一種培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因動物胚胎細胞或轉(zhuǎn)基因動物的方法及培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因猴的方法及培養(yǎng)基。 技術(shù)背景
[0002] 動物疾病模型在研究人類疾病致病機理和藥物篩選中起到了關(guān)鍵作用。建立動物 模型的基因編輯方法主要有轉(zhuǎn)基因和基因打祀。轉(zhuǎn)基因即用人工方法將外源基因?qū)牖蛘?合到基因組內(nèi)，并能夠穩(wěn)定傳給下一代。但依賴于病毒方法對動物進行遺傳學(xué)修飾也有一 定的局限性，即被轉(zhuǎn)入基因的隨機插入使得突變位點無法預(yù)知，突變數(shù)量無法控制，從而限 制了動物模型的建立。而基因打祀技術(shù)是指通過內(nèi)源性DNA定點重組，改變基因組中的某一 特定基因從而在生物活體內(nèi)研究該基因的功能，如傳統(tǒng)的同源重組技術(shù)、重組酶Cre介導(dǎo)的 位點特異性重組技術(shù)、鋒指核酶技術(shù)（zinc-finger nucleases)、TALEN(1:ransc;ription activator-Uke effector nuclease)技術(shù)及近年W來備受關(guān)注的CRISPR/&s9技術(shù)等。
[0003] 傳統(tǒng)的基因打祀技術(shù)依賴于胚胎干細胞系，首先在體外培養(yǎng)的胚胎干細胞系中進 行基因打祀，然后將打祀后的胚胎干細胞移植入動物母體，讓其發(fā)育成帶有突變基因的動 物。然而目前只有鼠的胚胎干細胞系可用于基因打祀技術(shù)。對于大多數(shù)物種，基因修飾仍依 賴于直接使用動物的胚胎細胞，效率低并且費用昂貴。提高胚胎細胞中基因修飾的效率是 成功建立動物疾病模型的關(guān)健。近年來發(fā)展的鋒指核酸酶(ZFN)技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因 子核酸內(nèi)切酶(TALEN)技術(shù)和基因編輯新技術(shù)CRISPR/Cas9等人工內(nèi)切酶使得編輯任基因 組意位點的問題得W實現(xiàn)。TALEWlYanscription Activator-Like Effector Nuclease) 轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)，克服了常規(guī)的ZFN方法不能識別任意目標(biāo)基因序列，W 及識別序列經(jīng)常受上下游序列影響等問題，而具有ZFN相等或更好的活性，但TALE化蛋白分 子量過大往往會給分子操作帶來不便，不但增大與祀基因結(jié)合難度，構(gòu)建復(fù)雜，而且在生物 體內(nèi)也可能產(chǎn)生其它影響。
[0004] 近兩年發(fā)展出的CRISPR/Cas9技術(shù)使得在所有物種中實現(xiàn)基因組編輯成為可能。 CRISPR/tas9是一種來源于細菌獲得性免疫的由RNA指導(dǎo)化s9蛋白對基因進行編輯和修飾 的新技術(shù)。Jinek等對CRISPR/化s9系統(tǒng)進行人工改造使得該系統(tǒng)能夠更簡單方便地用于基 因編輯(Jinek et al. ,2013)，且能夠?qū)崿F(xiàn)將一對等位基因進行剪切得到純合突變，還可在 目的基因的多個位點設(shè)計多種曲NAW完全敲除目的基因。目前，RNA介導(dǎo)的化s9系統(tǒng)能夠成 功介導(dǎo)細菌、植物細胞、斑馬魚胚胎、小鼠、人源細胞、非人靈長類動物食蟹猴胚胎、甚至人 類廢棄胚胎等的基因組編輯(Cho et al.，2013;Cong et al. ,2013;Jinek et al. ,2013; Mali et al.,2013;Niu et al.,2014;Platt et al.,2014;Shan et al.,2013)，為未來應(yīng) 用于人類遺傳缺陷疾病的治療提供了希望。
[000引轉(zhuǎn)基因技術(shù)及TALEN、CRISPR/Cas9等基因打祀技術(shù)的飛速發(fā)展使得動物疾病模型 的建立不再局限于少數(shù)的模式生物。但運些技術(shù)目前也都存在基因突變嵌合多態(tài)性、基因 敲入同源重組效率較低等不足之處。對于基因修飾的嵌合效應(yīng)問題，小動物模型因生長周 期較短可通過不斷雜交傳代而得到純合突變體。但對于大動物而言，如與人類較為接近的 靈長類動物，其性成熟時間就需要4到5年，妊娠時間長達165天，且目前尚缺乏有效的猴胚 胎干細胞系，因此嵌合效應(yīng)的存在使建立純合基因突變猴等大動物模型具有巨大挑戰(zhàn)性。
[0006] 嵌合突變效應(yīng)的發(fā)生可能由于注射的基因打祀RNA或者蛋白在受精卵胚胎分裂后 仍持續(xù)表達，或轉(zhuǎn)基因病毒未能在單細胞胚胎時期穩(wěn)定轉(zhuǎn)入基因組從而導(dǎo)致胚胎細胞分裂 發(fā)育過程中一部分細胞的基因被修飾，一部分細胞仍維持野生型狀態(tài)的嵌合現(xiàn)象，且在被 修飾的細胞中也可能會產(chǎn)生具有不同基因突變型的嵌合型突變體(Platt et al. ,2014; Sung et al.，2014;Kim et al.，2014)。例如單個受精卵細胞分裂成四細胞時，每個細胞基 因修飾的類型與程度會有所不一，所形成的胚胎組織及新生的動物會在不同的細胞或組織 中攜帶不同的基因修飾類型或有不同程度(單鏈或雙鏈DNA)的基因修飾。此外，胚胎細胞分 裂過程中自身的DNA損傷修復(fù)機制或DNA非同源重組修復(fù)的不同一性等也會影響基因打祀 效率及嵌合效應(yīng)。因此，改進或者發(fā)明能夠克服運些基因修飾技術(shù)的嵌合性缺陷效應(yīng)的方 法對高效建立純合突變的動物疾病模型至關(guān)重要。
[0007] 胚胎分割是指用人工方法將植入前胚胎分割成兩個或多個部分，分割后每個部分 可在適宜的培養(yǎng)條件下繼續(xù)發(fā)育為完整胚胎，該技術(shù)的應(yīng)用能夠增加胚胎移植中的有效胚 胎數(shù)、提高妊娠率、增加克隆后代的數(shù)目。目前運一技術(shù)已在很多動物如小鼠、大鼠、豬、羊、 馬等（Aston et al.,2008;Sc虹amm and Pap;rocki,2004;Tarkowski et al.,2010)哺乳動 物中廣為應(yīng)用，并且在靈長類動物中也得到證實。過去的研究發(fā)現(xiàn)，將恒河猴的2至化細胞階 段的胚胎進行卵裂球分離，并將分離的卵裂球放入空透明帶發(fā)育，重組胚胎可成功發(fā)育至 解化囊胚階段(Mitalipov et al.,2002)<Xhan等（Chan et al.,2000)也在2000年對恒河 猴8八細胞期胚胎分割為四部分，其中兩個卵裂球移植至受體后成功獲得一只由1/4胚胎發(fā) 育而來的猴子Tetra，證明了早期胚胎分離后的卵裂球能夠發(fā)育成正常的胎兒及新生猴。
[0008] 然而在上述實驗中，由4-8細胞的胚胎分離出的卵裂球均含2個不同的胚胎細胞。 采用運樣的卵裂球仍會制備出帶有不同基因修飾體細胞的胚胎及新生動物。運是因為基因 修飾技術(shù)中所存在的嵌合性問題所導(dǎo)致的，即單細胞胚胎階段所注射的基因打祀分子在細 胞分裂過程中不同細胞中發(fā)生不均勻的基因修飾效率。由于轉(zhuǎn)基因 DNA及化s9mRNA的表達 和作用可能在4細胞胚胎階段大為減弱，從4細胞胚胎分離出的單卵裂球繼續(xù)分裂而形成的 胚胎應(yīng)該是在每個單細胞攜帶相同的基因修飾類型。然而，目前尚未有研究報道靈長類動 物中由四細胞階段胚胎分離而來的單個卵裂球能否在體外成功解化至囊胚階段或者該四 細胞階段胚胎來源的單卵裂球移植能否成功發(fā)育出小猴。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明目的在于提供一種能降低嵌合效應(yīng)的胚胎培養(yǎng)方法及轉(zhuǎn)基因動物的制備 方法。
[0010] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種適用于上述方法的培養(yǎng)基。
[0011] 發(fā)明通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的。
[0012] 首先，發(fā)明提供了一種能降低嵌合效應(yīng)的胚胎培養(yǎng)方法。
[0013] 為解決目前動物模型建立中的嵌合效應(yīng)問題，本發(fā)明提供了一種顯著提高基因修 飾精準(zhǔn)度的方法，即：將經(jīng)基因修飾后的動物受精卵培育到四細胞階段，去掉透明帶，再去 掉細胞間連絲，將4細胞胚胎分離為4個單卵裂球，進一步再將單個卵裂球細胞放回到去除 胞質(zhì)的透明帶中，進行體外培養(yǎng)，從而提高基因修飾胚胎的純合性。
[0014] 進一步的轉(zhuǎn)基因動物的制備方法，則可W將上述單個卵裂球培育到二細胞到四細 胞期時，挑選合適的胚胎進行移植，W獲得純合的基因修飾動物模型。
[0015] 為降低嵌合性和提高基因修飾精準(zhǔn)度，本發(fā)明可選地利用毛細管結(jié)合膜酶消化的 方法將四細胞階段的動物胚胎(例如食蟹猴胚胎)分離為四個單卵裂球，再將運四個單卵裂 球細胞分別放回到四個空的透明帶中，在優(yōu)化的體外培養(yǎng)條件下將其培育至桑權(quán)胚或囊 胚。同時，本發(fā)明可選地采用單細胞PCR技術(shù)，能夠分析每個單卵裂球細胞中的基因突變或 修飾類型與程度。經(jīng)胚胎分割后的單卵裂球發(fā)育到四細胞或八細胞階段時，能夠顯著增加 各個細胞中基因修飾類型與程度的相同性。利用本發(fā)明所述方法獲得的胚胎可用于移植， 所獲得的新生動物的毎個體細胞中將攜帶有相同的基因突變類型，從而能建立更能模擬因 基因突變所導(dǎo)致疾病的動物模型。
[0016] 實施方案可選地如下(流程如圖6):
[0017] 1.將實施轉(zhuǎn)基因操作后，發(fā)育至4細胞的動物胚胎分離為4個單卵裂球，并分別放 置于空透明帶中；
[0018] 2.將胚胎轉(zhuǎn)入優(yōu)化的培養(yǎng)體系中；
[0019] 3.從重新發(fā)育至4細胞的胚胎中取出一個卵裂球；
[0020] 4.使用優(yōu)化的PCR條件進行基因型分析；
[0021 ] 5.根據(jù)PCR結(jié)果篩選出適合移植的胚胎；
[0022] 6.胚胎移植，產(chǎn)出純合的轉(zhuǎn)基因動物。
[0023] 作為一個示例性實施例，本發(fā)明將基于CRISPR/Cas9基因修飾后的食蟹猴受精卵 單細胞發(fā)育到四細胞階段，通過酸性臺式液或堿性蛋白酶消化去掉透明帶，并在不含化 2+， Mgh離子的膜酶中消化去掉細胞間連絲，毛細管機械分離4細胞胚胎卵裂球，再將單個卵裂 球細胞放回到去除胞質(zhì)的透明帶中，在優(yōu)化的體外培養(yǎng)條件下:第一，運些再分化的卵裂球 可成功發(fā)育到囊胚;其次，可待發(fā)育到四細胞階段時分出單個卵裂球利用單細胞PCR技術(shù)鑒 定基因打祀純合突變率;第Ξ，待分化的卵裂球發(fā)育到二細胞到四細胞期時，挑選合適的胚 胎進行移植，W獲得純合打祀基因修飾猴模型。
[0024] 本發(fā)明成功