專利名稱：一種簡(jiǎn)化的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的規(guī)?；苽浞椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種間充質(zhì)干細(xì)胞的規(guī)?；苽浞椒ā?
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)是干細(xì)胞家族的重要成員，來(lái)源于 發(fā)育早期的中胚層和外胚層。MSC最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，因其具有多向分化潛能、造血支持和 促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)而日益受到人們的關(guān)注。如間充質(zhì)干細(xì)胞在 體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、 內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種 子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用于解決多種血液系統(tǒng)疾病，糖尿病及糖尿病足，心血管疾 病，肝硬化，脊髓損傷，帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病，膝關(guān)節(jié)半月板部分切除損傷修復(fù)，自身免 疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了許多病患的生命。間充質(zhì)干細(xì)胞廣泛分布于胎兒和成體的骨髓、骨膜、松骨質(zhì)、脂肪、滑膜、骨骼肌、 胎肝、乳牙、臍帶、臍帶血中，其中臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞質(zhì)量高、純凈、數(shù)量多。臍帶來(lái) 源的間充質(zhì)干細(xì)胞不但能夠成為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的理想替代物，而且具有更大的應(yīng)用潛 能。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)多種胚胎干細(xì)胞的特有分子標(biāo)志，具有分化潛力大、增殖 能力強(qiáng)、免疫原性低、取材方便、無(wú)道德倫理問(wèn)題的限制等特征，因此有可能成為最具臨床 應(yīng)用前景的多能干細(xì)胞。但臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離提取過(guò)程繁瑣且提取效率低，間充質(zhì) 干細(xì)胞的規(guī)?；苽涑闪似鋸V泛應(yīng)用的瓶頸。目前間充質(zhì)干細(xì)胞制備多采用酶消化法和組織貼壁法來(lái)制備。酶消化法提取臍帶 間充質(zhì)干細(xì)胞是將臍帶組織剪成碎塊后，用胰蛋白酶和膠原酶消化1-2小時(shí)，用含胎牛血 清的培養(yǎng)基終止酶消化，然后洗滌細(xì)胞棄去消化酶，洗滌后的細(xì)胞接種至培養(yǎng)器皿中進(jìn)行 培養(yǎng)擴(kuò)增。洗滌細(xì)胞需時(shí)約1小時(shí)，且洗滌過(guò)程中對(duì)細(xì)胞損傷較重，操作步驟繁瑣，易污染， 消化酶對(duì)細(xì)胞損傷亦較重，最終導(dǎo)致獲得的細(xì)胞活力低、增殖慢。組織貼壁法是目前應(yīng)用比 較廣泛的一種方法，傳統(tǒng)的組織貼壁法是將臍帶組織剪碎，要求組織剪碎程度很高，要剪至 肉糜狀，剪切時(shí)間在30min以上，耗時(shí)費(fèi)力；離心洗去組織液后接種培養(yǎng)，間充質(zhì)干細(xì)胞貼 壁生長(zhǎng)較慢，多需要10-14天。酶消化法制備間充質(zhì)干細(xì)胞耗時(shí)長(zhǎng)，操作過(guò)程中對(duì)細(xì)胞損傷較大，使得分離得到 的間充質(zhì)干細(xì)胞活力低、增殖慢。組織貼壁法要求臍帶組織剪碎程度很高，操作費(fèi)力，且細(xì) 胞貼壁慢，生長(zhǎng)慢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人針對(duì)上述缺點(diǎn)，廣泛查閱大量國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，在現(xiàn)有間充質(zhì)干細(xì)胞制備技 術(shù)的基礎(chǔ)上，改進(jìn)組織貼壁法制備技術(shù)，使組織塊剪切過(guò)程不再費(fèi)力，且在培養(yǎng)液中添加
3bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)，可以加快細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)，就使得整個(gè)原代培養(yǎng)時(shí)間 由原來(lái)的10-14天大為縮短。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案本發(fā)明提供一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟 1)新鮮臍帶，用PBS緩沖液沖洗；所述PBS緩沖液含100kU/L青霉素及100mg/L鏈
毒素；2)剪取6-8cm長(zhǎng)臍帶，將臍帶剪成2cm長(zhǎng)的小段，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗；所述PBS 緩沖液含100kU/L青霉素及100mg/L鏈霉素；3)將臍帶組織塊剪碎成2_3mm3小塊；4)將剪碎組織加入L-DMEM培養(yǎng)基洗滌，在650g條件下離心5分鐘，棄上清；5)將組織塊和培養(yǎng)基按體積比2. 5-3 1比例加入培養(yǎng)基，混勻組織塊，接種 至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)；所述的培養(yǎng)基為含Ι-lOng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (bFGF)及體積百分比10% -15%胎牛血清(FBS)的L-DMEM培養(yǎng)基；6)24小時(shí)后補(bǔ)加步驟5所述的培養(yǎng)基。7)每3天換一次培養(yǎng)基，第6天后換含體積比10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基，至 8-9天細(xì)胞達(dá)80%左右融合時(shí)傳代；傳代培養(yǎng)基為含體積比10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng) 基；8)以后每3天傳代一次。


圖1 人臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)(A-C)是采用本發(fā)明的方法獲得的 間充質(zhì)干細(xì)胞原代第4、5、7天的細(xì)胞形態(tài)；(D-F)是間充質(zhì)干細(xì)胞第一代第1、2、3天后的 細(xì)胞形態(tài)；(G)是間充質(zhì)干細(xì)胞第二代第3天的細(xì)胞形態(tài)；(H-J)是間充質(zhì)干細(xì)胞第三代第 1、2、3天的細(xì)胞形態(tài)。圖2 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖3 流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞表型分析技術(shù)效果1、臍帶沖洗徹底，沖洗液中含有抗生素，可以最大量洗去污物和殘存血，避免污
^fe ο2、臍帶剪切塊較大，剪切省時(shí)省力。在此情況下仍能大量的縮短原代培養(yǎng)時(shí)間。3、確定了混勻組織塊時(shí)添加培養(yǎng)基的最佳比例，避免了培養(yǎng)基不足或多余對(duì)細(xì)胞 培養(yǎng)的影響。4、培養(yǎng)基為含bFGF(濃度l-lOng/ml)及10 % -15 % FBS的新鮮完全培養(yǎng)基 L-DMEM。添加的低濃度bFGF既促進(jìn)了間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，又不影響干細(xì)胞的分化能 力。5、第6天后換培養(yǎng)基為(L-DMEM+FBS)，至8_9天細(xì)胞達(dá)80%左右融合時(shí)傳代，細(xì) 胞生長(zhǎng)快，傳代時(shí)間短。具本實(shí)施方式1.新鮮臍帶，經(jīng)過(guò)病毒檢測(cè)合格后，用含100kU/L青霉素及100mg/L鏈霉素的PBS緩沖液((pH7. 2 7. 4)，含 NaCl 137mmol/L, KCl 2. 7mmol/L, Na2HPO4 4. 3mmol/L, KH2PO4 1. 4mmol/)洗去污物及血液。2.剪取大約6-8cm臍帶，將臍帶剪成2cm左右的小段，用含100kU/L青霉素及 100mg/L鏈霉素的PBS緩沖液盡量沖去臍靜脈及動(dòng)脈內(nèi)的殘存血。3.用臍帶剪將臍帶組織塊剪碎成2_3mm3小塊。4.將剪碎組織加入L-DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，USA)洗滌，在650g條件下離心5 分鐘，棄上清。5.按照2. 5-3 1比例(組織塊培養(yǎng)基，體積比)加入培養(yǎng)基 (L-DMEM+FBS+bFGF)(即，含 1-lOng/ml bFGF 及體積百分比 10% -15% FBS 的 L-DMEM 培養(yǎng) 基)混勻組織塊，接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置37°C、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。所述FBS 為胎牛血清，bFGF為堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。6. 24小時(shí)后補(bǔ)加步驟5所述的培養(yǎng)基。7.每3天換一次培養(yǎng)基，5-6天組織塊周?chē)?jiàn)梭形細(xì)胞爬出。第6天后換培養(yǎng)基為 (L-DMEM+體積比10% FBS)，至8_9天細(xì)胞達(dá)80%左右融合時(shí)傳代；傳代培養(yǎng)基為L(zhǎng)-DMEM+ 體積比10% FBS08.以后每3天傳代一次，至第三代鑒定。各階段的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)狀況、細(xì)胞表型分析見(jiàn)圖1、圖2、圖3。對(duì) 照實(shí)驗(yàn)(常規(guī)組織塊貼壁法)1.取臍帶，無(wú)菌生理鹽水沖洗去污物及血液；2.無(wú)菌手工剪臍帶至l_2mm3大小。3.將組織塊轉(zhuǎn)移入50ml的離心管中，加入含青鏈霉素的PBS緩沖液40ml，室 溫在250g條件下離心5分鐘，棄上清。4.所獲組織塊用含體積比10%的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3天換一次培養(yǎng)。5. 7天左右組織塊周?chē)兴笮渭岸嘟切渭?xì)胞爬出，10-14天左右細(xì)胞才達(dá)80%左 右融合，用0. 25%胰酶消化傳代。實(shí)驗(yàn)結(jié)果本發(fā)明的方法，臍帶沖洗液中含有抗生素，可以最大量洗去污物和殘存 血，避免了污染；臍帶剪切塊雖較大，但仍能大量的縮短原代培養(yǎng)時(shí)間；確定了混勻組織塊 時(shí)添加培養(yǎng)基的最佳比例，培養(yǎng)基為含bFGF(濃度Ι-lOng/ml)及10% -15% FBS的新鮮完 全培養(yǎng)基L-DMEM，既促進(jìn)了間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，又不影響干細(xì)胞的分化能力，至8-9天 細(xì)胞即達(dá)80%左右融合，細(xì)胞生長(zhǎng)快，傳代時(shí)間短。
權(quán)利要求
一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)新鮮臍帶，用PBS緩沖液沖洗；2)剪取6 8cm長(zhǎng)臍帶，將臍帶剪成2cm長(zhǎng)的小段，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗；3)將臍帶組織塊剪碎成2 3mm3小塊；4)將剪碎組織加入L DMEM培養(yǎng)基洗滌，在650g條件下離心5分鐘，棄上清；5)將組織塊和培養(yǎng)基按體積比2.5 3∶1比例加入培養(yǎng)基，混勻組織塊，接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)；所述的培養(yǎng)基為含1 10ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子及體積百分比10％ 15％胎牛血清的L DMEM培養(yǎng)基；6)24小時(shí)后補(bǔ)加步驟5所述的培養(yǎng)基；7)每3天換一次培養(yǎng)基，第6天后換含體積比10％胎牛血清的L DMEM培養(yǎng)基，至8 9天細(xì)胞達(dá)80％左右融合時(shí)傳代；傳代培養(yǎng)基為含體積比10％胎牛血清的L DMEM培養(yǎng)基；8)以后每3天傳代一次。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述PBS緩沖液含100kU/L青霉素及IOOmg/L鏈毒素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的規(guī)模化制備方法。在該方法中，臍帶剪切塊雖較大，但仍能大量的縮短原代培養(yǎng)時(shí)間。培養(yǎng)基含bFGF及FBS，既促進(jìn)了間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，又不影響干細(xì)胞的分化能力，至8-9天細(xì)胞即達(dá)80％左右融合，細(xì)胞生長(zhǎng)快，傳代時(shí)間短。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK101914496SQ201010246359
公開(kāi)日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月6日
發(fā)明者張學(xué)峰, 張美榮, 王麗, 胡建霞, 高宏, 魏斯溧 申請(qǐng)人:青島奧克生物開(kāi)發(fā)有限公司