干細胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)宮內(nèi)膜干細胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從經(jīng)血中分離、培養(yǎng)宮內(nèi)膜干細胞的方法以及使用到的干細胞培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002]大量研究已證明，宮內(nèi)膜干細胞具有很強的再生能力，同時具有多分化潛能和低免疫原性，可作為細胞治療、組織工程的種子細胞，其應(yīng)用前景廣闊。宮內(nèi)膜干細胞最早是從刮宮組織中提取，隨著研究深入，人們發(fā)現(xiàn)從女性月經(jīng)血中同樣能分離得到具有再生能力的干細胞，并且其獲取方式無侵害性，無倫理問題，方法更簡單、安全。從經(jīng)血中獲取的宮內(nèi)膜干細胞具有極強的再生能力，其主要表現(xiàn):擴增快，倍增時間僅24小時左右，而骨髓干細胞倍增時間則需要更長。然而，現(xiàn)有培養(yǎng)技術(shù)條件下，宮內(nèi)膜干細胞使用培養(yǎng)基成分較多，價格昂貴，且體外培養(yǎng)10代以上，細胞容易出現(xiàn)衰老、退化現(xiàn)象，增殖效率降低，且在培養(yǎng)基中添加較多的細胞生長因子，會促進干細胞分化，對于維持其干性與穩(wěn)定性不利，影響干細胞儲存與研究質(zhì)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對現(xiàn)有培養(yǎng)基成分較多、價格昂貴、細胞隨著擴增代次增加容易老化等問題，本發(fā)明提供一種經(jīng)濟有效的干細胞培養(yǎng)基，其能夠穩(wěn)定擴增干細胞，長久維持其活性與干性，同時提供有效促進干細胞生長的培養(yǎng)方法，通過經(jīng)血與子宮脫落內(nèi)膜分開收集、分離、共培養(yǎng)來獲得穩(wěn)定、大量的干細胞。
[0004]為提供一種經(jīng)濟有效的干細胞培養(yǎng)基，本發(fā)明采取如下的技術(shù)方案:
[0005]干細胞培養(yǎng)基，包含以下組分:低糖DMED培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS)，青鏈霉素雙抗溶液，硫酸慶大霉素，谷氨酰胺。
[0006]作為優(yōu)選，各組分按體積含量各占總體積百分比，低糖DMEM培養(yǎng)基占82%，胎牛血清占15 %，青鏈霉素雙抗溶液占I %，硫酸慶大霉素占I %，谷氨酰胺占I %。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供一種培養(yǎng)宮內(nèi)膜干細胞的方法，采取如下的技術(shù)方案:
[0008]—種培養(yǎng)宮內(nèi)膜干細胞的方法，包括將采集到的經(jīng)血與子宮內(nèi)膜組織分開收集，然后分別用本發(fā)明提供的干細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng)分別得到經(jīng)血貼壁細胞和子宮內(nèi)膜貼壁細胞，再將經(jīng)血貼壁細胞和子宮內(nèi)膜貼壁細胞于細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，用胰酶消化收集貼壁細胞，接種于細胞共培養(yǎng)皿，再用本發(fā)明提供的干細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。
[0009]更具體的，一種培養(yǎng)宮內(nèi)膜干細胞的方法，包括如下操作步驟:
[0010]步驟1:采集經(jīng)血與子宮內(nèi)膜組織，將經(jīng)血轉(zhuǎn)移至含肝素鈉的無菌離心管中，子宮內(nèi)膜組織轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)皿，離心管與培養(yǎng)皿用封口膜封住，24h內(nèi)低溫(4?8°C)運輸至實驗室；
[0011]步驟2:將步驟I所得離心管中的經(jīng)血與生理鹽水充分混合，然后與Ficoll分離液I: I疊加，離心，收集單個核細胞;生理鹽水重懸單個核細胞，離心洗滌，去除紅細胞、血小板、細胞碎片；離心的細胞沉淀用本發(fā)明提供的干細胞培養(yǎng)基重懸并接種于T25細胞培養(yǎng)瓶，放置于37 °C,5%⑶2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天，中間每2?3天半量換液一次，干細胞逐漸貼壁生長；
[0012]步驟3:將步驟I所得培養(yǎng)皿中的子宮內(nèi)膜組織加入到消化液中，靜置消化半小時，再加入等體積緩沖液稀釋消化液，再用Iml槍頭吹打消化組織，將組織與稀釋過的消化液混勻，過篩網(wǎng)，使細胞分散、分離，去除未消化組織;經(jīng)過篩網(wǎng)濾過的細胞用生理鹽水重懸，離心，去除上清，再加入空白低糖DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，離心，收集細胞沉淀;再向細胞沉淀中加入本發(fā)明提供的干細胞培養(yǎng)基重懸細胞;接種于T25細胞培養(yǎng)瓶，放置于37 °C,5% 0)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天，中間每2?3天半量換液一次，干細胞逐漸貼壁生長；
[0013]步驟4:將步驟2及步驟3所得貼壁細胞接種于T25細胞培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)7天后，用胰酶消化收集貼壁細胞，貼壁細胞離心經(jīng)過離心洗滌，接種于細胞共培養(yǎng)皿，上層為步驟2所述經(jīng)血貼壁細胞，下層為步驟3所述子宮內(nèi)膜貼壁細胞，所述細胞接種密度為I X 16細胞/ml，采用本發(fā)明提供的干細胞培養(yǎng)基，共培養(yǎng)7天，細胞獲得大量擴增；
[0014]步驟5:宮內(nèi)膜干細胞凍存:當細胞擴增到I?3 X 17細胞時，按照(3?5) X 16細胞/ml加入Iml細胞凍存液;將含有細胞的凍存液轉(zhuǎn)移至1.5ml凍存管，凍存管放入凍存盒，凍存盒置于-80 0C，24h后，再將凍存盒中的凍存管轉(zhuǎn)入-196 0C液氮儲存；
[0015]步驟6:宮內(nèi)膜干細胞復(fù)蘇:將儲存于_196°C液氮中的宮內(nèi)膜干細胞凍存管取出，迅速放置于40°(:水浴鍋中，溶解l-2min，取Iml解凍細胞懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管，加入1ml體積的空白DMEM培養(yǎng)基充分混勻，離心，重復(fù)洗滌一遍，再將本發(fā)明提供的干細胞培養(yǎng)基加入細胞沉淀，以I X 16細胞/ml接種于T75細胞培養(yǎng)瓶，放置于37°C,5%CO2培養(yǎng)基培養(yǎng)，可連續(xù)傳代20次以上。
[0016]作為優(yōu)選，所述步驟3中緩沖液為含0.5%ΙΠ膠原蛋白酶的磷酸緩沖液。
[0017]作為優(yōu)選，所述步驟2中的生理鹽水含有I%青鏈霉素雙抗溶液;所述離心洗滌步驟包括2次離心，分別用生理鹽水重懸細胞沉淀，然后離心。
[0018]作為優(yōu)選，所述步驟2中以細胞濃度3X 105/ml接種于T25細胞培養(yǎng)瓶。
[0019]作為優(yōu)選，所述步驟3中以細胞濃度3X 105/ml接種于T25細胞培養(yǎng)瓶。
[0020]作為優(yōu)選，所述步驟4中的離心洗滌步驟為用空白低糖DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，800g，離心 lOmin。
[0021]作為優(yōu)選，所述的步驟5中的細胞凍存液配方為:體積百分比為40%的胎牛血清、體積百分比為1 % DMSO (二甲基亞砜)、體積百分比為50 %空白低糖DMEM培養(yǎng)基。
[0022]本發(fā)明提供的干細胞培養(yǎng)基成分簡單，添加成分較少，成本較低;體外培養(yǎng)20代以上，細胞不易出現(xiàn)衰老、退化現(xiàn)象，能長久維持干細胞的活性與干性。
[0023]本發(fā)明提供的干細胞培養(yǎng)方法簡單、有效，細胞增殖效率快，體外培養(yǎng)倍增時間僅20小時左右;且細胞能夠穩(wěn)定擴增50代。
[0024]而且通過本發(fā)明提供的培養(yǎng)宮內(nèi)膜干細胞的方法培養(yǎng)得到的宮內(nèi)膜干細胞具有如下特性:
[0025]I)形態(tài)特征:細胞培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下，可觀察到宮內(nèi)膜干細胞成長梭性，成簇排列，第7代至第22代細胞形態(tài)均保持不變。
[0026]2)倍增時間:利用MTT法繪制細胞增長曲線，宮內(nèi)膜干細胞的倍增時間在20小時左右。
[0027]3)表面標志物檢測:利用流式細胞術(shù)檢測細胞表面標志物，檢測出宮內(nèi)膜干細胞具有間充質(zhì)干細胞標志物典型特點:⑶29、⑶44、⑶73、⑶90、⑶105陽性;⑶34、⑶45、⑶117、HLA-DR陰性。
【附圖說明】
[0028]圖1是實施例2得到的干細胞第7代的形態(tài)圖；
[0029]圖2是實施例2得到的干細胞第20代的形態(tài)圖；
[0030]圖3是實施例2得到的干細胞增長曲線圖；
[0031 ]圖4是實施例2得到的干細胞的表面標志物鑒定。
【具體實施方式】
[0032]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0033]實施例1
[0034]干細胞培養(yǎng)基，按體積含量各占總體積百分比，低糖DMEM培養(yǎng)基占82%，胎牛血清占15 %，青鏈霉素雙抗溶液占I % ;硫酸慶大霉素占I % ;谷氨酰胺占I %。
[0035]實施例2
[0036]采用實施例1提供的干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)宮內(nèi)膜干細胞的方法，包括如下步驟:
[0037]步驟1:利用經(jīng)血采集裝置采集經(jīng)血與子宮內(nèi)膜組織，并將經(jīng)血轉(zhuǎn)移至含肝素鈉的無菌離心管中，子宮內(nèi)膜組織轉(zhuǎn)移至無菌的培養(yǎng)皿，用封口膜將離心管與培養(yǎng)皿開口處封住，24h內(nèi)低溫(4?8 °C)運輸至實驗室；
[0038]步驟2:將步驟I所述離心管中的經(jīng)血與等體積生理鹽水充分混合，生理鹽水含I %青鏈霉素雙抗溶液，用于抑制細菌增長。將經(jīng)血與生理鹽水混合均勻，與Ficoll分離液1:1疊加，800g離心20min，收集白膜層單個核細胞。然后用生理鹽水重懸單個核細胞，800g離心lOmin，重復(fù)操作一遍，以去除紅細胞、血小板、細胞碎片等。離心的細胞沉淀用實施例1提供的培養(yǎng)基重懸，然后細胞按照3 X 105/ml接種于T25細胞培養(yǎng)瓶，放置于37 °C、5 % CO2培養(yǎng)基培養(yǎng)7天，中間每2?3天半量換液一次;干細胞逐漸貼壁生長；
[0039]步驟3:將