本發(fā)明涉及凍存液技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及一種間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液。
背景技術(shù):
目前干細(xì)胞凍存液的使用方法為:在細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到一定密度后,需要冷凍保存在液氮中保持細(xì)胞的活性,在日后的使用復(fù)蘇后能夠正常的培養(yǎng),因此在凍存時需要添加一定比例的凍存液在凍存時保持細(xì)胞的完整和對細(xì)胞的傷害降至最低。
現(xiàn)有技術(shù)中的細(xì)胞凍存液往往由胎牛血清與二甲基亞砜按體積比為9:1混合得到,由于使用動物源的胎牛血清,導(dǎo)致細(xì)胞凍存液中摻入非人源物質(zhì),造成殘留或者污染,而且現(xiàn)有的細(xì)胞凍存液在干細(xì)胞后續(xù)復(fù)蘇培養(yǎng)過程中干細(xì)胞的貼壁率為80%左右,死細(xì)胞較多,獲得的最終細(xì)胞數(shù)為1.2×107/瓶左右,成本也較高。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
基于背景技術(shù)存在的技術(shù)問題,本發(fā)明提出了一種間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液,更適合間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存,間充質(zhì)干細(xì)胞重新復(fù)蘇后貼壁率達(dá)到90%以上,死細(xì)胞較少,培養(yǎng)7天后收獲得到的細(xì)胞數(shù)為2×107/瓶,大大提高了細(xì)胞的數(shù)量;同時檢測細(xì)胞表型時,CD44+達(dá)到99%以上,CD105+達(dá)到99%以上。
本發(fā)明提出的一種間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液,其原料按體積百分比包括:1640培養(yǎng)液65.5~75.4%,二甲基亞砜9.8~10.1%,人血白蛋白9.8~11.2%,羥乙基淀粉9.9~10.8%,成纖維細(xì)胞生長因子0.5~1.5%。
具體實施方式中,1640培養(yǎng)液的體積百分比可以為65.5%、66%、66.5%、 67%、67.5%、68%、68.5%、69%、69.5%、70%、70.5%、71%、71.5%、72%、72.5%、73%、73.5%、74%、74.5%、75%、75.4%,二甲基亞砜的體積百分比可以為9.8%、9.9%、10.0%、10.1%,人血白蛋白的體積百分比可以為9.8%、9.9%、10%、10.1%、10.2%、10.3%、10.4%、10.5%、10.6%、10.7%、10.8%、10.9%、11%、11.1%、11.2%,羥乙基淀粉的體積百分比可以為9.9%、10%、10.1%、10.2%、10.3%、10.4%、10.5%、10.6%、10.7%、10.8%,成纖維細(xì)胞生長因子的體積百分比可以為0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%。
優(yōu)選地,其原料按體積百分比包括:1640培養(yǎng)液68~72%,二甲基亞砜9.9~10.0%,人血白蛋白10~11%,羥乙基淀粉10.0~10.2%,成纖維細(xì)胞生長因子0.8~1.2%。
優(yōu)選地,人血白蛋白、羥乙基淀粉、成纖維細(xì)胞生長因子的重體積比為10.2:10:1.1。
優(yōu)選地,人血白蛋白、羥乙基淀粉、成纖維細(xì)胞生長因子的重體積比為10.8:10.1:1。
優(yōu)選地,人血白蛋白、羥乙基淀粉、成纖維細(xì)胞生長因子的重體積比為10.5:10.2:0.9。
優(yōu)選地,其原料按體積百分比包括:1640培養(yǎng)液69%,二甲基亞砜10%,人血白蛋白10%,羥乙基淀粉10%,成纖維細(xì)胞生長因子1%。
本發(fā)明采用1640培養(yǎng)液、人血白蛋白、羥乙基淀粉、成纖維細(xì)胞生長因子相互配合,能滋養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞,促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞處于半休眠狀態(tài),使間充質(zhì)干細(xì)胞的能量消耗維持在較低的水平,促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞在液氮中保持細(xì)胞的活性,使之復(fù)蘇后能夠進(jìn)行正常的培養(yǎng);其中1640培養(yǎng)液、人血白蛋白、羥 乙基淀粉為凍存間充質(zhì)干細(xì)胞提供營養(yǎng)成分,而人血白蛋白、羥乙基淀粉和二甲基亞砜相互配合能降低細(xì)胞內(nèi)水熔點,維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡,成纖維細(xì)胞生長因子能使間充質(zhì)干細(xì)胞在凍存期間進(jìn)行緩慢修復(fù),維持細(xì)胞活性。綜上所述,本發(fā)明相比于現(xiàn)有技術(shù)中的凍存液更適合間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存。
使用本發(fā)明進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存,當(dāng)間充質(zhì)干細(xì)胞重新復(fù)蘇后貼壁率達(dá)到90%以上,死細(xì)胞較少,培養(yǎng)7天后收獲得到的細(xì)胞數(shù)為2×107/瓶,大大提高了細(xì)胞的數(shù)量;同時檢測細(xì)胞表型時,CD44+達(dá)到99%以上,CD105+達(dá)到99%以上。
附圖說明
圖1為本發(fā)明實施例5所得間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液與現(xiàn)有凍存液進(jìn)行細(xì)胞凍存、復(fù)蘇,復(fù)蘇干細(xì)胞貼壁率對比圖。
圖2為本發(fā)明實施例5所得間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液與現(xiàn)有凍存液進(jìn)行細(xì)胞凍存、復(fù)蘇,復(fù)蘇干細(xì)胞活性對比圖。
圖3為本發(fā)明實施例5所得間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液與現(xiàn)有凍存液進(jìn)行細(xì)胞凍存、復(fù)蘇,復(fù)蘇干細(xì)胞表型檢測圖。
具體實施方式
下面,通過具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。
實施例1
本發(fā)明提出的一種間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液,其原料按體積百分比包括:1640培養(yǎng)液67.6%,二甲基亞砜9.8%,人血白蛋白11.2%,羥乙基淀粉9.9%,成纖維細(xì)胞生長因子1.5%。
實施例2
本發(fā)明提出的一種間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液,其原料按體積百分比包括:1640 培養(yǎng)液68.8%,二甲基亞砜10.1%,人血白蛋白9.8%,羥乙基淀粉10.8%,成纖維細(xì)胞生長因子0.5%。
實施例3
本發(fā)明提出的一種間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液,其原料按體積百分比包括:1640培養(yǎng)液67.9%,二甲基亞砜9.9%,人血白蛋白11%,羥乙基淀粉10%,成纖維細(xì)胞生長因子1.2%。
實施例4
本發(fā)明提出的一種間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液,其原料按體積百分比包括:1640培養(yǎng)液69%,二甲基亞砜10%,人血白蛋白10%,羥乙基淀粉10.2%,成纖維細(xì)胞生長因子0.8%。
實施例5
本發(fā)明提出的一種間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液,其原料按體積百分比包括:1640培養(yǎng)液69%,二甲基亞砜10%,人血白蛋白10%,羥乙基淀粉10%,成纖維細(xì)胞生長因子1%。
將實施例5所得間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液進(jìn)行細(xì)胞凍存并對復(fù)蘇細(xì)胞進(jìn)行檢測,具體操作如下:
1、將實施例5所得間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液加至干細(xì)胞重懸后,保存在凍存管中,5×106/管,程序降溫的方式凍存,24h后轉(zhuǎn)移到液氮管中保存;
2、取出一根含凍存細(xì)胞的凍存管,37℃水浴復(fù)溶后,加到培養(yǎng)瓶中,再加入30mL干細(xì)胞專用培養(yǎng)基,放置37°CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);
3、第2日更換培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液,觀察細(xì)胞貼壁情況;
4、第4日傳代,檢測細(xì)胞數(shù)及活性;
5、第7日收獲貼壁細(xì)胞,檢測細(xì)胞數(shù)及活性,以及干細(xì)胞表型。
其結(jié)果如圖1-3所示,圖1為復(fù)蘇干細(xì)胞貼壁率對比圖,圖2為復(fù)蘇干細(xì)胞活性對比圖,圖3為復(fù)蘇干細(xì)胞表型檢測圖。由圖1和圖2可知:采用本發(fā)明實施例5所得間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液進(jìn)行凍存、復(fù)蘇后,細(xì)胞的活性和貼壁率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于現(xiàn)有的凍存液,其貼壁率和活性均可達(dá)到90%以上;而由圖3可知:采用本發(fā)明實施例5所得間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液進(jìn)行凍存、復(fù)蘇后,細(xì)胞表型中CD44+達(dá)到99%以上,CD105+達(dá)到99%以上。
以上所述,僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式,但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此,任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi),根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變,都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。