專利名稱：mDHCR24干擾靶點(diǎn)序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。涉及mDHCR24的mRNA上用于RNA干 擾的4個(gè)靶點(diǎn)，以及將這些靶點(diǎn)以各種方式獲得的siRNAs。這四種siRNAs中的一種或兩種 以上的組合，在制備減毒型脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑方面，與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑聯(lián)合應(yīng)用，用以降低脂 質(zhì)體毒性。
背景技術(shù)：
DHCR24 (24-dehydrocholesterol reductase，24-脫氫膽固醇還原酶)是膽固醇 生物合成中最后一步的酶，催化膽留醇到膽固醇的轉(zhuǎn)化。人體內(nèi)膽固醇的來源分為兩種，即 來源于食物的外源性膽固醇及由肝臟和小腸等在相關(guān)酶的促進(jìn)下合成的內(nèi)源性膽固醇。其 中外源性膽固醇占40%，而內(nèi)源性膽固醇占60%。在精確的調(diào)控下，細(xì)胞內(nèi)的游離膽固醇 的濃度維持在正常而恒定的水平，以維持細(xì)胞的正常生理功能的需要。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的膽固醇 或者其他脂質(zhì)成分過多，不能及時(shí)得到糾正時(shí)，便會(huì)通過氧化應(yīng)激或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的方式 對細(xì)胞產(chǎn)生毒害，導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。脂質(zhì)體(Liposomes)是由磷脂和膽固醇等為膜材包合而成。磷脂分散在水中時(shí)能 形成多層微囊，且每層均為脂質(zhì)雙分子層，各層之間被水相隔開，這種微囊就是脂質(zhì)體。脂 質(zhì)體的組成由類脂質(zhì)(磷脂)及附加劑組成。1、磷脂類包括天然磷脂和合成磷脂二類。磷 脂的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為一個(gè)磷酸基和一個(gè)季銨鹽基組成的親水性基團(tuán)，以及由兩個(gè)較長的烴基組 成的親脂性基團(tuán)。天然磷脂以卵磷脂(磷脂酰膽堿，PC)為主，來源于蛋黃和大豆，顯中性。 合成磷脂主要有DPPP ( 二棕櫚酰磷脂酰膽堿)、DPPE (二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺)、DSPC (二 硬脂酰磷脂酰膽堿)等，其均屬氫化磷脂類，具有性質(zhì)穩(wěn)定，抗氧化性強(qiáng)，成品穩(wěn)定等特點(diǎn)， 是目前國外首選的輔料。2、膽固醇膽固醇與磷脂是共同構(gòu)成細(xì)胞膜和脂質(zhì)體的基礎(chǔ)物 質(zhì)。膽固醇具有調(diào)節(jié)膜流動(dòng)性的作用，故可稱為脂質(zhì)體“流動(dòng)性緩沖劑”。目前脂質(zhì)體已應(yīng) 用于研究蛋白質(zhì)與生物膜的相互作用、生物膜中離子的轉(zhuǎn)運(yùn)、藥物與膜受體作用、酶催化活 性模擬、包載藥物、基因轉(zhuǎn)移等方面。陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過 靜電作用將DNA分子包裹入內(nèi)，形成DNA —脂復(fù)合體，也能被表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜吸附， 再通過膜的融合或細(xì)胞的內(nèi)吞作用，偶爾也通過直接滲透作用，將DNA傳遞進(jìn)入細(xì)胞，形成 包涵體或進(jìn)入溶酶體其中一小部分DNA能從包涵體內(nèi)釋放，并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，再進(jìn)一步進(jìn) 入核內(nèi)轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。已有眾多的文獻(xiàn)報(bào)道，脂質(zhì)體本身會(huì)參與細(xì)胞生理活動(dòng)，引起基因表達(dá) 的上調(diào)或下調(diào)。如參與PKC (蛋白激酶C)通路調(diào)節(jié)(Biochemistry. 1992 Sep 22 ；31 (37) 9025-30)；如抑制 ATP 酶的活性(Biochim Biophys Acta. 2008Apr ； 1777 (4) :362_8)；如與 線粒體膜發(fā)生作用(J Biol Chem. 1989Jan25 ；264 (3) 1508-15)；轉(zhuǎn)染siRNA造成脫靶效應(yīng) 等等。細(xì)胞毒性的大小往往意味著對細(xì)胞生理活動(dòng)影響的大小，脂質(zhì)體這些作用是造成細(xì) 胞毒性的根本原因。這會(huì)對相關(guān)研究數(shù)據(jù)產(chǎn)生嚴(yán)重的干擾，甚至影響研究的結(jié)論。這已引 起了許多研究者的注意。雖然人們早已發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體對細(xì)胞的毒性以及對研究的影響，但由 于一直沒有更好的方法尤其是更高效的轉(zhuǎn)染方法代替脂質(zhì)體，所以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的應(yīng)用到現(xiàn)在依然非常廣泛，但還沒有更好的辦法可以在降低脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞毒性的同時(shí)保證其 轉(zhuǎn)染的高效性。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的一種 現(xiàn)象，它是指當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA(double stranded RNA, dsRNA)時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又 稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。外源 dsRNA 進(jìn)入 細(xì)胞后產(chǎn)生的小分子干擾RNA (small interfering RNA, si RNA)的反義鏈和多種核酸酶形 成了沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex, RISC)，RISC 具有結(jié)合和切割 mRNA 的 作用而介導(dǎo)RNA干擾的過程。RNAi具有特異性和高效性。這種技術(shù)已經(jīng)成為研究基因功能 的重要工具，并將在病毒病、遺傳性疾病和腫瘤病的治療方面發(fā)揮重要作用。RNAi能夠被迅速應(yīng)用于多種生物和醫(yī)學(xué)方面的研究，得益于其實(shí)驗(yàn)方法相對簡 單，實(shí)驗(yàn)周期較短，表型易于觀察。RNAi試驗(yàn)中最關(guān)鍵的因素是干擾靶點(diǎn)的選擇和基因?qū)?方法。RNAi是在mRNA水平上針對某一特定的基因發(fā)揮作用，并不是任意選擇一段序列都 可以達(dá)到對靶基因的抑制效果。不同的靶點(diǎn)抑制效果的差別很大，至今也沒有統(tǒng)一的確定 最有效靶點(diǎn)的原則。根據(jù)siRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和生物學(xué)特性，并且結(jié)合經(jīng)驗(yàn)，人們提出以下設(shè) 計(jì)和合成siRNA時(shí)應(yīng)遵循的原則，即1. antisense的5’端為A/U ；2. sense的5’端為G/ C ；3. antisense的5’端的7個(gè)堿基中至少有5個(gè)A/U ；4. siRNA序列中沒有連續(xù)9個(gè)以上 的GC片段；5. GC含量在31. 6%-57. 9% ；6.每條鏈C端最好有兩個(gè)堿基(最好是UU)突 出；7.最后，選擇的sense以及antisense序列經(jīng)BLAST同源檢索，應(yīng)與其他同種基因無同 源性，以避免非特異性抑制。通常認(rèn)為，根據(jù)以上原則在一個(gè)靶基因的轉(zhuǎn)錄子上選定3-5個(gè) 靶序列設(shè)計(jì)得到的siRNA，至少有一個(gè)是有效的。但這些原則不是絕對的，靶點(diǎn)是否有效還 需要靠實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。目前有四種方法可以獲得siRNA，化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄、siRNA表達(dá)試劑 盒以及質(zhì)?；蛘卟《据d體體內(nèi)表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是根據(jù)mDHCR24的序列，提供有效的RNAi作用靶點(diǎn)，以及將這些靶 點(diǎn)以各種方式獲得siRNA，在制備減毒型脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑方面與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑聯(lián)合應(yīng)用， 可以在確保靶基因被下調(diào)的同時(shí)，不僅有效抑制脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的毒性，而且同時(shí)保證其 轉(zhuǎn)染的高效性。本發(fā)明提供了針對mDHCR24的mRNA序列有效的RNAi靶點(diǎn)5-GCACAGGCATCGAGTCATC-35-GCACGGGTTCCAAATGTTA-3或5-GCGCCTGGGTGGTGTTCAA-3
或 5-ACTCAGACCTGTTCTATGC-3。根據(jù)上述的四個(gè)mDHCR24的RNA干擾靶點(diǎn)序列分別獲得四種siRNA，采用四種 siRNA的一種或兩種以上的組合與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑聯(lián)合使用，應(yīng)用于制備減毒型脂質(zhì)體轉(zhuǎn) 染試劑，以降低脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑細(xì)胞毒性。本發(fā)明針對mDHCR24的mRNA序列的有效的RNAi作用靶點(diǎn)，并且利用這些靶點(diǎn)進(jìn) 行RNAi作用，可以在確保靶基因被下調(diào)的同時(shí)，有效抑制脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的毒性。本發(fā)明獲得的mDHCR24的RNAi作用靶點(diǎn)，來源于化學(xué)合成途徑。RNAi干擾的有效性利用半定量PCR方 法驗(yàn)證，其細(xì)胞毒性檢測采取位差顯微鏡觀察及細(xì)胞計(jì)數(shù)方法評價(jià)。本發(fā)明根據(jù)mDHCR24 (mouse DHCR24, mDHCR24)的mRNA序列中四個(gè)有效的RNA干 擾靶點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)合成得到了 4種siRNA，在細(xì)胞水平的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染研究中，將四種siRNA與 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑聯(lián)合應(yīng)用，在保證了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率及RNA干擾效率的同時(shí)，有效抑制了 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染中產(chǎn)生的細(xì)胞毒性，為其作為抑制脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑細(xì)胞毒性的試劑進(jìn)行商業(yè)用 途的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。


圖IA mDHCR24的四個(gè)RNA干擾靶點(diǎn)序列在mDHCR24的mRNA序列上的位置。圖IB mDHCR24的四個(gè)RNA干擾靶點(diǎn)序列對應(yīng)的氨基酸序列在mDHCR24的氨基酸 一級序列上的位置。圖2A DharmaFECT 1脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑對神經(jīng)細(xì)胞N2A的劑量依賴性毒性作用。圖2B DharmaFECT 1脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑對神經(jīng)細(xì)胞N2A的劑量依賴性毒性作用的統(tǒng) 計(jì)學(xué)分析結(jié)果。圖3A半定量PCR法對靶向DHCR24的siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對神經(jīng)細(xì)胞N2A的mDHCR24
表達(dá)量的影響。圖3B半定量PCR法對靶向DHCR24的siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對神經(jīng)細(xì)胞N2A的mDHCR24 表達(dá)量影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果。圖4A靶向DHCR24的四種siRNAs復(fù)合物對脂質(zhì)體試劑DharmaFECT 1轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的 細(xì)胞毒性的保護(hù)作用。圖4B靶向DHCR24的四種siRNAs復(fù)合物對脂質(zhì)體試劑DharmaFECT 1轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的 細(xì)胞毒性的保護(hù)作用的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果。圖5A靶向DHCR24的四種siRNAs復(fù)合物對脂質(zhì)體siPORT Lipid轉(zhuǎn)染產(chǎn)生細(xì)胞毒 性的保護(hù)作用。圖5B靶向DHCR24的四種siRNAs復(fù)合物對脂質(zhì)體siPORT Lipid轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的細(xì)胞 毒性保護(hù)作用的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果。圖5C靶向DHCR24的四種siRNAs復(fù)合物與siPORT Lipid轉(zhuǎn)染試劑聯(lián)合使用情況 下，采用半定量PCR法對轉(zhuǎn)染靶標(biāo)——靴向caveolinl的siRNA高效干擾效果的確認(rèn)
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式 限制本發(fā)明。實(shí)施例一 siRNA的獲得以圖IA所示的mDHCR24序列中下劃線標(biāo)注的四個(gè)mRNA序列，即 5-GCACAGGCATCGAGTCATC-3，5-GCACGGGTTCCAAATGTTA-3，5-GCGCCTGGGTGGTGTTCAA-3，和 5-ACTCAGACCTGTTCTATGC-3為mDHCR24的RNA干擾靶點(diǎn)序列，對應(yīng)每一個(gè)RNA干擾靶點(diǎn)序列 設(shè)計(jì)siRNA，并由Dharmacon公司通過化學(xué)合成方式獲得，得到四種siRNA。實(shí)施例二 siRNAs復(fù)合物與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑DharmaFECT 1的聯(lián)合應(yīng)用
本實(shí)施例，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑采用Dhamacon公司的RNA干擾專用試劑DharmaFECT 1，并使用Dharmacon公司的siGENOME Control si RNA作為RNA干擾的對照，RNAi干擾的 有效性利用半定量PCR方法驗(yàn)證，其細(xì)胞毒性檢測采取位差顯微鏡觀察及細(xì)胞計(jì)數(shù)方法評 價(jià)。采用實(shí)施例1得到的四種siRNA，將四種siRNA組合，形成siRNAs復(fù)合物與脂質(zhì)體 轉(zhuǎn)染試劑DharmaFECT 1聯(lián)合應(yīng)用。(一 )脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑DharmaFECT 1的處理對細(xì)胞產(chǎn)生的毒性。N2A細(xì)胞胰酶消化后按照2. 5xl04/cm2的密度種植到12孔板中，并且用不含抗生素 的培養(yǎng)基培養(yǎng)，24小時(shí)后施行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作嚴(yán)格按照DHARMACON說明書執(zhí) 行，具體如下針對12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的一個(gè)孔而言，準(zhǔn)備100 yl的無血清培養(yǎng)基(tubel) 與分別含有0，0. 5，1或者3 ill脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的100 u 1無血清培養(yǎng)基(tube2)混合，室溫 培養(yǎng)20分鐘后，添加800ul完全培養(yǎng)基后，加入到已經(jīng)移除原培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)孔中。繼 續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，觀察細(xì)胞毒性，并采用MTT方法檢測活細(xì)胞數(shù)。如圖2A所示，脂質(zhì)體轉(zhuǎn) 染導(dǎo)致了貼壁細(xì)胞數(shù)量大量減少。圖2B的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，0. 5，1或者3 yl脂質(zhì)體轉(zhuǎn) 染試劑的轉(zhuǎn)染分別使貼壁細(xì)胞數(shù)量與對照組相比降低到92%，48%以及26%，顯示脂質(zhì)體 轉(zhuǎn)染試劑以一種劑量依賴型的方式誘導(dǎo)了 N2A細(xì)胞的死亡。( 二)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑DharmaFECT 1介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)。具體實(shí)施操作如上步的(一)所示。區(qū)別在于tubel由50 ill的2 ii M的 siRNA (siControl或者siDHCR24)以及50 u 1的無血清培養(yǎng)基組成。而tube2為含有3 u 1 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的100 yl無血清培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染完成后繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，提取總RNA，檢 測siRNA下調(diào)基因表達(dá)情況。(三)RNA干擾后下調(diào)靶基因mDHCR24表達(dá)的檢測。采用試劑盒提取總RNA(RNeasy mini kit，Qiagen)。之后采用逆轉(zhuǎn)錄PCR法，將 總RNA中的mRNA全部反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板，采用特異性的mDHCR4引物，以GAPDH為 內(nèi)參，施行PCR擴(kuò)增。所使用的引物分別如下mDHCR24-anti sense CACAGGCATCGAGTCATCGT ；mDHCR24-sense GGCACGGCATAGAACAGGTC,GAPDH-sense :5~-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3、；GAPDH-antisense 5~-GGGTCTTACTCCTTGGAGGC-3“。結(jié)果如圖3A所示，mDHCR24的siRNAs復(fù)合物組的DHCR24靶序列的條帶亮度明顯 低于對照組，顯示siRNA的轉(zhuǎn)染成功下調(diào)了 mDHCR24基因RNA水平的表達(dá)。圖3B的統(tǒng)計(jì)學(xué) 分析結(jié)果表明，siRNAs復(fù)合物與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的聯(lián)合使用使mDHCR24的mRNA表達(dá)顯著 降低到40%左右，證明了以mDHCR24的RNA干擾靶點(diǎn)序列為靶點(diǎn)獲得的四種siRNA的組合 與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑聯(lián)合應(yīng)用下調(diào)靶基因mDHCR4表達(dá)的有效性。(四)siDHCR24對脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑細(xì)胞毒性保護(hù)作用的觀察及檢測。如圖4A所示，在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染過程中，我們采用位差顯微鏡觀察到，在使用毒性劑 量(3ia/12well)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的情況下，RNA干擾mDHCR4細(xì)胞組中貼壁細(xì)胞數(shù)量與 對照組(使用siControl組)相比，有顯著增加，細(xì)胞培養(yǎng)液中幾乎觀察不到漂浮細(xì)胞。圖 4B的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)顯示，siDHCR24轉(zhuǎn)染使脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞的毒性顯著減低(貼壁細(xì)胞數(shù)由單純脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的26%增加到98% )，幾乎完全消除了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞毒 性作用。這個(gè)結(jié)果證明siDHCR24可以在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染過程中作為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞毒性的保 護(hù)試劑與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑聯(lián)合使用，在不影響轉(zhuǎn)染效率(靶基因DHCR24有效下調(diào))的情況 下，可以顯著提高細(xì)胞的生存率，降低脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞毒性。實(shí)施例三siRNAs復(fù)合物與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑siPORT Lipid的聯(lián)合應(yīng)用采用實(shí)施例1得到的四種siRNA，將四種siRNA組合，形成siRNAs復(fù)合物與脂質(zhì)體 轉(zhuǎn)染試劑siPORT Lipid聯(lián)合應(yīng)用。本實(shí)施例，為了證明siDHCR4在降低脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑細(xì)胞毒性方面的廣泛性，采 用Ambion公司生產(chǎn)的siPORT Lipid作為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，以Ambio公司的細(xì)胞窖蛋白 caveolinl為靶點(diǎn)的siRNA (ID53643)為測試目的siRNA，依據(jù)Ambio公司的轉(zhuǎn)染條件，進(jìn)行 轉(zhuǎn)染。RNAi干擾的有效性利用半定量PCR方法驗(yàn)證，其細(xì)胞毒性檢測采取位差顯微鏡觀察 及細(xì)胞計(jì)數(shù)方法評價(jià)。N2A細(xì)胞胰酶消化后按照2. 5xl04/cm2的密度種植到6孔板中，并且用不含抗生素 的培養(yǎng)基培養(yǎng)，24小時(shí)后施行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作嚴(yán)格按照Ambion說明書執(zhí)行， 具體如下針對12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的一個(gè)孔而言，準(zhǔn)備含有siCaveolin(終濃度為20nM)或 者是Negative controlsiRNA (終濃度為 20nM)的 Opti-MEM I 無血清培養(yǎng)基(tubel) 90 μ 1， 與含有3 μ 1脂質(zhì)體試劑的Opti-MEM無血清培養(yǎng)基(tube2) 10 μ 1混合，室溫培養(yǎng)20分鐘 后，添加400ul0pti-MEM I培養(yǎng)基后，將其加入到已經(jīng)移除原培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)孔中，在二 氧化碳培養(yǎng)箱中37度下，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)最后于轉(zhuǎn)染空中添加2ml完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 48小時(shí)后，觀察細(xì)胞毒性，采用MTT方法檢測活細(xì)胞數(shù)，并收集細(xì)胞總蛋白，采用蛋白免疫 印跡法驗(yàn)證SiCaveolinl下調(diào)caveolinl蛋白的有效性。結(jié)果如圖5A所示，在siDHCR24與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑聯(lián)合應(yīng)用的情況下，N2A貼壁細(xì) 胞數(shù)量在3ul脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染的情況下，比沒有siDHCR24聯(lián)合應(yīng)用組的數(shù)量顯著增 加，圖5B的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)證明siDHCR24與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑聯(lián)合應(yīng)用組的N2A貼壁細(xì)胞數(shù)量 的比例，由無siDHCR24聯(lián)合培養(yǎng)組的36%增加到99%，完全消除了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的細(xì) 胞毒性作用。進(jìn)一步證明siDHCR24可以在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染過程中作為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞毒性的 保護(hù)試劑與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑聯(lián)合使用，在不影響轉(zhuǎn)染效率(靶基因DHCR24有效下調(diào))的 情況下，可以顯著提高細(xì)胞的生存率，降低脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞毒性。圖5C的Western Blotting結(jié)果顯示，在同樣的轉(zhuǎn)染條件下，在siDHCR24與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑聯(lián)合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 組中，Caveolinl的蛋白條帶亮度均比對照組有顯著減弱，進(jìn)一步證明了 siDHCR24的使用 在提高轉(zhuǎn)染細(xì)胞生存率的同時(shí)，并未影響其他siRNA的轉(zhuǎn)染效率。綜上所述，本發(fā)明提供的mDHCR24的RNA干擾靶點(diǎn)序列及根據(jù)上述的mDHCR24的 RNA干擾靶點(diǎn)序列獲得的siRNA，與任何脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的聯(lián)合使用，在保證轉(zhuǎn)染效率的同 時(shí)，都能達(dá)到降低脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染毒性，提高細(xì)胞生存率的效果。實(shí)施例二和實(shí)施例三給出了以mDHCR24的四個(gè)RNA干擾靶點(diǎn)序列獲得的四種 siRNA的組合與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑聯(lián)合使用，在保證轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)，能達(dá)到降低脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 毒性，提高細(xì)胞生存率的效果。當(dāng)然，同樣在轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，以四種siDHCR24的一種或兩種以 上的任意組合與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑聯(lián)合使用，都可以保證轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)，達(dá)到降低脂質(zhì)體 轉(zhuǎn)染毒性，提高細(xì)胞生存率的效果。
權(quán)利要求
mDHCR24的RNA干擾靶點(diǎn)序列5 GCACAGGCATCGAGTCATC 3或5 GCACGGGTTCCAAATGTTA 3或5 GCGCCTGGGTGGTGTTCAA 3或5 ACTCAGACCTGTTCTATGC 3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的mDHCR24的RNA干擾靶點(diǎn)序列獲得的四種siRNA。
3.權(quán)利要求2所述的四種siRNA的一種或兩種以上的組合與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑聯(lián)合使 用，應(yīng)用于制備減毒型脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種mDHCR24干擾靶點(diǎn)序列及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了針對mDHCR24的mRNA序列有效的四個(gè)RNA干擾靶點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)合成得到了4種siRNA，在細(xì)胞水平的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染研究中，將四種siRNA與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑聯(lián)合應(yīng)用，在保證了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率及RNA干擾效率的同時(shí)，有效抑制了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染中產(chǎn)生的細(xì)胞毒性，為其作為抑制脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑細(xì)胞毒性的試劑進(jìn)行商業(yè)用途的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/113GK101942436SQ20101024643
公開日2011年1月12日 申請日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月6日
發(fā)明者侯芳芳, 劉劍利, 劉振青, 曹向宇, 王旭德, 蘆秀麗, 高兵 申請人:遼寧大學(xué)