專利名稱：骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，是從骨髓中制備一種骨髓胚胎源性多 能干細(xì)胞的方法及其依據(jù)該方法制得的細(xì)胞。
背景技術(shù)：
細(xì)胞移植和組織工程是近幾年生物醫(yī)學(xué)工程和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。胚 胎干細(xì)胞由于全能分化性和持續(xù)增殖的能力成為該領(lǐng)域研究的重點(diǎn)，然而倫 理學(xué)和免疫原性等問(wèn)題制約了其在臨床的應(yīng)用，這是細(xì)胞移植和組織工程不 能獲得重大突破的關(guān)鍵，尋找新的細(xì)胞來(lái)源是當(dāng)務(wù)之急。Verfaillie研究組2001年通過(guò)優(yōu)化體外培養(yǎng)條件，采用免疫磁珠分選技 術(shù)由成年動(dòng)物骨髓中分離得到了一種比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSC)更加原始的早期細(xì)胞群，命名為成體多能祖細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)發(fā) 現(xiàn)該細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖擴(kuò)增能力，即使超過(guò)80倍的細(xì)胞倍增，也不出現(xiàn) 增殖衰老現(xiàn)象，最長(zhǎng)培養(yǎng)達(dá)到120代，而且在培養(yǎng)過(guò)程中，成體多能祖細(xì)胞 仍保持長(zhǎng)的端粒，不隨著培養(yǎng)時(shí)間增加而縮短。40代時(shí)成體多能祖細(xì)胞的平 均端粒長(zhǎng)度為27 kb，而102代時(shí)檢測(cè)成體多能祖細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度沒(méi)有任何 改變。成體多能祖細(xì)胞另一個(gè)重要特征在于其多向分化能力，不僅可以誘導(dǎo) 分化成為間充質(zhì)來(lái)源細(xì)胞(骨、軟骨、脂肪、肌組織)；也可以誘導(dǎo)分化為有 神經(jīng)外胚層表型和功能的細(xì)胞；而且在體外可以誘導(dǎo)成為具有功能特征的血 管內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞。目前成體多能祖細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的細(xì)胞類型已經(jīng)包 括了內(nèi)、夕卜、中胚三個(gè)胚層來(lái)源的細(xì)胞。尤其是將成體多能祖細(xì)胞導(dǎo)入早期 的胚囊中，可以發(fā)育成絕大多數(shù)組織細(xì)胞類型，進(jìn)一步證明了成體多能祖細(xì) 胞具有比MSC更強(qiáng)的多向分化潛能，更強(qiáng)大的增殖擴(kuò)增能力。這種具有高 度多向分化性的亞全能干細(xì)胞為我們的研究提供了新的思路，也為組織工程 尋找新的種子細(xì)胞帶來(lái)了希望。該種細(xì)胞逐漸引起了人們的重視。但是很多 學(xué)者對(duì)這種說(shuō)法產(chǎn)生了質(zhì)疑，認(rèn)為成體多能祖細(xì)胞還是一群混合的細(xì)胞，沒(méi) 有完全純化，或者是從不同的角度進(jìn)行研究得到的己知骨髓源干細(xì)胞。 2004年P(guān)ochampally RR等在不含細(xì)胞因子的無(wú)血清培養(yǎng)基中培育早期 人MSC2-4周。發(fā)現(xiàn)一個(gè)細(xì)胞亞群能夠在無(wú)血清環(huán)境中存活，而且具有更長(zhǎng) 的端粒；RT-PCR分析表明，該細(xì)胞亞群是一個(gè)早期祖細(xì)胞亞群，增強(qiáng)表達(dá) Oct-4和其它胚胎細(xì)胞特異表達(dá)的基因。2005年Yoon YS等在成人骨髓中發(fā) 現(xiàn)一種干細(xì)胞亞群，具有自更新能力，擴(kuò)增140代以后仍不損失多能性，能 分化成所有三胚層細(xì)胞。根據(jù)表面標(biāo)志表達(dá)，這些克隆擴(kuò)增的細(xì)胞不屬于任 何先前所知的骨髓來(lái)源干細(xì)胞群，命名為人骨髓來(lái)源多能干細(xì)胞(human bone marrow stem cells, hBMSCs)。心肌梗塞后于心肌內(nèi)移植hBMSCs，結(jié) 果移植的細(xì)胞大量嫁接，局部標(biāo)志心肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞特征， 與hBMSCs體內(nèi)多線系分化相一致。心肌梗塞后移植hBMSCs的有益效果， 可能緣自于宿主心肌組織增殖和保存增強(qiáng)、以及hBMSCs分化用于組織再 生和修復(fù)。2006年Kucia M等在鼠骨髓中鑒別出少量均勻的 Sca-l(+)lin(-)CD45(-)細(xì)胞群落，其帶有多能干細(xì)胞標(biāo)志，如SSEA-1 、 Oct-4、 Nanog和Rex-l。電鏡分析表明，這些細(xì)胞很小，細(xì)胞質(zhì)圍繞大的細(xì)胞核形 成窄邊，還包含開放型染色質(zhì)，這是胚胎干細(xì)胞的典型特征。體外培養(yǎng)這些 細(xì)胞可以分化成所有三胚層細(xì)胞系。猜測(cè)該群落為成體骨髓中遺留的少量胚 胎干細(xì)胞樣細(xì)胞，命名為胚胎源性多能干細(xì)胞(embryonic origin pluripotent stem cell, EOPSC)。2007年Kucia M等提出骨髓中存在多能干細(xì)胞原始群(founder population ofpluripotent stem cells, PSC)的概念。認(rèn)為胚胎發(fā)育時(shí)部分原始 胚芽細(xì)胞(primordial germ cells, PGC)被存放到各種器官組織中，比如骨 髓，隨個(gè)體發(fā)育，這部分細(xì)胞沒(méi)有分化為體細(xì)胞，而是保持了胚胎時(shí)的狀態(tài)， 持續(xù)存在。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)骨髓中確實(shí)存在一種小胚胎樣(very small embryonic-like, VSEL)干細(xì)胞，表達(dá)Oct-4、 SSEA-4等胚芽細(xì)胞特定 的表面標(biāo)志。因此認(rèn)為原始胚芽細(xì)胞可能存在于成體骨髓中，由于不同的機(jī) 制調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、影響細(xì)胞狀態(tài)、選擇表達(dá)不同的基因，導(dǎo)致了這些細(xì)胞不 同的命運(yùn)。我們假設(shè)這些細(xì)胞在組織/器官的再生中起重要作用，所以它們的 存在可以解釋干細(xì)胞的可塑性。但是病理?xiàng)l件下它們可能惡性轉(zhuǎn)化，形成腫 瘤。2007年，Ratajczak等也發(fā)現(xiàn)成體組織中存在一群表達(dá)早期ES特定抗原 和Oct-4、 Nanog的干細(xì)胞。認(rèn)為這些細(xì)胞是胚胎早期原腸胚形成時(shí)存放到
組織中的一些EOPSC，并假設(shè)這些細(xì)胞是胚芽細(xì)胞的直接后代，是體細(xì)胞 的母系細(xì)胞。2007年，Kucia等提出通過(guò)兩步法可以純化人臍帶血中小胚胎 樣(VESL)干細(xì)胞，先采用低滲液溶解紅細(xì)胞，然后分選出CXCR-4 ( + )、 AC133 ( + ) 、 CD34 ( + ) ， Lin (-) 、 CD45 (國(guó))，表達(dá)Oct-4、 Nanog、 SSEA-4 的細(xì)胞，為該細(xì)胞的純化提供了可行的方法。形態(tài)上很小，直徑3-5um， 細(xì)胞質(zhì)圍繞大的細(xì)胞核形成窄邊，還包含開放型染色質(zhì)，這是ES的典型形 態(tài)結(jié)構(gòu)特征。體外培養(yǎng)這些細(xì)胞可以分化成所有三胚層細(xì)胞系。該細(xì)胞存在 于多種成體組織中，以骨髓中含量最高，并隨年齡增大量減少。體外最多倍 增140代而未出現(xiàn)衰老現(xiàn)象。綜上所述，骨髓中確實(shí)存在與ES近似的干細(xì)胞群，表達(dá)ES特征性的 表面標(biāo)志，具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能，學(xué)者們給這種細(xì)胞起了很 多名字，我們認(rèn)為胚胎源性多能干細(xì)胞(EOPSC)這個(gè)名稱最合適，概括了 其來(lái)源和功能。目前對(duì)該細(xì)胞還知之甚少，有必要進(jìn)行深入研究，若能明確 該細(xì)胞具有胚胎干細(xì)胞特性，其多向分化、持續(xù)增殖和可來(lái)源自體的能力， 對(duì)干細(xì)胞移植和組織工程的研究具有重大推動(dòng)作用。為了對(duì)EOPSC作進(jìn)一 步研究，必須獲得純的胚胎源性多能干細(xì)胞，但目前還未見分離、培養(yǎng)、鑒 定成體骨髓中的EOPSC的相關(guān)報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種細(xì)胞移植和組織工程中新的細(xì)胞來(lái)源，具體是 指從骨髓中制備一種骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞的方法及其依據(jù)該方法制得 的細(xì)胞。本發(fā)明提供一種骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞(EOPSC)的制備方法，包括下述步驟I)骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞的分離取成年個(gè)體骨髓10ml，裂解紅細(xì)胞，注入無(wú)血清培養(yǎng)基(Itskovitz-Eldor J, et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising thethree embryonic germ layers. Mol Med.2000.6:88—95 )， 24h后 棄去不貼壁細(xì)胞；傳代后采用有限稀釋法(司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正，主編.細(xì)胞培 養(yǎng).西安:世界圖書出版公司，第一版.2004.311-313)逐級(jí)稀釋克隆培養(yǎng) EOPSC， 3-5天傳代；II) 骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞的純化、擴(kuò)增、建系挑選單細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，換用胚胎干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基(BrivanlouAH, et al. Stem cells: setting standards for human embryonic stem cells. Science. 2003.300:913-916) ， 3-5天傳代，每代凍存部分細(xì)胞，建立EOPSC系；III) 骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞的鑒定觀察細(xì)胞形態(tài)，檢測(cè)細(xì)胞無(wú)致瘤性，測(cè)定細(xì)胞表面標(biāo)志；IV) 骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化，形成心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及肝細(xì)胞樣細(xì)胞。本發(fā)明還提供了依據(jù)上述方法制得的骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞 (EOPSC)。具體技術(shù)方案如下一、 從骨髓中分離EOPSC取新鮮骨髓，裂解紅細(xì)胞后，貼壁培養(yǎng)，24h后去除懸浮未貼壁細(xì)胞， 每3 4 d換液1次，直到需要傳代，第2代細(xì)胞克隆化培養(yǎng)。二、 EOPSC純化、擴(kuò)增、建系第2代細(xì)胞達(dá)70%-80%融合時(shí)，用0.25%Typsin-EDTA消化成單細(xì)胞 懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后將單細(xì)胞懸液密度調(diào)成100/ml，取200 u 1滴于96孔板中 每行的第1孔，以有限稀釋法逐級(jí)稀釋，接種于FN包被的96孔板中。種植 后在顯微鏡下對(duì)單個(gè)細(xì)胞的孔進(jìn)行標(biāo)記，去除發(fā)現(xiàn)有多個(gè)細(xì)胞的孔。對(duì)單個(gè) 細(xì)胞增殖來(lái)源的細(xì)胞克隆繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)至24孔板、小皿、大皿，接種密度 為(0.5-1.5)乂103/0112; 3-5天進(jìn)行傳代。三、 EOPSC鑒定(一) 觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并行Gimsa染色； 掃描電鏡、透射電鏡檢測(cè)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞間的生理連接；測(cè)定 EOPSC染色體數(shù)目和核型。(二) 檢測(cè)生長(zhǎng)特性測(cè)定EOPSC倍增時(shí)間、生長(zhǎng)曲線、分裂指數(shù)、接 種存活率、克隆形成率；支原體檢測(cè)；端粒長(zhǎng)度檢測(cè)。(三) 免疫熒光檢測(cè)表面標(biāo)志CXCR-4、 CD133、 CD34、 SSEA-4、 SSEA-1、 CD13、 CD14、 CD44、 Lin、 CD45、 CD54、 MHC II的表達(dá)；(四) 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)EOPSC調(diào)亡 (五) 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)表面標(biāo)志CD133、 CD34、 SSEA-4陽(yáng)性細(xì)胞百分 率、細(xì)胞周期時(shí)相、DNA合成；(六) RT-PCR檢測(cè)Oct-4、 Nanog、 Rex-1等基因的表達(dá)；(七) EOPSC凍存及凍存復(fù)蘇后生物學(xué)性狀檢測(cè) 四、EOPSC誘導(dǎo)分化(一) 骨髓EOPSC誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞(中胚層細(xì)胞)2-3dEB種植 到種植到己經(jīng)鋪有END-2細(xì)胞詞養(yǎng)層的24孔板中進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng) 液中同時(shí)加入5ng/ml TGF-P，誘導(dǎo)培養(yǎng)5d后進(jìn)行鑒定。(二) 骨髓EOPSC體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞(外胚層細(xì)胞)采用模擬 體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程的序貫誘導(dǎo)方法。(三) 骨髓EOPSC體外誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞(內(nèi)胚層細(xì)胞)。
具體實(shí)施方式
現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述。 實(shí)施例l:成人骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞的制備 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料與試劑健康志愿者(男性，32歲齡，體質(zhì)量73kg)。M199、 DMEM-LG、 DMEM-HG、 DMEM/F12、 0.25%Typsin-EDTA、 CD13、 雙抗(以上試劑均購(gòu)自Gibco公司)MCDB-201、 Dexamethasone、 2-磷酸抗壞血酸、ITS、 FN、 LAA、 FITC國(guó)二 抗、Cy3-二抗、CD34-FITC、 SSEA-4-FITC、 CD133-FITC (以上試劑均購(gòu)自 Sigma公司)胎牛血清(FCS)(購(gòu)自Hyclone公司)rhEGF、 rhPDGF-BB、 FGF國(guó)4、 HGF、 IGF國(guó)1、 VEGF (購(gòu)自R&D System公司)rhLIF、 bFGF、 TGF-卩(購(gòu)自Prospec公司)CXCR陽(yáng)4、 CD34、 SSEA-4、 SSEA國(guó)1、 Lin、 CD133、顧C(jī)-II、 Troponin-T、 Nestin、 GFAP、 GAL-C、 MAP-II、 TnT 、 Hoechst33342 (以上抗體均購(gòu)自 Santa Cruz公司)CD14、 a-actin、 CD54、 CD44、 CD45 (以上抗體均購(gòu)自博士德公司)
細(xì)胞/組織總RNA抽提試劑盒(購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司)逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV (購(gòu)自Promega公司)TaqDNA聚合酶(購(gòu)自TaKaRa公司)弓I物序列均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成
一、 從骨髓中分離EOPSC采用骨髓單核細(xì)胞直接貼壁法抽取成年健康男性志愿者髂骨骨髓 10ml， 900Xg離心10min，棄上清與脂肪；加入紅細(xì)胞裂解液TrisNH4Cl 4°C 5min去除紅細(xì)胞，以lX10"ml接種于FN包被的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基為79% DMEM/F12、 20%SR、 2mmol/L Glutamine、 1%MEM、 1000U/ml LIF24h后 去除懸浮未貼壁細(xì)胞，每3 4d換液l次，直到需要傳代。
二、 EOPSC純化、擴(kuò)增、建系細(xì)胞克隆化培養(yǎng)第2代細(xì)胞達(dá)70%-80%融合時(shí)，用0.25% Typsin-EDTA消化成單細(xì)胞懸液，換用擴(kuò)增培養(yǎng)基60% DMEM-LG、 40 % MCDB-201添加ITS、LA-BSA、 1Ommol/L Dexamethasone、 l(T4mol/L LAA、 2XFBS及10ng/mlPDGF-BB、 10ng/mlEGF、 1000U/mlLIF;細(xì)胞計(jì)數(shù)后將 單細(xì)胞懸液密度調(diào)成100/ml，取200^1滴于96孔板中每行的第1孑L，以有 限稀釋法逐級(jí)稀釋，接種于FN包被的96孔板中。種植后在顯微鏡下對(duì)單個(gè) 細(xì)胞的孔進(jìn)行標(biāo)記，去除發(fā)現(xiàn)有多個(gè)細(xì)胞的孔。對(duì)單個(gè)細(xì)胞增殖來(lái)源的細(xì)胞 克隆繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)至24孔板、小皿、大皿，接種密度為(0.5-1.5)X10Vcm、 于接種5天后用0.25XTypsin-EDTA消化，進(jìn)行傳代，建立EOPSC系。
三、 EOPSC鑒定(一) EOPSC形態(tài)結(jié)構(gòu)1. 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)見細(xì)胞呈"巢狀"克隆性增殖，集落邊緣清晰、光滑，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞之間界限不清；消化后的單個(gè)ES細(xì) 胞小、亮、圓形，邊界清，胞漿少，核大，核質(zhì)比大，核仁明顯，2-3個(gè);2. 掃描電鏡、透射電鏡可觀察到細(xì)胞間的生理連接，細(xì)胞結(jié)構(gòu)與其他細(xì)胞 相似；3. 測(cè)定EOPSC染色體數(shù)目和核型染色體眾數(shù)分析結(jié)果表明46條染色體 占全部統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的78% (39/50) ， <46占10%(5/50)， >46占12% (6/50); 染色體眾數(shù)為46條。(二) EOPSC生長(zhǎng)特性 1. EOPSC生長(zhǎng)曲線可見1 9天細(xì)胞數(shù)分別為2.00xl05/ml， 3.01xl05/ml， 4.75xl05/ml， 6.37xl05/ml， 8.05xl05/ml， 9.45xl05/ml， 10.80xl05/ml， 11.21xl05/ml， 11.02xl05/ml，細(xì)胞生長(zhǎng)潛伏期短于24小時(shí)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 為3 7天，8天后進(jìn)入平臺(tái)期；2. 分裂指數(shù)接種24小時(shí)后開始計(jì)數(shù)(每隔2h)，每1000個(gè)細(xì)胞中分裂 細(xì)胞的數(shù)目，2.00%, 3.01%， 4.75%， 6.37%， 8.05%， 9.45%， 9.80%， 9.85%。3. 安全性檢測(cè)1) 支原體檢測(cè)EOPSC核Hoechst33342染色后發(fā)藍(lán)色熒光，未檢測(cè)到支 原體DNA;2) 檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液及EOPSC HBVDNA、細(xì)菌和fflVDNA及真菌 均為陰性；3) 成瘤性實(shí)驗(yàn)表明EOPSC在裸鼠體內(nèi)無(wú)致瘤性；說(shuō)明得到的EOPSC沒(méi) 有污染，無(wú)成瘤性，可以安全的應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床研究。(三) EOPSC表面標(biāo)志檢測(cè)免疫熒光檢測(cè)表面標(biāo)志的表達(dá)CXCR-4 ( + ) 、 CD133 ( + ) 、 CD34 (+ ) 、 SSEA-4 (+) 、 SSEA國(guó)1 (+) 、 CD13 ( + ) 、 CD14 (+) 、 CD44 (+)、 Lin (-) 、 CD45 (國(guó))、CD54 (-)、畫C II (-)。(四) 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)EOPSC調(diào)亡分析各代細(xì)胞的凋亡情況，凋亡細(xì)胞所占的百分比均在1%以下。io代 為0.07%， 30代為0.08%， 40代為0.06%。(五) 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞克隆化培養(yǎng)傳至第10代和20代時(shí)，0.25^Typsin-EDTA消化，取 約5乂106個(gè)細(xì)胞，均分為5管，分別按抗體說(shuō)明書加人熒光標(biāo)記抗體 CD34-FITC， SSEA-4-FITC， CD133-FITC和PI， FITC熒光二抗作為對(duì)照， 混勻，室溫避光放置30min。 PBS洗滌后，重懸細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以 Cdlquest軟件獲取細(xì)胞，10代陽(yáng)性細(xì)胞率分別為CD34 78。/。， SSEA-4 57%， CD133 69%; S期細(xì)胞占7.46。/。； 20代性細(xì)胞率分別為CD34 85%， SSEA-4 77%， CD133 91%; S期細(xì)胞占9.32。/0。(六) RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Oct-4、 Nanog、 Rex-l基因強(qiáng)表達(dá)。(七) EOPSC凍存及凍存復(fù)蘇后生物學(xué)性狀檢測(cè)
6個(gè)月后，復(fù)蘇凍存的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的形態(tài)，表面抗原，增殖速度等
和凍存前及在體外持續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞無(wú)差別。 四、EOPSC誘導(dǎo)分化
(一) 骨髓EOPSC誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞(中胚層細(xì)胞)
1. 10代的EOPSC種植到鋪有END-2細(xì)胞飼養(yǎng)層的24孔板中進(jìn)行誘導(dǎo)，培 養(yǎng)液為DMEM-HG+10。/。胎牛血清及5ng/ml TGF-(3;誘導(dǎo)培養(yǎng)5d后進(jìn)行 鑒定。
2. 分化的心肌細(xì)胞鑒定
1) 大體觀察每天用相差顯微鏡觀察擬胚體，至第5天出現(xiàn)自發(fā)性收縮， 即出現(xiàn)了自發(fā)搏動(dòng)的心肌細(xì)胞；
2) 透射電鏡可見細(xì)胞內(nèi)橫紋和細(xì)胞間的閏盤連接；
3) 免疫細(xì)胞熒光技術(shù)a-actin、 Troponin-T抗體，于4。C孵育過(guò)夜。再 用羅丹明標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG孵育l h，緩沖甘油封片，熒光鏡下 觀察為陽(yáng)性；
4) 流式細(xì)胞技術(shù)將EB分化集落消化成單細(xì)胞懸液，以心肌細(xì)胞特異 性肌鈣蛋白T(TnT)抗體和TRITC標(biāo)記的免抗鼠IgG作用后，以流式 細(xì)胞儀進(jìn)行心肌細(xì)胞分化率，結(jié)果為TnT陽(yáng)性細(xì)胞為18.36%。
(二) 骨髓EOPSC體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞(外胚層細(xì)胞) 采用模擬體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程的序貫誘導(dǎo)方法，共分4步
1. 當(dāng)EOPSC進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將細(xì)胞在明膠包被的24孔板中傳2代，然 后以(4-5)X 108/L接種在10g/L明膠包被的24孔板上，培養(yǎng)2d，細(xì)胞再 次聚集成團(tuán)；更換為MEM/F12+10。/。胎牛血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)3d細(xì)胞團(tuán) 飄浮起來(lái)，即擬胚體；
2. 誘導(dǎo)分化將擬胚體吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，接種在10^L明膠包被的24孔 板上，更換培養(yǎng)基為分化培養(yǎng)基DMEM/F12,胰島素10mg/L，腐胺 200mmol/L，腎上腺素40mg/L，黃體酮40mmol/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白200mg/L， 硒化鈉50mmol/L，甲狀腺素200 mg/L， bFGF20mg/L， EGF20mg/L，培 養(yǎng)3d。此時(shí)撤除培養(yǎng)基中的bFGF和EGF，培養(yǎng)4d;
3. 神經(jīng)細(xì)胞的維持培養(yǎng)以DMEM/F12+20。/。胎牛血清維持培養(yǎng)得到的神經(jīng) 細(xì)胞；
4.免疫化學(xué)鑒定誘導(dǎo)分化形成擬胚體后用Nestin多克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì) 胞熒光染色為陽(yáng)性。細(xì)胞固定后，分別行GFAP(1:200)， GAL-C(l:lOO)， MAP-II(1:1000)細(xì)胞免疫細(xì)胞熒光染色，均為陽(yáng)性。
'(三)骨髓EOPSC體外誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞(內(nèi)胚層細(xì)胞)
1. 將1 X 105/ml EOPSC接種到培養(yǎng)液為無(wú)飼養(yǎng)層的DMEM-HG培養(yǎng)基，內(nèi) 含rhLIF、 10%胎牛血清、3-巰基乙醇、L-谷氨酰胺和非必需氨基酸以及 雙抗，3d傳代l次；
2. 懸滴培養(yǎng)法制備擬胚體將消化后的細(xì)胞離心、去上清液，用去除rmLIF 的上述培養(yǎng)液重懸細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以30ul/滴的密度接種在 100mm4咅養(yǎng)皿的上蓋，然后倒置懸浮培養(yǎng)(培養(yǎng)皿內(nèi)裝少許PBS液)2d 后，小心翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿的上蓋，收集液滴，種人培養(yǎng)液中繼續(xù)懸浮培養(yǎng)。 每日取出換液，并用吸管輕輕吹打以防形成的擬胚體過(guò)早貼壁3d后形成 擬胚體；
3. 誘導(dǎo)向肝細(xì)胞分化將5d的擬胚體吸至6孔板培養(yǎng)皿中貼壁培養(yǎng)2d，培 養(yǎng)液為加人10MM Dexamethasone的去除rmLIF的上述培養(yǎng)液。從第3d 始于去除rmLIF的培養(yǎng)液中加人FGF-4，第5d再加入HGF等誘導(dǎo)因子， 繼續(xù)培養(yǎng)2周；
4. 取出6孔板內(nèi)置的蓋玻片行免疫組化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)白蛋白、CK18陽(yáng)性；
5. 細(xì)胞功能檢測(cè)l.糖原染色加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液2周后，進(jìn)行糖原染色， 顯微鏡下見胞漿內(nèi)存在紅色顆粒，為陽(yáng)性。2.尿素合成功能檢測(cè)加人 Dex、 FGF4和HGF等誘導(dǎo)因子進(jìn)行分化培養(yǎng)2周后，行比色法檢測(cè)尿素 氮含量，結(jié)果ld為124pg/106cells、 2d為131^ig/106cells、 3d為 148pg/106cells、 4d為162^ig/106cells，逐天增高。
權(quán)利要求
1、一種骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞的制備方法，其特征在于包括下述步驟I)骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞的分離骨髓單核細(xì)胞貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)成年骨髓中胚胎源性多能干細(xì)胞，取成年個(gè)體骨髓10ml，裂解紅細(xì)胞，注入無(wú)血清培養(yǎng)基，棄去不貼壁細(xì)胞；II)骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞的純化、擴(kuò)增、建系換用胚胎干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基，采用有限稀釋法逐級(jí)稀釋法克隆培養(yǎng)骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞，3-5天傳代；III)骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞的鑒定觀察細(xì)胞形態(tài)，檢測(cè)細(xì)胞無(wú)致瘤性，測(cè)定細(xì)胞表面標(biāo)志；IV)骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化，形成心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及肝細(xì)胞樣細(xì)胞。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞的制備方法，其特征在 于其中II)骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞的純化、擴(kuò)增、建系第2代細(xì)胞達(dá)70%-80%融合時(shí)，用0.25%Typsin-EDTA消化成單細(xì)胞 懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后將單細(xì)胞懸液密度調(diào)成100/ml，取200p1滴于96孔板中 每行的第1孔，以有限稀釋法逐級(jí)稀釋，接種于FN包被的96孔板中；種植 后在顯微鏡下對(duì)單個(gè)細(xì)胞的孔進(jìn)行標(biāo)記，去除發(fā)現(xiàn)有多個(gè)細(xì)胞的孔；對(duì)單個(gè) 細(xì)胞增殖來(lái)源的細(xì)胞克隆繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)至24孔板、小皿、大皿，接種密度 為(0.5-1.5)X10Vcm2; 3-5天進(jìn)行傳代。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞的制備方法，其特征在 于其中m)骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞鑒定用免疫熒光法測(cè)定表面標(biāo)志CXCR-4 (+) 、 CD133 ( + ) 、 CD34 (+)、 SSEA畫4 ( + ) 、 SSEA-1 ( + ) 、 CD13 (+) 、 CD14 (+) 、 CD44 ( + ) 、 Lin (-)、CD45 (畫)、CD54 (-) 、 MHC II (-)的表達(dá)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞的制備方法，其特征在于其中IV)骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化采用添加了 5ng/ml TGF-P及10%胎牛血清的DMEM-HG培養(yǎng)液進(jìn)行心 肌細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)并進(jìn)行鑒定；采用添加胰島素、腐胺、腎上腺素、黃體酮、 轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒化鈉、甲狀腺素、bFGF、 EGF的DMEM/F12培養(yǎng)液進(jìn)行神經(jīng) 細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)并進(jìn)行鑒定；采用添加了 rhLIF、胎牛血清、3-巰基乙醇、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸及雙抗的DMEM-HG培養(yǎng)基進(jìn)行肝細(xì)胞樣細(xì)胞誘 導(dǎo)培養(yǎng)并進(jìn)行鑒定。
5、 一種按照權(quán)利要求1所述的制備方法制得的骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。細(xì)胞移植和組織工程中尋找新的細(xì)胞來(lái)源成為當(dāng)務(wù)之急。本發(fā)明提供了骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞(EOPSC)的制備方法，包括骨髓胚胎源性多能干細(xì)胞的分離、純化、擴(kuò)增、建系，并從其形態(tài)結(jié)構(gòu)、表面標(biāo)志、生長(zhǎng)特性、分化能力等方面深入研究，本發(fā)明還提供了依據(jù)該方法制得的EOPSC，它不屬于任何已知的骨髓源干細(xì)胞群，而與ES非常相似，推測(cè)是遺留在成體骨髓中的ES，保持了未分化的狀態(tài)。本發(fā)明通過(guò)多種方法誘導(dǎo)EOPSC成為三胚層細(xì)胞，提供一種取材方便、無(wú)免疫原性、不涉及倫理學(xué)問(wèn)題的干細(xì)胞來(lái)源，其多向分化、持續(xù)增殖和自體來(lái)源的特性，對(duì)干細(xì)胞移植治療和組織工程學(xué)的相關(guān)研究具有重大推動(dòng)作用。
文檔編號(hào)C12N5/08GK101126080SQ200710043848
公開日2008年2月20日 申請(qǐng)日期2007年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月17日
發(fā)明者黨瑞山, 張傳森, 彬 李, 昱 溫 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)