用于體外培養(yǎng)干細(xì)胞的方法和培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組織培養(yǎng)領(lǐng)域，更重要的是成體組織特異性干細(xì)胞的培養(yǎng)和干細(xì)胞用于治療的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]成體干細(xì)胞可用于產(chǎn)生成體干細(xì)胞之組織的治療性處理。然而，培養(yǎng)成體干細(xì)胞通常是非常有挑戰(zhàn)性的。該方面中的一個(gè)難點(diǎn)是其環(huán)境經(jīng)?？沙蔀榉只脑颉＿@種表型的不穩(wěn)定性代表了用于在體外維持成體干細(xì)胞培養(yǎng)的主要挑戰(zhàn)。
[0003]組織工程中的環(huán)境因子主要由培養(yǎng)基形成并且在干細(xì)胞培養(yǎng)的情況下，這種培養(yǎng)基通常會(huì)含有哺乳動(dòng)物來源的血清。所述血清在定義上是未知因子(如血清蛋白和其他已經(jīng)被分泌到血液和/或被血液轉(zhuǎn)運(yùn)的影響性化合物)的來源。非常重要的是在干細(xì)胞的治療性應(yīng)用中使未知組分的量盡可能的小，因?yàn)橐氲交颊唧w內(nèi)的生物材料應(yīng)當(dāng)盡可能受控。在此期間已經(jīng)開發(fā)了用于胚胎干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基(參見例如Vail ier，L.，2011Meth.Molec.B1l.，690:57-66)。仍未提出用于成體人干細(xì)胞系的無血清培養(yǎng)基。
[0004]此外，干細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)能夠提供所有營養(yǎng)物和干細(xì)胞擴(kuò)增所必須的其他化合物，但它們不含將對干細(xì)胞的生長或擴(kuò)增有害的或者將導(dǎo)致干細(xì)胞進(jìn)一步不明確地分化成特定細(xì)胞的化合物。在過去15年中，已經(jīng)示出Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞和多種成體組織干細(xì)胞(例如來自于胃腸系統(tǒng)、皮膚和頭發(fā)以及神經(jīng)系統(tǒng)的那些)二者的自我更新和細(xì)胞命運(yùn)選擇(Clevers，H.和Nusse，R.,2012,Cell 149:1192-1205)。這些數(shù)據(jù)表明Wnt信號(hào)對于培養(yǎng)物中干細(xì)胞的自我更新將是有益的并且可以提供在其重新引入患者中之前體外擴(kuò)增干細(xì)胞的途徑。最近已經(jīng)定義了用于數(shù)種人和小鼠成體干細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)(Huch，M.等，2013,Nature 494:247-250)。這些系統(tǒng)依賴于Wnt通路的激動(dòng)劑(R-Spondinl)，其通過結(jié)合Lgr5受體起作用并且由此通過Wnt蛋白增強(qiáng)了Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。對于結(jié)腸、胃、肝和人干細(xì)胞，內(nèi)源Wnt信號(hào)是不足夠的并且需要外源Wnt3a。然而，注意到與經(jīng)Wnt3a條件化(condit1n)的含血清培養(yǎng)基相比，經(jīng)純化的Wnt3a在維持胃樣器官方面提供較低的效力(Barker，N.等，2010，Cell Stem Cell 6:25-36)。然而，如上所指出的，在臨床應(yīng)用中，不希望存在血清。
[0005]Wnt蛋白是一組長度為350-400個(gè)氨基酸之分泌的經(jīng)脂質(zhì)修飾的(棕櫚酰化)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。在信號(hào)序列之后，它們攜帶20-24個(gè)半胱氨酸殘基的保守模式，其上發(fā)生對半胱氨酸殘基的棕櫚?；?。這些蛋白質(zhì)激活細(xì)胞中的多個(gè)通路，所述通路可被歸類為經(jīng)典的和非經(jīng)典的Wnt通路。通過這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，Wnt蛋白在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和細(xì)胞極性產(chǎn)生中發(fā)揮多種重要作用。人Wnt3a基因是WNT基因家族的成員。其編碼示出與小鼠Wnt3A蛋白96%氨基酸同一性的蛋白質(zhì)，以及與人WNT3蛋白質(zhì)(另一WNT基因產(chǎn)物)84%氨基酸同一性的蛋白質(zhì)。Wnt3a基因與WNT14基因(另一個(gè)家族成員，在染色體lq42區(qū)中)成簇。
[0006]Wnt蛋白是可溶的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，其需要連接脂質(zhì)部分以獲得活性，并且由于這個(gè)原因是疏水的(Willert，K.等，2003，Nature 423:448-452)。因此，在存在維持其溶解性的去污劑的存在下對其進(jìn)行純化。然而，在細(xì)胞培養(yǎng)基中稀釋之后，特別是在不存在血清的情況下，去污劑的濃度不足以維持Wnt溶解性，然后其迅速失去活性(FuerenC.等，2010，Dev.Dyn.239:184-190)。
[0007]最近，在不存在血清的情況下，人成體干細(xì)胞不能被有效地獲得和/或維持，因?yàn)檫@導(dǎo)致培養(yǎng)物中Wnt活性不足?？梢砸詳?shù)種方式維持干細(xì)胞培養(yǎng)物中的高Wnt活性:
[0008]-頻繁地補(bǔ)充培養(yǎng)基，這極大地增加了成本并且還干擾了培養(yǎng)，這通常是不期望的；
[0009]-添加血清，血清是未明確限定的產(chǎn)品，其干擾臨床應(yīng)用并且誘導(dǎo)許多干細(xì)胞的分化；
[0010]-使用Wnt條件化的培養(yǎng)基(參加定義的實(shí)驗(yàn)部分)替代經(jīng)純化的Wnt。然而，條件化培養(yǎng)基中的Wnt與血清具有相同的缺點(diǎn)；
[00?1 ]-可能添加穩(wěn)定Wnt的化合物，例如葡糖胺聚糖。除了極端昂貴之外，也未證明添加葡糖胺聚糖的有益效果。
[0012]因此，有需要開發(fā)用于培養(yǎng)成體人干細(xì)胞的更明確限定的培養(yǎng)基，其中增強(qiáng)細(xì)胞的增殖并抑制細(xì)胞的分化。這樣的培養(yǎng)基將優(yōu)選地包含將維持長時(shí)間活性的一種或更多種Wnt蛋白，并且這種培養(yǎng)基將需要沒有血清或者其他未限定的組分。此類無血清成體人干細(xì)胞培養(yǎng)基的可用性還將使得能夠進(jìn)一步使用此類成體干細(xì)胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明涉及用于體外培養(yǎng)干細(xì)胞的方法，其中將所述細(xì)胞保持在包含Wnt蛋白和脂質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中，其中所述脂質(zhì)的可利用濃度為至少0.lmM。優(yōu)選地，在所述方法中，所述脂質(zhì)為脂質(zhì)體或膠束的形式，更優(yōu)選地，所述脂質(zhì)和所述Wnt蛋白締合成復(fù)合物。優(yōu)選地，這樣的脂質(zhì)體由二肉豆蔻?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DMPC)、1，2-二肉豆蔻?；?sn-甘油-3-磷酸-(1，-rac-丙三醇)(DMPG)和膽固醇構(gòu)成，優(yōu)選DMPC: DMPG:膽固醇的比為10:1:10。
[OOM]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述Wnt蛋白選自人Wnt蛋白，其中所述蛋白優(yōu)選Wnt3a。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞是成體干細(xì)胞，優(yōu)選腸干細(xì)胞，更優(yōu)選從十二指腸和/或回腸獲得的干細(xì)胞。還優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述干細(xì)胞培養(yǎng)物是器官樣組織(organoid)培養(yǎng)物。
[0015]本發(fā)明還涵蓋用于干細(xì)胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，其包含Wnt蛋白和脂質(zhì)，其中所述脂質(zhì)的可利用濃度為至少0.lmM，優(yōu)選其中所述脂質(zhì)是脂質(zhì)體或膠束的形式。
[0016]本發(fā)明的另一方面是用于干細(xì)胞治療的方法，其包括以下步驟:
[0017]a.從對象分離干細(xì)胞；
[0018]b.任選地處理所述干細(xì)胞，其中所述處理可以選自:分化、去分化、再分化、重編程、引入突變、遺傳修飾；
[0019]c.在根據(jù)本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述干細(xì)胞；
[0020]d.將所述經(jīng)培養(yǎng)的干細(xì)胞引入到有此需要的對象中。
[0021]本發(fā)明還包括用于自體成體干細(xì)胞治療的方法，其包括以下步驟:
[0022]a.從對象分離成體干細(xì)胞；
[0023]b.在根據(jù)本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述成體干細(xì)胞；
[0024]c.將所述經(jīng)培養(yǎng)的成體干細(xì)胞再引入到所述對象中。
[0025]本發(fā)明還包括用于自體成體干細(xì)胞治療的方法，其包括以下步驟:
[0026]a).從對象分離成體干細(xì)胞；
[0027]b).對所述成體干細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾；
[0028]c).在根據(jù)本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述經(jīng)遺傳修飾的成體干細(xì)胞；
[0029]d).將所述經(jīng)培養(yǎng)的成體干細(xì)胞再引入到所述對象中。
[0030]本發(fā)明還包括用于成體干細(xì)胞治療的方法，其包括以下步驟:
[0031]a.從對象的器官分離成體干細(xì)胞；
[0032]b.對所述成體干細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾；
[0033]c.在根據(jù)本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述經(jīng)遺傳修飾的成體干細(xì)胞；
[0034]d.將所述經(jīng)培養(yǎng)的成體干細(xì)胞再引入到所述對象中，
[0035]其中以這樣的方式遺傳修飾所述成體干細(xì)胞使得它們產(chǎn)生用于治療疾病的治療性化合物，其中所述疾病與步驟a中得到的所述成體干細(xì)胞所來源的器官或器官系統(tǒng)無關(guān)或僅部分相關(guān)。
[0036]本發(fā)明還包括用于成體干細(xì)胞治療的方法，其包括以下步驟:
[0037]a.從對象的器官分離成體干細(xì)胞；
[0038]b.對所述成體干細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾；
[0039]c.將所述經(jīng)培養(yǎng)的成體干細(xì)胞再引入到所述對象中，
[0040]其中以這樣的方式遺傳修飾所述成體干細(xì)胞使得它們產(chǎn)生用于治療疾病的治療性化合物，其中所述疾病與步驟a中得到的所述成體干細(xì)胞所來源的器官或器官系統(tǒng)無關(guān)或僅部分相關(guān)。
[0041]本發(fā)明還包括包含Wnt蛋白和脂質(zhì)的無血清培養(yǎng)基，其用于成體干細(xì)胞治療，其中所述成體干細(xì)胞治療包括:
[0042]a.從對象分離成體干細(xì)胞；
[0043]b.在根據(jù)本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述成體干細(xì)胞；
[0044]c.將所述經(jīng)培養(yǎng)的成體干細(xì)胞再引入到所述對象中。
[0045]本發(fā)明還包括包含Wnt蛋白和脂質(zhì)的無血清培養(yǎng)基，其用于成體干細(xì)胞治療，其中所述成體干細(xì)胞治療包括:
[0046]a.從對象分離成體干細(xì)胞；
[0047]b.對所述成體干細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾；
[0048]c.在根據(jù)本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述成體干細(xì)胞；
[0049]d.將所述經(jīng)培養(yǎng)的成體干細(xì)胞再引入到所述對象中。
【附圖說明】
[0050]圖1:經(jīng)Wnt3a條件化的培養(yǎng)基，而非經(jīng)純化的Wnt3a蛋白支持得到腸干細(xì)胞器官樣組織。在經(jīng)Wnt3a條件化的培養(yǎng)基、經(jīng)純化的Wnt3a或者經(jīng)純化的Wnt3a和血清的存在下，得到人十二指腸和回腸器官樣組織培養(yǎng)物。自得到起的第一次傳代之后，從器官樣組織培養(yǎng)物獲取照片。
[0051]圖2:在無血清細(xì)胞培養(yǎng)基中Wnt3a蛋白活性迅速喪失。在存在或不存在指定的10%胎牛血清的情況下，在DMEM中孵育經(jīng)Wnt3a條件化的培養(yǎng)基(50%)或經(jīng)純化的Wnt3a(250ng/ml)，在37°C持續(xù)指定量的時(shí)間。然后使用LSL測定確定剩余的Wnt3a活性。CM:條件化的培養(yǎng)基。
[0052]圖3:短半衰期和去污劑相關(guān)的毒性限制了經(jīng)純化的Wnt3a支持干細(xì)胞自我更新的用途。A)無血清ES細(xì)胞自我更新測定比較每日或者在每3天傳代后添加250ng/ml經(jīng)純化Wnt3a對自我更新的作用。當(dāng)在每次傳代后添加Wnt3a時(shí)自我