本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)、實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)、再生醫(yī)學(xué)與病毒學(xué)領(lǐng)域，具體地說，是一種構(gòu)建人源化鼠模型并用于病毒性肝炎等人類疾病研究的新方法。

背景技術(shù)：

嗜肝病毒(甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等)，流行范圍廣，每年上百萬人死于病毒性肝炎所致肝衰竭、肝硬化和肝細(xì)胞癌。嗜肝病毒只能在高級(jí)靈長(zhǎng)類動(dòng)物中致病，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统Ｐ枋褂迷澈镱悇?dòng)物，猿猴類實(shí)驗(yàn)成本高，操作復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，因此，建立能感染嗜肝病毒并致病的小動(dòng)物模型有很大的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。但由于小動(dòng)物無法感染嗜肝病毒，因此嗜肝病毒小動(dòng)物研究模型建立困難，嚴(yán)重阻礙了病毒性肝炎機(jī)制、進(jìn)展、轉(zhuǎn)歸研究，并很大程度上限制了治療方案的優(yōu)化。建立人源化鼠模型將為研究病毒性肝炎及其治療與疾病轉(zhuǎn)歸提供良好的研究載體。干細(xì)胞(包括人胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞等)具有潛在分化能力，可以分化成多種功能細(xì)胞，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hbmsc)能嵌合暴發(fā)性肝功能衰竭豬，這為我們將干細(xì)胞移植到肝損傷的鼠肝內(nèi)，建立新型人源化鼠模型奠定了基礎(chǔ)。此人源化鼠對(duì)闡明嗜肝性病毒生物學(xué)特性、肝炎發(fā)病機(jī)制、疾病轉(zhuǎn)歸、研發(fā)和篩選抗嗜肝性病毒新藥等提供保障。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明正是針對(duì)現(xiàn)有嗜肝性病毒研究模型的缺陷，提供了一種利用人干細(xì)胞構(gòu)建人源化鼠模型的技術(shù)，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明公開了一種利用干細(xì)胞構(gòu)建人源化鼠模型的方法，步驟如下：

1)、獲取人干細(xì)胞；

2)、將干細(xì)胞移植入肝損傷的鼠；

3)、hbv感染人源化鼠。

作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述的干細(xì)胞是分離培養(yǎng)的人干細(xì)胞，或是商品化的分離或凍存的人干細(xì)胞或細(xì)胞系。

作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述的分離培養(yǎng)的人干細(xì)胞的獲取步驟如下：

a、獲得純化人干細(xì)胞；

b、干細(xì)胞培養(yǎng)，傳代；

c、培養(yǎng)于20℃-40℃，2％-10％co2的培養(yǎng)箱中。

作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述的步驟2)的具體步驟如下：

e、獲得不同品系的實(shí)驗(yàn)鼠；

f、通過予以肝損藥物，或予以外科部分肝切除術(shù)，建立肝損傷鼠模型；

g、移植1×10^4-8人干細(xì)胞進(jìn)入鼠模型。

作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述的步驟g后還包括步驟h：分次予以肝損藥物。

作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述的實(shí)驗(yàn)鼠是正常小鼠或免疫缺陷小鼠或正常大鼠或免疫缺陷大鼠，肝損傷包括急性、慢性肝損傷，急性、亞急性、慢性肝衰竭中的任意一種。

作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述的步驟f中是予以肝損藥物是通過腹腔、肌肉、外周靜脈注射、口服或灌胃的方式。

作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述的步驟g是通過外周靜脈、門靜脈、脾臟或肝臟注射的方式移植1×10^4-8人干細(xì)胞。

作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述的步驟3)是通過外周靜脈、皮下、肌肉或腹腔對(duì)每只鼠注射各型嗜肝性病毒。

作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述的步驟3)后還包括4)在感染鼠后的3-30天內(nèi)檢測(cè)病毒載量一次，確認(rèn)模型建立成功；或在感染鼠后的3-30天內(nèi)檢測(cè)病毒載量一次后，再分次檢測(cè)病毒載量，確認(rèn)模型建立成功。

與現(xiàn)有構(gòu)建人源化鼠模型技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：

為闡明嗜肝病毒生物學(xué)特性、病毒性發(fā)病的具體機(jī)制，本發(fā)明從生化指標(biāo)、免疫組織化學(xué)，基因表達(dá)水平，蛋白組學(xué)等多個(gè)方面進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)通過誘導(dǎo)嚴(yán)重肝損害并移植人干細(xì)胞，鼠肝內(nèi)人來源肝細(xì)胞有50-95％的高嵌合率，鼠脾臟、血液、肝臟、骨髓等器官內(nèi)可持續(xù)分離到人源性免疫細(xì)胞，形成人源化肝臟和免疫細(xì)胞的鼠模型。再將各類嗜肝病毒感染上述人源化鼠，形成嗜肝病毒感染的人源化鼠模型。該模型能研究嗜肝病毒的整個(gè)生命周期，及嗜肝病毒感染后與轉(zhuǎn)分化形成的人源化免疫系統(tǒng)之間的免疫應(yīng)答反應(yīng)。在人源化鼠感染嗜肝病毒后10周至50周，先后出現(xiàn)肝損傷、慢性乙型肝炎、肝纖維化和肝硬化，最后逐漸出現(xiàn)肝細(xì)胞癌。符合人感染嗜肝病毒的自然史，及病毒性肝炎的發(fā)展轉(zhuǎn)歸。除能用于研究嗜肝病毒的生物學(xué)特性、病毒性肝炎發(fā)病機(jī)制、研發(fā)和篩選抗嗜肝病毒新藥之外，還能獲得更符合人類疾病發(fā)展史的肝硬化、肝細(xì)胞癌等模型。

該構(gòu)建人源化鼠模型技術(shù)除了用于構(gòu)建研究嗜肝病毒感染的模型外，該技術(shù)方案的思路還可用于構(gòu)建其他人源化器官的模型。該技術(shù)方案為臨床上肝疾病治療研究提供了方便、簡(jiǎn)單、易得的人源化模型。

附圖說明

圖1為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞人源化frgs小鼠(hbmsc-frgs小鼠)模型構(gòu)建示意圖；

圖2為胚胎干細(xì)胞人源化upas小鼠(es-upas小鼠)模型構(gòu)建示意圖；

圖3為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞人源化半乳糖胺正常小鼠(ips-正常小鼠)模型構(gòu)建示意圖；

圖4為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞人源化正常大鼠模型構(gòu)建圖；

圖5為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞人源化正常大鼠模型構(gòu)建圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開了一種利用人干細(xì)胞構(gòu)建人源化鼠模型的方法并公開了一類利用該方法構(gòu)建研究病毒性肝炎的人源化鼠模型，下面對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步地說明：

一、獲取人干細(xì)胞

1、分離培養(yǎng)人干細(xì)胞

1)獲得純化人干細(xì)胞。

2)干細(xì)胞培養(yǎng)，傳代。

3)培養(yǎng)于20℃-40℃，2％-10％co2的培養(yǎng)箱中。

2、獲取商品化的分離或凍存的人干細(xì)胞或細(xì)胞系。

二、干細(xì)胞移植入肝損傷的鼠

1、獲得不同品系的實(shí)驗(yàn)鼠，實(shí)驗(yàn)鼠包括正常小鼠、免疫缺陷小鼠、正常大鼠和免疫缺陷大鼠。

2、通過腹腔、肌肉、外周靜脈注射、口服或灌胃的方式予以肝損藥物，或予以外科部分肝切除術(shù)，建立肝損傷鼠模型。

3、通過外周靜脈、門靜脈、脾臟或肝臟注射的方式移植1×10^4-8干細(xì)胞。

三、hbv感染人源化小鼠

通過外周靜脈、皮下、肌肉或腹腔每只鼠注射各型嗜肝性病毒。

下面根據(jù)附圖，通過具體實(shí)施例及對(duì)比例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步地說明：本發(fā)明通過多種不同人來源干細(xì)胞注入肝損傷鼠獲得不同人源化鼠模型，來研究嗜肝性病毒感染機(jī)制及嗜肝性病毒感染的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制、轉(zhuǎn)歸及治療。

實(shí)施例1：圖1為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞人源化frgs小鼠模型構(gòu)建示意圖，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hbmscs)移植暴發(fā)性肝衰竭frgs小鼠建立骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞人源化frgs小鼠模型。

1、用含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞hbmscs。

2、frgs小鼠逐漸將藥物2-(2-硝基-4-三氟甲基芐基)-環(huán)己烷-1，3-二酮(ntbc)減量，注射0.2mg/kg抗fas抗體(jo2)，建立肝衰竭小鼠模型。

3、通過門靜脈注射500ul1×10⁶hbmscs。

4、移植后2、5、8天持續(xù)jo2注射。

5、通過尾靜脈每只小鼠注射a、b、c、d型1*10⁶乙肝病毒。

6、在注射乙肝病毒后的1周、2周、4周，后續(xù)每4周分別檢測(cè)乙肝病毒載量和肝功能狀態(tài)，確認(rèn)模型建立成功。

圖1運(yùn)用frgs小鼠，首先運(yùn)用化學(xué)藥物ntbc建立暴發(fā)性肝衰竭，再運(yùn)用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植，分化形成肝細(xì)胞，最后注射乙肝病毒，構(gòu)建人源化慢性乙型肝炎小鼠模型。

實(shí)施例2：圖2為胚胎干細(xì)胞人源化upa小鼠模型構(gòu)建示意圖，人胚胎干細(xì)胞系移植純合upa小鼠建立胚胎干細(xì)胞人源化upa小鼠模型。

1、用含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞。

2、獲得純合upa/scid小鼠模型。

3、出生8周時(shí)通過脾注射500ul1×10⁶人胚胎干細(xì)胞。

4、通過尾靜脈每只小鼠注射1*10⁷丙型肝炎病毒。

5、在注射丙肝病毒后的1周、2周、4周，后續(xù)每4周分別檢測(cè)病毒載量和肝功能狀態(tài)，確認(rèn)模型建立成功。

圖2運(yùn)用upa小鼠，upa會(huì)自發(fā)形成肝損害，再運(yùn)用人胚胎干細(xì)胞移植，分化形成肝細(xì)胞，最后注射丙肝病毒，構(gòu)建人源化慢性丙型肝炎小鼠模型。

實(shí)施例3，圖3為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞人源化半乳糖胺正常小鼠模型構(gòu)建示意圖，人誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(hipscs)注射正常免疫的暴發(fā)性肝衰竭小鼠建立誘導(dǎo)多能干細(xì)胞人源化正常小鼠模型。

1、通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將某些轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入動(dòng)物或人的體細(xì)胞，使體細(xì)胞直接重構(gòu)成多功能干細(xì)胞，用含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2、每只小鼠腹腔注射半乳糖胺1.5g/kg，建立肝衰竭小鼠模型。

3、通過肝臟注射500ul1×10⁶人誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞。

4、通過尾靜脈每只小鼠注射1*10⁵戊型肝炎病毒。

5、在注射戊肝病毒后的1周、2周、4周，后續(xù)每4周分別檢測(cè)病毒載量和肝功能狀態(tài)，確認(rèn)模型建立成功。

圖3運(yùn)用小鼠，首先運(yùn)用化學(xué)藥物半乳糖胺建立暴發(fā)性肝衰竭，再運(yùn)用誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞移植，分化形成肝細(xì)胞，最后注射戊型肝炎病毒，構(gòu)建人源化慢性戊型肝炎小鼠模型。

實(shí)施例4：圖4為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞人源化正常大鼠模型構(gòu)建示意圖，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hbmscs)注射急性肝損傷正常大鼠建立骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞人源化正常大鼠模型。

1、正常人骨髓用淋巴細(xì)胞分離液分離純化人骨髓單核細(xì)胞，用含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞hbmscs。

2、正常大鼠行50％肝切除術(shù)，建立急性肝損傷大鼠模型。

3、通過門靜脈注射500ul1×10⁶hbmscs。

4、通過尾靜脈每只小鼠注射a、b、c、d型1*10⁶乙肝病毒。

6、在注射乙肝病毒后的1周、2周、4周，后續(xù)每4周分別檢測(cè)病毒載量和肝功能狀態(tài)，確認(rèn)模型建立成功。

圖4運(yùn)用正常小鼠，首先運(yùn)用外科50％肝臟切除建立急性肝損傷，再運(yùn)用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植，分化形成肝細(xì)胞，最后注射乙肝病毒，構(gòu)建人源化慢性乙型肝炎大鼠模型。

實(shí)施例5：圖5為人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞人源化正常大鼠模型構(gòu)建示意圖，人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(hadscs)注射肝損傷正常大鼠建立脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞人源化正常大鼠模型。

1、正常人脂肪組織分離純化人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，用含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞hbmscs。

2、正常大鼠通過腹腔注射四氯化碳0.5ml/100g，建立急性肝損傷大鼠模型。

3、通過脾臟注射1000ul5×10⁶hadscs。

4、每只小鼠腹腔注射1*10⁶丙型肝炎病毒。

5、在注射丙型肝炎病毒后的1周、2周、4周，后續(xù)每4周分別檢測(cè)病毒載量和肝功能狀態(tài)，確認(rèn)模型建立成功。

圖5運(yùn)用正常小鼠，首先運(yùn)用化學(xué)藥物四氯化碳建立急性肝損傷，再運(yùn)用人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植，分化形成肝細(xì)胞，最后注射丙肝病毒，構(gòu)建人源化慢性丙型肝炎大鼠模型。

以上例舉的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明并不限于以上實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神和構(gòu)思的前提下直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的其他改進(jìn)和變化，均應(yīng)認(rèn)為包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。