及油佐劑或者水型佐劑。
【專利摘要】本發(fā)明屬于疫苗領(lǐng)域，涉及一種基于對稱構(gòu)象免疫原的艾滋病疫苗以及其制備方法。本發(fā)明根據(jù)HIV-1跨膜蛋白gp41的近膜區(qū)MPE保守表位的免疫原特征，通過蛋白結(jié)構(gòu)模擬技術(shù)設(shè)計含有長序列的新型對稱構(gòu)象免疫原；實驗結(jié)果顯示在該免疫原中MPER表位形成穩(wěn)定的螺旋結(jié)構(gòu)，與識別該表位的人源廣譜中和抗體10E8的結(jié)合能力顯著高于未設(shè)計的MPER免疫原，其免疫動物后所產(chǎn)生的血清及抗體可更強結(jié)合HIV-1包膜蛋白Env的天然構(gòu)象，免疫產(chǎn)生的抗體在細胞模型上可高效抑制HIV-1病毒對靶細胞的感染，同時可誘導的抗體能介導顯著的抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用；本發(fā)明的對稱構(gòu)象免疫原4sMPER作為艾滋病疫苗能克服原有表位的近膜構(gòu)象缺陷，具有顯著的優(yōu)勢。
【IPC分類】A61K39/21, A61P31/18, A61K39/39
【公開號】CN105709219
【申請?zhí)枴緾N201410734809
【發(fā)明人】姜世勃, 陸路, 孫志武, 王茜
【申請人】復旦大學
【公開日】2016年6月29日
【申請日】2014年12月4日