專(zhuān)利名稱(chēng)：用于干擾目標(biāo)序列的RNAi片段及RNAi表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，特別是涉及一種用于干擾目標(biāo)序列的RNAi片段及RNAi 表達(dá)載體，及其制備和構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
RNA干擾(RNA interference, RNAi)是近幾年發(fā)展起來(lái)的高效、特異、易操作的基 因沉默新技術(shù)，相對(duì)于反義及共抑制技術(shù)，可獲得更高的基因沉默效率。它是真核生物體 內(nèi)由雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)介導(dǎo)的降解同源RNA的現(xiàn)象。在細(xì)胞中，長(zhǎng) 的dsRNA被類(lèi)似RNA酶III的Dicer酶切割成21-26核苷酸(nucleotide, nt)的干擾性小 RNA (small interfering RNA 或 short interfering RNA, siRNA)。隨后，siRNA 與蛋白復(fù)合 物結(jié)合后形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，并解鏈。而 有活性的RISC在其中的siRNA反應(yīng)鏈指導(dǎo)下同與其互補(bǔ)的轉(zhuǎn)錄物結(jié)合，導(dǎo)致RNA的降解。 這是一種轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(post-transcriptional gene silence, PTGS)，也稱(chēng)RNA 沉默(RNA silencing) (Fire et al, 1998 ；Meister et al，2004)。RNAi在進(jìn)化上是高度保守的，是真核生物體內(nèi)天然的抗外源基因侵入的防御系 統(tǒng)。RNAi的最主要的特點(diǎn)在于其作用的高度特異性，這一特點(diǎn)是由siRNA與目的RNA特 異性互補(bǔ)所保證的。Semizarov等(2003)針對(duì)同一個(gè)基因的三個(gè)不同靶作用區(qū)設(shè)計(jì)了不 同的siRNA序列對(duì)靶基因進(jìn)行沉默誘導(dǎo)，利用DNA芯片(DNA mircoarrays)對(duì)RNAi過(guò)程 中的基因表達(dá)特征進(jìn)行分析以檢測(cè)siRNA的特異性。結(jié)果表明，針對(duì)同一作用區(qū)的不同 siRNA對(duì)目的基因施加影響后，目的基因表現(xiàn)出幾乎相同的表達(dá)特征，可是針對(duì)不同作用 區(qū)的siRNA對(duì)目的基因表達(dá)的影響各不相同。而Chi等(2003)和Jackson等(2003)通 過(guò)對(duì)特異siRNA干擾后基因組的表達(dá)變化進(jìn)行分析，同樣證明了 RNAi的高度特異性。其 實(shí)，也正是因?yàn)镽NAi具有高度特異性的特點(diǎn)而成為鑒定基因功能(Uhlirova et al,2003 ； Van et al，2003)，基因組分析(Ashrafi et al,2003 ；Pothof et al,2003 ；Kamath et al, 2003)，植物抗病毒研究(Kubota et al,2003 ；Vanitharani et al，2003)，人類(lèi)多種疾病治 療(McCaffrey et al,2003 ；Lee et al,2003 ；Kao et al,2004)研究等的有力工具。由于利用RNAi技術(shù)需要將設(shè)計(jì)的核苷酸片段導(dǎo)入載體以形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)的RNAi的表達(dá) 單位(參見(jiàn)圖2)，因此方便有效的RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建成為高效利用RNAi技術(shù)的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的RNAi表達(dá)載體構(gòu)建方法為，根據(jù)目的基因高度保守區(qū)設(shè)計(jì)3對(duì)引物分別擴(kuò) 增該區(qū)段的正、反向片段和loop環(huán)序列(即圖2中的單鏈環(huán)狀區(qū))。利用PCR分別擴(kuò)增三 個(gè)片段，再分別酶切連接到相應(yīng)的載體上，然后測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆。該方法需要多步酶切、 連接，操作過(guò)程復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)工?；蛘卟捎萌斯ず铣烧麄€(gè)正反向片段及l(fā)oop環(huán)序列，但是成 本很高，且直接酶切的效果差。

發(fā)明內(nèi)容
由于在現(xiàn)有技術(shù)中，長(zhǎng)度小于60bp的人工合成序列的合成成本(例如0. 8元人民幣/個(gè)堿基)大大低于長(zhǎng)度大于60bp的人工合成序列(例如3. 8元人民幣/個(gè)堿基)，因 此本發(fā)明采取的方法為，分段合成長(zhǎng)度小于60bp的序列，每條序列分別磷酸化，退火即得 到含有酶切位點(diǎn)粘性末端(或平末端)的RNAi干擾片段。該方法不用反復(fù)酶切、連接，簡(jiǎn) 化了實(shí)驗(yàn)步驟，而且由于短片段合成成本低，與人工合成整個(gè)頸環(huán)結(jié)構(gòu)的基因序列相比，大 大降低了實(shí)驗(yàn)成本。具體地，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種用于干擾目標(biāo)序列的RNAi片段，其特征在于所述 RNAi片段是通過(guò)以下方法得到的1)針對(duì)需要干擾的目標(biāo)序列，任意設(shè)計(jì)一段不與目標(biāo)序列互補(bǔ)的序列S，得到一 個(gè)理論序列，即5’ -目標(biāo)序列-序列S-目標(biāo)序列的反向互補(bǔ)序列-3’ ；2)將1)中所述理論序列分N段合成，得到一定大小的N段核苷酸序列，所述N段 核苷酸序列按照理論序列從5’到3’的順序分別命名為F1-FN;將所述理論序列的反向互 補(bǔ)序列分M段合成，得到一定大小的M段核苷酸序列，所述M段核苷酸序列按照理論序列反 向互補(bǔ)序列從5，到3，的順序分別命名為R1-RM ；同時(shí)在F1和R1的5，端分別添加含有限 制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)粘性末端(或平末端)的核苷酸序列；其中與F(N-l)末端和FN首端 的核苷酸序列互補(bǔ)的序列，存在于同一條對(duì)應(yīng)的M段核苷酸序列之一上；3)將N段核苷酸序列和M段核苷酸序列的5’ -0H分別進(jìn)行磷酸化；4)將磷酸化后的N段核苷酸序列和M段核苷酸序列等比例混合，先變性，再退火， 得到用于干擾目標(biāo)序列的RNAi片段。所述的變性條件溫度為大于等于90°C，優(yōu)選為92_98°C，更優(yōu)選為94_96°C，在本 發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，變性溫度為94°C，變性后保持一段時(shí)間，所述退火條件為變性后逐 漸降低溫度至室溫，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，退火條件為變性后自然冷卻到室溫。在4)中退火后可任選地加入對(duì)退火產(chǎn)物中符合理論序列大小的片段進(jìn)行純化的 步驟。對(duì)退火產(chǎn)物進(jìn)行純化的方法可以為柱層析或電泳純化的方法，將符合理論序列大小 的片段純化出來(lái)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，采用的是電泳純化的方法。本發(fā)明的還一方面涉及一種用于干擾目標(biāo)序列的RNAi片段的制備方法，其包括 以下步驟1)選定需要干擾的目標(biāo)序列，任意設(shè)計(jì)一段不與目標(biāo)序列互補(bǔ)的序列S，得到一 個(gè)理論序列，即5’ -目標(biāo)序列-序列S-目標(biāo)序列的反向互補(bǔ)序列-3’ ；2)將1)中所述理論序列分N段合成，得到一定大小的N段核苷酸序列，所述N段 核苷酸序列按照理論序列從5’到3’的順序分別命名為F1-FN;將所述理論序列的反向互 補(bǔ)序列分M段合成，得到一定大小的M段核苷酸序列，所述M段核苷酸序列按照理論序列的 反向互補(bǔ)序列從5’到3’的順序分別命名為R1-RM ；同時(shí)在F1和R1的5’端分別添加含有 限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)粘性末端(或平末端)的核苷酸序列；其中與F(N-l)末端和FN首 端的核苷酸序列互補(bǔ)的序列，存在于同一條對(duì)應(yīng)的M段核苷酸序列之一上；3)將N段核苷酸序列和M段核苷酸序列的5’ -0H分別進(jìn)行磷酸化；4)將磷酸化后的N段核苷酸序列和M段核苷酸序列等比例混合，先變性，再退火， 得到用于干擾目標(biāo)序列的RNAi片段。所述的變性條件溫度為大于等于90°C，優(yōu)選為92_98°C，更優(yōu)選為94_96°C，在本 發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，變性溫度為94°C，變性后保持一段時(shí)間，所述退火條件為變性后逐漸降低溫度至室溫，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，退火條件為變性后自然冷卻到室溫。在4)中退火后可任選地加入對(duì)退火產(chǎn)物中符合理論序列大小的片段進(jìn)行純化的 步驟。對(duì)退火產(chǎn)物進(jìn)行純化的方法包括柱層析或電泳純化的方法，將符合理論序列大小的 片段純化出來(lái)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，采用的是電泳純化的方法。在本發(fā)明中，所述的需要干擾的目標(biāo)序列是指通過(guò)RNA干擾作用使其降解的序 列，其長(zhǎng)度可以為10-175bp，優(yōu)選為30-120bp，更優(yōu)選為60-80bp。在本發(fā)明中，序列S 的長(zhǎng)度為 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個(gè)堿基，優(yōu)選為 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24或25個(gè)堿基，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中為15個(gè)堿基。在本發(fā)明中，序列S不與目標(biāo)序列互補(bǔ)是指序列S無(wú)法與目標(biāo)序列形成互補(bǔ)的雙 鏈結(jié)構(gòu)。為了讓序列S形成的環(huán)比較柔軟，使其更容易形成環(huán)結(jié)構(gòu)，可以設(shè)計(jì)為序列S中的 AT含量較高，優(yōu)選為AT含量大于50%，更優(yōu)選為60%~90%,在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中， 為 67%。其中2)中所述的N段核苷酸序列或M段核苷酸序列的大小為小于等于60bp。其中2)中所述的N和M各自獨(dú)立地選自2、3、4、5和6，優(yōu)選為2、3和4，在本發(fā)明 的一個(gè)實(shí)施方案中，N和M為3。在本發(fā)明中，所述的其中與F (N-1)末端和FN首端的核苷酸序列互補(bǔ)的序列，存在 于同一條對(duì)應(yīng)的M段核苷酸序列之一上，是指與F1末端和F2首端的核苷酸序列互補(bǔ)的序 列、與F2末端和F3首端的核苷酸序列互補(bǔ)的序列、與F3末端和F4首端的核苷酸序列互補(bǔ) 的序列、以此類(lèi)推直至與FN-1末端和FN首端的核苷酸序列互補(bǔ)的序列，分別存在于同一條 對(duì)應(yīng)的M段核苷酸序列之一上。這樣設(shè)計(jì)的目的是使FN中各段序列的末端與對(duì)應(yīng)的RM中 各段序列的首端，以及FN中各段序列的首端與對(duì)應(yīng)的RM中各段序列的末端相互錯(cuò)開(kāi)，以避 免在不能錯(cuò)開(kāi)時(shí)，在變性和退火后無(wú)法形成正確連接的片段。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，與F1末端和F2首端的核苷酸序列互補(bǔ)的序列，存在 于R3上，與F2末端和F3首端的核苷酸序列互補(bǔ)的序列，存在于R2上。在本發(fā)明中，末端是指核苷酸序列的3'端，首端是指核苷酸序列的5'端。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，2)中所述的FN與RM的序列相同，即F3與R3相同， 且命名為Ml。在本發(fā)明中，理論序列是指含有目標(biāo)序列的能夠形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)的序列，同時(shí)當(dāng)理 論序列與其反向互補(bǔ)序列形成雙鏈時(shí)，在雙鏈兩端加入酶切位點(diǎn)后，也是插入RNAi表達(dá)載 體的序列。在本發(fā)明中，所述限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)是根據(jù)使用的載體的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì) 的，兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)可以相同，也可以不同。本發(fā)明的另一方面涉及所述的用于干擾目標(biāo)序列的RNAi片段及其制備方法在制 備RNAi表達(dá)載體中的用途。本發(fā)明的還一方面涉及一種重組載體，其特征在于包含本發(fā)明的用于干擾目標(biāo)序 列的RNAi片段。本發(fā)明的還一方面涉及重組載體的構(gòu)建方法，其包括以下步驟
1)將載體用本發(fā)明制備干擾目標(biāo)序列的RNAi片段中步驟2)中所述的限制性?xún)?nèi)切 酶進(jìn)行酶切，與本發(fā)明的用于干擾目標(biāo)序列的RNAi片段連接，即得到用于干擾目標(biāo)序列的 RNAi表達(dá)載體。2)任選地，對(duì)1)中得到的重組載體中干擾片段的插入進(jìn)行驗(yàn)證。其中本發(fā)明制備的用于干擾目標(biāo)序列的RNAi雙鏈片段是帶有缺口的雙鏈序列， 在其與載體連接時(shí)，由于加入了 T4DNA連接酶，雙鏈序列中的缺口得到了修補(bǔ)。在本發(fā)明中，所述載體可以為克隆載體或表達(dá)載體，所述表達(dá)載體可以為原核表 達(dá)載體或真核表達(dá)載體，所述RNAi表達(dá)載體包括但不限于pAdTrack-CMV，pShuttle-CMV, pAdEasy-1, PLAPSN, Pbmnz, pBMN-ires-GFP, PLNCX, PLNCX2, pMSCV-HYG, pMSCV-neo, pMSCV-puro, pLEGFP-Cl, pAAV-MCS, pAAV-lacZ, pAAV-IRES-hrGFP, pCMV-MCS, pAAV-RC, pHelper, pLVX-AcGFPl-Nl，pLVX-DsRed-Monomer-Nl, plenti6/V5_lacZ，PLP1, PLP2, PLP/ VSVG, pLOX-CW-CRE, pLOX-gfp-iresTK, pMD2. G 和 pCMV_dR8. 74。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述RNAi表達(dá)載體為p6，重組載體為p6+RNAiF。隨著技術(shù)的進(jìn)步，人工合成序列的合成成本會(huì)逐漸降低，低成本合成序列的長(zhǎng)度 會(huì)逐漸增加，本發(fā)明的技術(shù)方案也會(huì)隨著技術(shù)的改進(jìn)而做相應(yīng)地調(diào)整，合成片段的長(zhǎng)度將 不限于60bp，而是隨著低成本合成序列長(zhǎng)度的增加而增加，因此只要是基于本發(fā)明思想的 技術(shù)方案都在本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。


圖1根據(jù)被干擾目標(biāo)序列設(shè)計(jì)的RNAi序列示意2根據(jù)被干擾目標(biāo)序列設(shè)計(jì)的RNAi序列形成的頸環(huán)結(jié)構(gòu)示意3oligo序列連接示意4pCAMBIA_1301載體結(jié)構(gòu)示意5p6載體結(jié)構(gòu)示意6p6+RNAiF重組載體的PCR鑒定圖7經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織⑶S染色結(jié)果左未轉(zhuǎn)入p6+RNAiF載體的愈傷組織(對(duì)照)；右轉(zhuǎn)入p6+RNAiF載體的愈傷組織圖8經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻試管苗⑶S染色結(jié)果左未轉(zhuǎn)入p6+RNAiF載體的水稻試管苗(對(duì)照)；右轉(zhuǎn)入p6+RNAiF載體的水稻
試管苗發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用人工合成6條寡核苷酸序列(oligo序列)，每條長(zhǎng)度均小于60bp ；6條 oligo序列分別磷酸化，混合，變性，然后退火即得到含有酶切位點(diǎn)的RNAi干擾片段。該方 法不用酶切，直接就可與酶切后的載體連接成為重組載體。簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí) 間；而且當(dāng)人工合成序列大于60bp時(shí)，每個(gè)堿基要3. 8元人民幣，小于60bp，每個(gè)堿基只要 0. 8元人民幣(根據(jù)目前的序列合成費(fèi)用)，故大大降低了實(shí)驗(yàn)成本。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠(chǎng)商者，均為 可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1 :RNAi干擾BGIosRl基因的oligo序列設(shè)計(jì)BGIosRl基因全序列如下ATGGGAGCTAATTGCTGTATAGCTGCAAAAGAGAGGCCTCAGCCATGTGTTACTCCAATTGAAGTG TCAGCATTCAGGAACGTAAGACACTCTCCATCATGGAGCTTCCGGTGGGATAACCGCACACACATAGAAGACA TAATGGAAATGCCCGCATTGTTTTCCAACCATAGTAGTGGAAGCATTCGGCCTGAAACAAAGAGTGGCTCAAT TGCGCCAACTGATGGCTTTTCTAACGGAGGCAGCCCTTCTGATATGTTCAACAAGCTCAAGTGCCATAAATCTG ACAGGAAGAGGGAGTCATCTAAGATTGCGAGATCTGACCTTCGAGCAGGTAGATCCACCACAAGCAATTCTTCC CCTGAGGCAAAGCTTTCCAGAAAATCGCTAGACACAGTAAGTGTGGCTTCAGATTCGAAGATGTCAATCTCTGT TCCTTCAACGCCGCCTGCTATATCCAGAGCAGATCCTTCATCATCCTCCAGGGGGCATTCTCTACCAACAGAT
GCAGATTCAATGAGGAAAGCACG |tcgatcaccagggtatcaactgtatagacaggtctccgacag
caagattccatctctcaggtctctcaac^ AGGGCGCCTCTCCTGAAGGAAGGCCATCCTCCTCCATGCTCT
CAGTCTGCAGCAACGATTTATCTGCAGTAGGATCACATGGCGAGTCATCTGATGGTTGGTCAATGCGAACATTTTCT GAAATGGTCGCATCATCTCAGAGAGAGAGATGGTCAGTTGATAGTGAGCTCTTAGGTTCTGTTTCGAGTAAAATGAC AAGATCAAATGCTTCTAATAATCCTACTACACATTCACCTGACCAAGAGGTGTGCAAGCTATGTTTAAAGCTATTAA AGGAACGGTCCACATGGAATGCTCAGGAACTGGCTGTTGTTGCTGTTTTATTGTGCGGCCATGTTTACCATGCTGAC TGTTTGGATAGCTTAACTGCAGAAGCTGACAAATATGATCCCCCTTGTCCTGTATGCACCCATGGTGAGAAATGTAC AGTGAAGCTATTTGGGAAGTTGGAATCAAAGACAAAGAACAAGATACCTAAAAATGTGATAGTTGATGTTAATCTAG ATGGGAGCTCTAAGCATCAGAAGGAAAGTAGGAGAGAGCCCAGATTAGGCACAAGTTCTAGCTTGAAGGGCTCGTTT AGTCGCCCGTTTTTGAGAAGGCATTTCTCTATTGGCTCTCGGCCATCCCAGTCAATTTCAGAGAGCGAGTCTGCCAG AAAGAAGGGCTTCTGGGCAAGGCACTGGAGGGAATAG(SEQ ID NO 1)加框?yàn)?1bp RNAi序列，即選定的需要干擾的目標(biāo)序列。根據(jù)上述71bp序列，任意設(shè)計(jì)一段AT含量高，不與需要干擾的基因序列互補(bǔ)的 15bp序列So根據(jù)選中的71bp RNAi序列，正反連入15bp堿基序列的左右，得到一個(gè)理論序列， 即5’ -目標(biāo)序列-序列S-目標(biāo)序列的反向互補(bǔ)序列-3’ CGTTGAGAGACCTGAGAGATGGAATCTTGCTGTCGGAGACCTGTCTATACAGTTGATACCCTGGTGATC GA |acaatgagtaaagga| TCGATCACCAGGGTATCMCTGTATAGACAGGTCTCCGACAGCAAGATTCCATCTCT CAGGTCTCTCAACG(SEQ ID NO 2)其中加框?yàn)?5bp序列S。如圖1所示。當(dāng)形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖2。根據(jù)該理論序列，設(shè)計(jì)6條oligo序列(F1含有BamHI的酶切位點(diǎn)的粘性末端堿 基、R1含有Xbal酶切位點(diǎn)的粘性末端堿基)BGIosRIFl(43bp)GATCCGTTGAGAGACCTGAGAGATGGAATCTTGCTGTCGGAGA(SBQ ID NO 3)BGIosRlF2(59bp)
(xtgtctatacagttgataccctggtgatoga|acaatgAGTAAAGGA|togatcaccagg(seq id no 4)BGIosRIMI (59bp)GTATCAACTGTATAGACAGGTCTCCGACAGCAAGATTCCATCTCTCAGGTCTCTCAACG(SEQ ID NO 5)BGIosRlR2(59bp)CCTGTCTATACAGTTGATACCCTGGTGATCGATCCTTTACTCATTGCTCGATCACCAGG(SEQ ID NO 6)BGIosRIRl (43bp)CTAGCGTTGAGAGACCTGAGAGATGGAATCTTGCTGTCGGAGA(SEQ ID NO 7)參見(jiàn)圖3，其中F 3與R3在本實(shí)施例中相同，記為Ml。實(shí)施例2 :RNAi干擾BGIosRl基因的干擾片段制備接頭序列磷酸化體系20 illddH2014 ill10XPNK Buffer A 2 u 110 X ATP2 illPNK1 u 1引物liil于37°C 反應(yīng) 30min5條接頭oligo序列分別按照上述步驟進(jìn)行磷酸化。其中PNK 為 T4 多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase)(購(gòu)自 enzymatics 公司)。干擾片段制備反應(yīng)接頭序列F1 5 ill接頭序列F2 5 ill接頭序列R1 5 ill接頭序列R2 5 ill接頭序列Ml 10 U 1將上述磷酸化后的5條oligo序列按照上述比例混勻，于94°C水浴反應(yīng)45s，然后 自然冷卻到室溫，所得即為干擾片段RNAiF(圖3)，其序列為5’GATCCGTTGAGAGACCTGAGAGA TGGAATCTTGCTGTCGGAGACCTGTCTATACAGTT3，GCMCTCTCTGGACTCTCTACCTTAGMCGACAGCCTCTGGACAGATATGTCMGATACCCTGGTGATCG MCMTGAGTAMGGATCGATCACCAGGGTATCMCTGTATAGACTATGGGACCACTAGCTTGTTACTCATTTCCTAGCTA GTGGTCCCATAGTTGACATATCTCAGGTCTCCGACAGCMGATTCCATCTCTCAGGTCTCTCMCG 3，(SEQ ID NO 8)GTCCAGAGGCTGTCGTTCTMGGTAGAGAGTCCAGAGAGTTGCGATC 5，(SEQ ID NO 9)實(shí)施例3 :RNAi干擾BGIosR2基因的oligo序列設(shè)計(jì)BGIosR2基因全序列如下ATGACGTGTCACTCTGCCATGGCGGCTCTCACCGTTGGGCACGCGGCGATCGTCCATG CCACCACGCGTCTCGAGGACGCCCGGTCCACCGGCCGTCGGCGGCGGCGGCGGGGGATGATCACG GTGCGCGCGGCGGCGGCGGCGACGAGCGGGTGGGAGCCGGGCAGCTGGAGGGCGCGGCCGGCGAG
GCAAATCCCGGAGTACCCGGACGCGGCGGCGCTGGAGGGCG [CGGAGCGCGAGCTGGCGTCGTTCCCGCCGCTGGTGTTCGCCGGGGAGGCGCGGAAGCTGGAGGAGCGGCTq ggggacgccgccatg
GGGCGGGCCTTCCTCCTGCAGGGCGGCGACTGCGCCGAGAGCTTCAAAGAGTTCGCCGCCAACAACATCCGCGACAC CTTTCGCCTCATGCTCCAGATGGCCGTCGTCCTCACCTTTGGCGGCCAGATGCCCACCATCAAGGTTGGAAGGATGG CTGGCCAATTTGCAAAGCCAAGATCAAACCCAACTGAGACTATAGATGGAGTGACACTTCCTTCCTATCGAGGTGAT ATTATTAACAGCGATGGTTTTGATGAGAAGTCGCGTGCACCAGATCCTGAAAGGTTAATTAGAGCCTACAGCCAGTC CGCGAGCACCCTGAATCTTCTGAGAGGATTTGCTCATGGAGGGTATGCAGATCTGCAGAGAGTCACCCAGTGGAATC TTGACTTCTTGAGGGACAGCACGCAAGGGGACAGGTATATGGAGCTGTCCGAGAGGGTTCACGATGCCATCGGATTT ATGGTTGCTGCTGGTCTGACTCCTCAGCATCCCATCATGACGACGGCTGAATTCTGGACATCTCATGAGTGCCTTCA TTTGCCATATGAGCAAGCATTGACTAGGGTGGACTCCATTTCTGGGCTTTACTACGATTGCTCTGCTCATATGCTTT GGGTTGGGGAGAGGACTCGACAACTGGATGGTGCTCATGTTGAATTCCTTCGTGGTATTTCCAACCCTCTAGGTGTA AAGGTGAGTGACAAGCTCGAACCTTCAGAGCTTGTTAAATTGTGTGAGATTTTGAATCCTCACAACAAGCCCGGAAG ACTGACAATCATCACAAGAATGGGTGCTGAGAACACGCGCGTTAAGCTCCCACATATGATCAGAGCAGTCCGCCAAG CTGGGTTGATTGTCACTTGGGTCAGTGATCCCATGCATGGGAACACCATCAGCGCACCATGTGGTCTCAAGACAAGA TCATTCGACGCGATCAGGTGCGAGCTGAGGGCTTTCTTCGATGTCCATGAGCAAGAGGGAAGCTACCCTGGAGGGAT TCACCTGGAGATGACAGGGCAGAACGTTACAGAGTGCATTGGTGGATCCAAGACGGTGACCCTTGATGATCTCAGCT CTCGCTACCGCACGCACTGCGACCCCAGGCTGAATGCATCGCAGTCGCTTGAACTGGCTTTCGCCATTGCTGACAGG CTAAGGAAGAAACGAGACAGGGCTTGGAATAGGTTGGTGTACAGGGCGGTAGCTTAA(SEQ ID NO 10)加框?yàn)?1bp RANi序列，即我們需要干擾的目的基因序列。根據(jù)選中的71bp序列，任意設(shè)計(jì)一段AT含量高，不與需要干擾的基因序列互補(bǔ)的 15bp序列So將選中的71bp RANi序列，正反連入序列S的左右，得到一個(gè)理論序列 GAGCCGCTCCTCCAGCTTCCGCGCCTCCCCGGCGAACACCAGCGGCGGGAACGACGCCAGCTCGCGCTCC
g |ACAATGAGTAAAGGAl cggagcgcgagctggcgtcgttcccgccgctggtgttcgccggggaggcgcggaagct
GGAGGAGCGGCTC(SEQ ID NO 11)加框的為15bp的序列S。如圖1所示。如形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖2。根據(jù)該理論序列，設(shè)計(jì)6條Oligo序列(F1含有BamHI的酶切位點(diǎn)的粘性末端堿 基、R1含有Xbal酶切位點(diǎn)的粘性末端堿基)BGIosR2Fl(43bp)GATCGAGCCGCTCCTCCAGCTTCCGCGCCTCCCCGGCGAACAC(SEQ ID NO 12)BGIosR2F2(59bp)CAGCGGCGGGAACGACGCCAGCTCGCGCTCCGACAATGAGTAAAGGACGGAGCGCGAGC(SEQ ID NO 13)BGIosR2Ml (59bp)TGGCGTCGTTCCCGCCGCTGGTGTTCGCCGGGGAGGCGCGGMGCTGGAGGAGCGGCTC(SEQ ID NO 14)BGIosR2R2(59bp)CAGCGGCGGGAACGACGCCAGCTCGCGCTCCGTCCTTTACTCATTGTCGGAGCGCGAGC(SEQ ID NO 15)BGIosR2Rl (43bp)CTAGGAGCCGCTCCTCCAGCTTCCGCGCCTCCCCGGCGAACAC(SEQ ID NO 16)其中F3與R3在本實(shí)施例中相同，記為Ml。
實(shí)施例4 :RNAi干擾BGIosR2基因的干擾片段制備接頭序列磷酸化體系20 illddH2014 ill10XPNK Buffer A 2 u 110 X ATP2 illPNK1 u 1引物liil于37°C 反應(yīng) 30min5條接頭序列分別按照上述步驟進(jìn)行磷酸化。干擾片段制備反應(yīng)接頭序列F1 5 ill接頭序列F2 5 ill接頭序列R1 5 ill接頭序列R2 5 ill接頭序列Ml 10 ill將上述磷酸化后的5條oligo序列按照上述比例混勻，于94°C水浴反應(yīng)45s，然后 自然冷卻到室溫。將反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖電泳純化，回收161bp左右的片段，所得即為干擾 片段 RNAiF2，其序列為5，GATCGAGCCGCTCCTCCAGCTTCCGCGCCTCCCCGGCGAACACCAGCGGCGGGA ACG3 ’ CTCGGCGAGGAGGTCGAAGGCGCGGAGGGGCCGCTTGTGGTCGCCGCCCTTGCACGCCAGCTCGCGC
tccg [acaatgagtaaagg^ cggagcgcgagctggcgtcgttcccgctgcggtcgagcgcgaggctgttactca
TTTCCTGCCTCGCGCTCGACCGCAGCAAGGGCGCGCTGGTGTTCGCCGGGGAGGCGCGGAAGCTGGAGGAGCGGCT C 3’ (SEQ ID NO 17)GCGACCACAAGCGGCCCCTCCGCGCCTTCGACCTCCTCGCCGAGGATC 5’ (SEQ ID NO 18)實(shí)施例5 :p6載體的構(gòu)建1、玉米Ubiquitin啟動(dòng)子片段的PCR擴(kuò)增和pMD18_T+Ubi重組載體的構(gòu)建Ubi啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒，目 錄號(hào)DP320-02)提取玉米品種B73(Zea mays mays cv. B73)的基因組DNA，根據(jù)該啟動(dòng) 子在玉米B73gDNA中的序列，分別在首尾設(shè)計(jì)一對(duì)PCR特異性擴(kuò)增引物(上游引物F1 GGCTGCAGTGCAGCGTGACCCGGTCGT (SEQ ID NO 19)，加限制性酶切位點(diǎn) Pst I 和保護(hù)堿基，下 游引物R1 :GGCTGCAGAAGTAACACCAAAC (SEQ ID NO 20)，加限制性酶切位點(diǎn)Pst I和保護(hù)堿 基)。以上述提取的玉米B73的gDNA為模板，高保真Ex Taq(TaKaRa, DRR100B)聚合酶進(jìn) 行PCR擴(kuò)增。如表1所示。
0133]表1基因啟動(dòng)子擴(kuò)增的PCR體系_組成體積(Pi)_基因組DNA0.20138]dNTPs (2. 5mM)
0139]10 X Ex Buffer (含鎂離子)
0140]引物 Fl(50iiM)
0141]引物 Rl(50iiM)
0142]Ex taq
0143]ddH20
0144]_
0. 2
補(bǔ)齊至25 u 1PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，然后以94°C變性45s，55°C退火50s，72°C延伸 90s，進(jìn)行35個(gè)反應(yīng)循環(huán)，最后72°C延伸7min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收 試劑盒(目錄號(hào):DP209-03)純化回收。pMD18-T+Ubi重組載體的構(gòu)建將上述得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行T/A克隆(pMD18-T質(zhì)粒，TaKaRa，D103A)，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌，挑取陽(yáng)性克隆由深圳華大基因科技有限公司測(cè)序，證明準(zhǔn)確。其中，T/A克隆的連接條件如下T/A 連接體系10 illpMD18-T1 u 12 X solution I5u 1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10-20ng，根據(jù)其濃度定ddH20補(bǔ)齊至 10 ill于16 °C在節(jié)能型智能恒溫槽(寧波新芝，SDC-6)中連接8h以上，得到 PMD18-T+P604重組載體。將經(jīng)過(guò)上述連接后的產(chǎn)物按照如下方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌從超低溫冰箱中取出按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版，科學(xué)出版社)所示氯 化鈣法制備的感受態(tài)細(xì)胞100 iil DH5a (中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所董楊提供；或者可 從例如上海生工購(gòu)得)，冰上融化后，加入10 u 1如上所得的連接產(chǎn)物，即pMD18-T+P604 重組載體，輕輕攪勻，冰浴30min，42°C熱激60s，冰浴5min，加600 u 1 4°C預(yù)冷的S0C培養(yǎng) 基(具體配方詳見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)，37°C 220rpm復(fù)蘇45min， 8000rpm離心30s，去上清，留取150 yl，用剩下的150 yl上清重懸沉淀后的混合物，輕輕 吹勻，玻璃珠涂布LB(卡那霉素)平板(具體配方詳見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué) 出版社)，37°C倒置培養(yǎng)16-24h。獲得含有pMD18-T+Ubi克隆載體的重組大腸桿菌，命名為 DH5a -Ubi02、pCAMBIA-1301+Ubi 重組載體的構(gòu)建按照TIANGEN普通質(zhì)粒小提試劑盒(目錄號(hào)DP103_03)的操作手冊(cè)，從實(shí)施例1 構(gòu)建的轉(zhuǎn)化有啟動(dòng)子Ubi的大腸桿菌DH5a_Ubi中提取帶有玉米Ubi啟動(dòng)子序列的克隆載 體pMD18-T+Ubi ；純化后用相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶Pst I (NEB)進(jìn)行酶切，然后用TIANGEN瓊 脂糖凝膠DNA回收試劑盒(目錄號(hào)DP209-03)回收相應(yīng)的啟動(dòng)子片段。同時(shí)用限制性?xún)?nèi)切酶Pst I酶切pCAMBIA-1301質(zhì)粒(參見(jiàn)圖4，中國(guó)科學(xué)院 昆明動(dòng)物研究所董楊提供；或者可從例如上海國(guó)瑞基因科技有限公司購(gòu)得，該公司的 pCAMBIA-1301 質(zhì)粒的原始來(lái)源是 The CAMBIA Bios (biological open source) Licensee,Australia)并回收。酶切體系50 μl ddH20 34. 9 μ l
IOXbuffer 35 μ l
Pst I 0. 1 μ I(IOU)克隆載體pMD18-T+Ubi 或 pCAMBIA-1301 質(zhì)粒 10 μ 1 ( < IOOOng)將回收的啟動(dòng)子片段Ubi與回收的載體片段根據(jù)T4連接酶(TaKaRa，D2011A)操 作說(shuō)明，按照如下條件進(jìn)行連接
連接體系10 μ lIOXT4 buffer1 μ l
回收的 pCAMBIA-1301 質(zhì)粒 1 μ l (20ng)回收的啟動(dòng)子Ubi插入片段10-20ng，根據(jù)其濃度定ddH20 補(bǔ)齊至9. 5μ 1
T4 ligase (TaKaRa, D2011A) 0. 5 μ 1于16°C節(jié)能型智能恒溫槽(寧波新芝，SDC-6)中連接8h以上。將100 μ 1氯化鈣法制得的感受態(tài)細(xì)胞DH5 α從超低溫冰箱取出，冰上融化后，加 入10 μ 1上面的連接產(chǎn)物，輕輕攪勻，冰浴3011^11，421熱激608，冰浴51^11，加60(^1 4°C 預(yù)冷的S0C, 370CT 220rpm復(fù)蘇45min，8000rpm離心30s，去上清，留取150 μ 1，輕輕吹勻， 玻璃珠涂布LB(kan)，37°C倒置培養(yǎng)16_24h。得到重組載體pCAMBIA-1301+Ubi。分別以Fl和Rl為引物對(duì)所得重組載體pCAMBIA-1301+Ubi進(jìn)行PCR檢測(cè)，以確證 所得重組載體pCAMBIA-1301+Ubi中含有所需啟動(dòng)子Ub i。3、NOS終止子的PCR擴(kuò)增和pMD18_T+N0S重組載體的構(gòu)建根據(jù)pCAMBI A-1301質(zhì)粒中NOS終止子的序列，分別在首尾設(shè)計(jì)一對(duì)PCR特異性 擴(kuò)增引物(上游引物 F2 :GGGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAA(SEQ ID NO :21)，加限制性酶切 位點(diǎn) SacI 和保護(hù)堿基，下游引物 R2 GGGAATTCCCGATCTAGTAACATAGAT (SEQ ID NO :22)，加限 制性酶切位點(diǎn)EcoRI和保護(hù)堿基)。以上述提取的pCAMBIA-1301質(zhì)粒為模板，高保真Ex Taq (TaKaRa, DRR100B)聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如表1所示。將上述得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行T/A克隆(PMD18-T質(zhì)粒，TaKaRa，D103A)，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌，獲得含有PMD18-T+N0S克隆載體的重組大腸桿菌，命名為DH5-N0S。挑取陽(yáng)性克隆 由深圳華大基因科技有限公司測(cè)序，證明準(zhǔn)確。4、pCAMBIA-1301+Ubi+NOS 即 p6 重組載體的構(gòu)建按照TIANGEN普通質(zhì)粒小提試劑盒(目錄號(hào)DP103_03)的操作手冊(cè)，提取實(shí)施例 3構(gòu)建的克隆載體PMD18-T+N0S ；純化后用相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶Sac I (NEB)和EcoR I (NEB) 進(jìn)行酶切，然后用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(目錄號(hào)DP209-03)回收相應(yīng)的NOS 終止子片段。同時(shí)用限制性?xún)?nèi)切酶Sac I和EcoR I酶切pCAMBIA-1301+Ubi質(zhì)粒并回收。酶切體系 50 μ 1ddH2034. 9 μ 1IOXbuffer 1 5μ 1Sac I0. 1 μ I(IOU)
EcoR I0. lu 1(10U)載體pMD18-T+N0S 或 pCAMBIA-1301+Ubi 質(zhì)粒 10 ii 1 ( < lOOOng)將回收的終止子片段NOS與回收的載體片段用T4連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì) 胞DH5 a得到重組載體pCAMBIA-1301+Ubi+N0S，即p6 (參見(jiàn)圖5)。實(shí)施例6 p6+RNAiF重組載體的構(gòu)建提取p6質(zhì)粒，并用相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和Xba I酶切后回收大片段，然 后與實(shí)施例2獲得的干擾片段RNAiF進(jìn)行連接，隨后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 a得到重組載體 p6+RNAiF。其中實(shí)施例2獲得的干擾片段RNAiF是帶有缺口的雙鏈序列，在其與p6質(zhì)粒連 接時(shí)，由于加入了 T4DNA連接酶，雙鏈序列中的缺口得到了修補(bǔ)。篩選陽(yáng)性克隆用CCCTGCCTTCATACGCTATT (SEQ ID NO 23)與 CGGCAACAGGATTCAATCTT (SEQ ID NO 24)作為引物(該引物根據(jù)載體序列設(shè)計(jì))進(jìn)行PCR檢 測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖6。因?yàn)槭?1bp正反向插入各一次，加上中間的15bp環(huán)，共157bp，所選擇的 PCR檢測(cè)弓|物加上了載體的203個(gè)bp，故總長(zhǎng)度是360bp左右。這個(gè)360bp序列因?yàn)槠渲杏?頸環(huán)結(jié)構(gòu)，其單鏈能自發(fā)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，因?yàn)槭菃捂?，所以長(zhǎng)度只有360的一半，即180bp。 故在電泳圖中出現(xiàn)360bp和180bp兩條條帶(參見(jiàn)圖6)。后測(cè)序確定。實(shí)施例4所獲得的干擾片段用上述同樣的方法與P6載體重組，得到含實(shí)施例4的 干擾片段的重組載體。實(shí)施例7重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-p6+RNAiF細(xì)胞的制備將如實(shí)施例6所述方法構(gòu)建的p6+RNAiF重組載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化按照《分子克隆實(shí) 驗(yàn)指南》(第三版，科學(xué)出版社)中所述氯化鈣方法制備的根癌農(nóng)桿菌EHA105 (2009年12 月24日保藏于湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心，即中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC M209315)的感受態(tài)細(xì)胞，具體方法如下將根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105于超低溫冰箱中取出，置于冰上解凍。融化后， 加入5 ill的p6+RNAiF重組載體，輕輕混勻，冰浴lOmin，放入液氮中冷凍5min，37°C解凍 5min，加入800 u 1常溫的LB液體培養(yǎng)基，28°C 160rpm復(fù)蘇3h，8000rpm離心30s，吸去上 清，留下200 u 1吹勻，涂布于加有kan-rif (卡那霉素-利福平)雙抗的YM培養(yǎng)基平板上 (50mg/l Kan,10mg/1 Rif，具體配方參見(jiàn)表4)。28°C倒置培養(yǎng)2-3天。以 CCCTGCCTTCATACGCTATT (SEQ ID NO 23)與 CGGCAACAGGATTCAATCTT (SEQ ID NO: 24)為引物進(jìn)行PCR檢測(cè)篩選轉(zhuǎn)化子。PCR擴(kuò)增出約180bp條帶的為重組載體p6+RNAiF的 重組根癌農(nóng)桿菌。本發(fā)明中，按照如上述方法得到的帶有重組載體P6+RNAiF的重組農(nóng)桿菌，命名為 重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-p6+RNAiF。實(shí)施例8水稻愈傷組織的誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)化按照如下步驟誘導(dǎo)水稻愈傷組織，并分別用重組根癌農(nóng)桿菌EHA105_p6+RNAiF轉(zhuǎn) 化所述愈傷組織。1)將水稻日本晴種子(2009年12月18日保藏于湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大 學(xué)保藏中心，即中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC P200910)去殼，70% 乙醇表面消毒30s，然后用有效氯1. 5%的次氯酸鈉消毒30min，期間劇烈搖動(dòng)，消毒后用滅 菌水清洗5次；將消毒后的種子置于N6D培養(yǎng)基(具體配方參見(jiàn)表2)上，用封口膜封口 ；29. 5°C光照培養(yǎng)3-4周；2)選取活躍生長(zhǎng)的愈傷組織(黃白色，干燥，直徑l_3mm)，在新N6D培養(yǎng)基上 29. 5°C光照培養(yǎng)3天；3)分別挑取如實(shí)施例4所構(gòu)建的重組根癌農(nóng)桿菌單菌落(重組根癌農(nóng)桿菌 EHA105-p6+RNAiF)，于添加抗生素(50mg/l Kan, 10mg/l Rif)的YM培養(yǎng)基(具體配方參 見(jiàn)表3、表4)上劃線(xiàn)培養(yǎng)3天，培養(yǎng)溫度28V ；分別刮取上述重組根癌農(nóng)桿菌置于添加了 30 ill lOOmM的AS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)的30ml AAM培養(yǎng)基(具體配方參見(jiàn)表 5)中，溫和重懸所述重組根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞(重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-p6+RNAiF)；4)將繼代培養(yǎng)的愈傷組織置于滅菌培養(yǎng)皿中；將如步驟4制備的重組根癌農(nóng)桿菌 懸液倒入培養(yǎng)皿中，將愈傷組織浸入其中15min ；5)倒掉重組根癌農(nóng)桿菌懸液，將愈傷組織用滅菌吸水紙吸掉多余的液體；于 N6-AS培養(yǎng)基(配方參見(jiàn)表6)上放一張滅菌濾紙，加1ml如上述含AS的AAM培養(yǎng)基，將愈 傷組織轉(zhuǎn)移至濾紙上；密封培養(yǎng)皿，28°C暗培養(yǎng)48-60h ；6)將受感染的愈傷組織置于50ml滅菌管中，用滅菌水搖動(dòng)清洗，直至上清液變 澄清；將愈傷組織浸泡于含500mg/l羧芐青霉素(Carb)的無(wú)菌水中以殺死重組根癌農(nóng)桿 菌；用滅菌吸水紙除去愈傷組織上多余的水分，然后將其轉(zhuǎn)移至含lmg/1潮霉素B(HmB)和 50mg/l Carb的N6-AS培養(yǎng)基上；用封口膜密封培養(yǎng)皿，29. 5°C光照培養(yǎng)3_4周。實(shí)施例9水稻愈傷組織中的⑶S的表達(dá)為檢測(cè)經(jīng)過(guò)實(shí)施例8所述轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織中目的基因⑶S的表達(dá)情況，按照 Chen S Y 等在 Journal of Integrative Plant Biology, 2008, 50 (6) :742_751 所述的方 法，對(duì)分別用重組根癌農(nóng)桿菌EHA105-p6+RNAiF轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織進(jìn)行染色。GUS 染色液的配方(1ml) 610 u 1 0. 2M Na2HP04 溶液(pH = 7. 0) ；390 u 1 0. 2M NaH2P04 溶液和 10 u 1 0. lMX-gluc。將用重組根癌農(nóng)桿菌EHA105_p6+RNAiF轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織浸泡在⑶S染色液 中，37°C保溫至出現(xiàn)藍(lán)色，拍照記錄，結(jié)果如圖4所示，含有p6+RNAiF重組載體的根癌農(nóng)桿 菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織(圖7右)經(jīng)染色后呈現(xiàn)藍(lán)色，未轉(zhuǎn)重組載體對(duì)照(圖7左) 經(jīng)⑶S染色后顏色未發(fā)生變化。結(jié)果顯示，本發(fā)明p6+RNAiF轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織。實(shí)施例10 轉(zhuǎn)基因水稻苗中⑶S的表達(dá)將實(shí)施例6中得到的愈傷組織轉(zhuǎn)移至含50mg/l潮霉素B (HmB)的MS-R分化培養(yǎng) 基(具體配方見(jiàn)表7)分化苗；用封口膜密封培養(yǎng)皿，29. 5°C光照培養(yǎng)3-4周；待幼苗長(zhǎng)至 3-4cm時(shí)轉(zhuǎn)移到含50mg/l潮霉素B (HmB)的1/2MS生根培養(yǎng)基(具體配方參見(jiàn)表8)進(jìn)行生 根篩選。轉(zhuǎn)基因水稻苗的GUS染色過(guò)程同實(shí)施例5中愈傷組織的染色過(guò)程。結(jié)果如圖5所 示，經(jīng)含有p6+RNAiF重組載體的重組根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻苗的根、莖、葉(圖8右) 經(jīng)染色后呈現(xiàn)藍(lán)色，未轉(zhuǎn)重組載體對(duì)照(圖8左)經(jīng)⑶S染色后顏色未發(fā)生變化。結(jié)果顯 示，本發(fā)明p6+RNAiF轉(zhuǎn)入水稻苗中。本發(fā)明實(shí)施例中所使用的相關(guān)培養(yǎng)基配方說(shuō)明如下以下有關(guān)培養(yǎng)基中所稱(chēng)的“常規(guī)滅菌”是指如下條件的滅菌121°C下蒸氣滅菌 20mino
本發(fā)明所用試劑配方為N6 macro母液(20X)硝酸鉀56. 60g，磷酸二氫鉀8. 00g, 硫酸銨9. 26g，硫酸鎂3. 70g，氯化鈣3. 32g，蒸餾水定容至1L，4°C保存?zhèn)溆?。N6 micro 母液(1000X)碘化鉀 0. 80g，硼酸 1. 60g，硫酸錳 3. 33g，硫酸鋅 1. 50g， 蒸餾水定容至1L，4°C保存?zhèn)溆?。鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(100X)將3. 73g 乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA 2H20)和 2. 78g FeS04. 7H20分別溶解，混合并用。用蒸餾水定容至1000ml，70°C溫浴2h，冷卻后4°C 保存不超過(guò)1個(gè)月。N6維生素貯存液(1000X)維生素& 0. 10g，維生素B6 0. 05g，煙酸0. 05g，甘氨酸 0. 20g，加蒸餾水定容至100ml，過(guò)濾除菌，4°C保存不超過(guò)1周。AAM macro (10X) :2. 5g 七水硫酸鎂(MgS04 7H20)，1. 5g 二 水氯化鈣 (CaC12 2H20)，1. 33g 二水磷酸二氫鈉(NaH2P04. 2H20)，蒸餾水定容至1L，4°C保存?zhèn)溆?。AAM micro (100X) :0. 7g 單水硫酸錳(MnS04 H20)，0. 2g 七水硫酸鋅 (ZnS04 *7H20) ,0. 075g 碘化鉀(KI)，0. 3g 硼酸(H3B03)，25mg 二水鉬酸鈉(Na2Mo04. 2H20)， 2. 5mg五水硫酸銅(CuS04. 5H20)，2. 5mg六水氯化鈷(CoC12. 6H20)，蒸餾水定容至1L，4°C保 存?zhèn)溆?。AAM 有機(jī)(1000X) :0. 75g 甘氨酸(Glycine)，0. lg 煙酸(Nicotinicacid)， 0. lgVB6(Pyridoxine)，lgVBl (Thiamine)，蒸餾水定容至 100ml，4°C 保存?zhèn)溆?。MS macro (20X)硝酸銨33. 0g,硝酸鉀38. 0g,磷酸二氫鉀3. 4g，硫酸鎂7. 4g，氯化 鈣8. 8g逐一溶解，然后室溫下用蒸餾水定容至1L，4°C保存。MS micro (1000X)硫酸錳 16. 90g，硫酸鋅 8. 60g，硼酸 6. 20g，碘化鉀 0. 83g，鉬酸 鈉0. 25g，硫酸銅0. 025g，氯化鈷0. 025g，上述試劑在室溫下溶解并用蒸餾水定容至1L，4°C保存。MS維生素貯存液(1000X)維生素0.010g，維生素B6 0. 050g，煙酸0. 050g，甘 氨酸0. 200g，加蒸餾水定容至100ml，過(guò)濾除菌，4°C保存不超過(guò)1周。表2 N6D培養(yǎng)基
1L
N6macro 母液(20X)50ml
Fe2EDTA 貯存液(100X)10ml
N6micro 母液(1000X)1ml
N6維生素貯存液(1000X)1ml
肌醇(500X)2ml
2，4-D 貯存液(lmg/ml)2ml
脯氨酸(Proline)2. 88g
水解酪蛋白(CH)0. 30g
蔴糖(sucrose)30g
植物凝膠(Phytagel)3g
用1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 8，封口后按常規(guī)方法滅菌。 表3 YM液體培養(yǎng)基(含有50mg/L Kan, 10mg/L Rif)
權(quán)利要求
一種用于干擾目標(biāo)序列的RNAi片段，其特征在于所述RNAi片段是通過(guò)以下方法得到的1)針對(duì)需要干擾的目標(biāo)序列，任意設(shè)計(jì)一段不與目標(biāo)序列互補(bǔ)的序列S，得到一個(gè)理論序列，即5’ 目標(biāo)序列 序列S 目標(biāo)序列的反向互補(bǔ)序列 3’；2)將1)中所述理論序列分N段合成，得到一定大小的N段核苷酸序列，所述N段核苷酸序列按照理論序列從5’到3’的順序分別命名為F1 FN；將所述理論序列的反向互補(bǔ)序列分M段合成，得到一定大小的M段核苷酸序列，所述M段核苷酸序列按照理論序列的反向互補(bǔ)序列從5’到3’的順序分別命名為R1 RM；同時(shí)在F1和R1的5’端分別添加含有限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)粘性末端或平末端的核苷酸序列；其中與F(N 1)末端和FN首端的核苷酸序列互補(bǔ)的序列，存在于同一條對(duì)應(yīng)的M段核苷酸序列之一上；3)將N段核苷酸序列和M段核苷酸序列的5’ OH分別進(jìn)行磷酸化；4)將磷酸化后的N段核苷酸序列和M段核苷酸序列等比例混合，先變性，再退火，得到用于干擾目標(biāo)序列的RNAi片段；在退火后可任選地加入對(duì)退火產(chǎn)物中符合理論序列大小的片段進(jìn)行純化的步驟。
2.一種用于干擾目標(biāo)序列的RNAi片段的制備方法，其包括以下步驟1)選定需要干擾的目標(biāo)序列，任意設(shè)計(jì)一段不與目標(biāo)序列互補(bǔ)的序列S，得到一個(gè)理 論序列，即5’ -目標(biāo)序列-序列S-目標(biāo)序列的反向互補(bǔ)序列-3’ ；2)將1)中所述理論序列分N段合成，得到一定大小的N段核苷酸序列，所述N段核苷 酸序列按照理論序列從5’到3’的順序分別命名為F1-FN;將所述理論序列的反向互補(bǔ)序 列分M段合成，得到一定大小的M段核苷酸序列，所述M段核苷酸序列按照理論序列反向互 補(bǔ)序列從5’到3’的順序分別命名為R1-RM ；同時(shí)在F1和R1的5’端分別添加含有限制性 內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)粘性末端或平末端的核苷酸序列；其中與F(N-l)末端和FN首端的核苷酸 序列互補(bǔ)的序列，存在于同一條對(duì)應(yīng)的M段核苷酸序列之一上；3)將N段核苷酸序列和M段核苷酸序列的5’-0H分別進(jìn)行磷酸化；4)將磷酸化后的N段核苷酸序列和M段核苷酸序列等比例混合，先變性，再退火，得到 用于干擾目標(biāo)序列的RNAi片段；在退火后可任選地加入對(duì)退火產(chǎn)物中符合理論序列大小 的片段進(jìn)行純化的步驟。
3.權(quán)利要求1的RNAi片段或權(quán)利要求2的制備方法，其中1)中所述的需要干擾的目 標(biāo)序列長(zhǎng)度為10-175bp，優(yōu)選為30-120bp，更優(yōu)選為60-80bp。
4.權(quán)利要求1的RNAi片段或權(quán)利要求2的制備方法，其中1)中所述的序列S的長(zhǎng)度為 3-30bp，優(yōu)選為10-25bp，更優(yōu)選為15bp ；序列S中的AT含量為大于50%，優(yōu)選為60-90%。
5.權(quán)利要求1的RNAi片段或權(quán)利要求2的制備方法，其中2)中所述的N段核苷酸序 列或M段核苷酸序列的大小為小于等于60bp。
6.權(quán)利要求1的RNAi片段或權(quán)利要求2的制備方法，其中2)中所述的N和M各自獨(dú) 立地選自2、3、4、5和6，優(yōu)選為2、3和4，更優(yōu)選為3。
7.權(quán)利要求1的RNAi片段或權(quán)利要求2的制備方法，其中2)中所述的FN與RM的序 列相同。
8.權(quán)利要求1的RNAi片段或權(quán)利要求2的制備方法，其中4)中所述的變性溫度為大 于等于90°C，優(yōu)選為92-98°C，更優(yōu)選為94-96°C。
9.一種重組載體，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的RNAi片段。
10.權(quán)利要求9的重組載體的構(gòu)建方法，其包括以下步驟 1)將載體用權(quán)利要求1步驟2)中所述的限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切，與權(quán)利要求1的用于 干擾目標(biāo)序列的RNAi片段連接，即得到重組載體。2)任選地，對(duì)1)中得到的重組載體中干擾片段的插入進(jìn)行驗(yàn)證。
11.權(quán)利要求1所述的RNAi片段或權(quán)利要求2的制備方法用于構(gòu)建RNAi表達(dá)載體的 用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)，涉及一種用于干擾目標(biāo)序列的RNA i片段及其制備方法，所述方法為根據(jù)目標(biāo)序列得到一個(gè)可以形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)的理論序列，根據(jù)該理論序列設(shè)計(jì)并分段合成該序列以及該序列的反向互補(bǔ)序列，將分段合成的序列磷酸化，然后將磷酸化后的序列混合，變性，退火，最后與酶切后的RNAi表達(dá)載體連接即得到用于干擾目標(biāo)序列的RNA i表達(dá)載體。本發(fā)明還涉及含有用于干擾目標(biāo)序列的RNA i片段的重組載體及其制備方法，以及所述RNAi片段用于構(gòu)建RNAi表達(dá)載體的用途。本發(fā)明所述方法用于構(gòu)建RNAi表達(dá)載體時(shí)，能夠簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，降低實(shí)驗(yàn)成本。
文檔編號(hào)C12N15/113GK101979564SQ201010541879
公開(kāi)日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月12日
發(fā)明者倪雪梅, 全志武, 夏秋菊, 張耕耘 申請(qǐng)人:深圳華大基因科技有限公司