多能干細胞的培養(yǎng)方法、該方法中所使用的多能干細胞的培養(yǎng)用試劑盒及培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種多能干細胞的培養(yǎng)方法、該方法中所使用的多能干細胞的培養(yǎng)用 試劑盒及培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 以損傷組織的功能恢復(fù)等為目的開發(fā)了各種再生醫(yī)療。其中，報告了大量關(guān)于以 組織本身的再生等為最終目的的靈長類尤其人類的全能或多能干細胞的技術(shù)。尤其，誘導(dǎo) 型多能干細胞（iPS細胞)與胚胎干細胞不同是從體細胞誘導(dǎo)，因此具有倫理方面的問題少 的優(yōu)點。
[0003] 在培養(yǎng)這些靈長類的全能或多能干細胞(對這兩者進行統(tǒng)稱，本發(fā)明中簡稱為"多 能干細胞"。）的情況下，要求在未分化狀態(tài)下經(jīng)長期維持。為了長期培養(yǎng)未分化狀態(tài)的多能 干細胞，通常使用小鼠成纖維細胞等飼養(yǎng)細胞。
[0004] 然而，指出因使用如所述小鼠成纖維細胞的來源于異種動物的飼養(yǎng)細胞，培養(yǎng)液 中可能混入來源于異種動物的抗原性物質(zhì)等的異物。因此，在將全能或多能干細胞用于醫(yī) 療用途或與此相當?shù)挠猛镜那闆r下，要求將這些細胞在不存在飼養(yǎng)細胞的條件下進行培 養(yǎng)。
[0005] 鑒于這種情況，進行了代替飼養(yǎng)細胞功能的細胞粘附性材料的開發(fā)。例如Nature Biotechnology ,2001，Vol 19，pp .971-974中公開了作為飼養(yǎng)細胞的代替物使用小鼠肉瘤 提取成分即基質(zhì)膠，始終良好地對維持了未分化狀態(tài)的人胚胎干細胞進行培養(yǎng)。
[0006] 日本專利公開2001-17183號公報中公開有不含飼養(yǎng)細胞且含有增殖的靈長類原 始細胞的細胞性組合物，作為優(yōu)選方式公開有還含有細胞外基質(zhì)的細胞性組合物。并且，日 本專利公開2010-29186號公報中公開有以含有規(guī)定濃度的細胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)及水性溶劑 的涂布溶液，進一步涂布已進行等離子體聚合的細胞培養(yǎng)表面的細胞培養(yǎng)基質(zhì)，并且記載 有根據(jù)該細胞培養(yǎng)基質(zhì)具有有助于避免胚胎干細胞的分化的良好的粘附性。
[0007] Biomaterials，2010，Nov;Vol.31(32)，ρρ·8281_8288及Nature biotec hnology, 2010，Vol. 28，No.6，pp.606-610中分別公開有由可有助于胚胎干細胞的長期培養(yǎng)的玻連蛋 白部分序列構(gòu)成的重組肽或合成肽，具體而言，天然玻連蛋白的第1個~第52個氨基酸序列 (參考Biomaterials,2010，Nov;Vol.31(32)，ρρ·8281-8288)及包含RGD序列的第41 個~第 52個氛基酸序列（參考Nature biotechnology，2010，Vol · 28，Νο · 6，ρρ · 606-610)。已知由于 這些肽為非生物體試料，因此能夠避免混入抗原性物質(zhì)等的可能性，且可進行工業(yè)生產(chǎn)這 一點上優(yōu)異。
[0008] 并且，對于在未分化狀態(tài)下培養(yǎng)多能干細胞的培養(yǎng)基，例如，日本專利公表2013-510567號公報中公開有包含抗壞血酸、堿性成纖維細胞生長因子(bF GF)的無血清及不含 異種成分的培養(yǎng)基。
[0009] 發(fā)明的概要
[0010]發(fā)明要解決的技術(shù)課題
[0011] 雖然發(fā)現(xiàn)如日本專利公開2001-17183號公報、日本專利公開2010-29186號公報、 Nature Biotechnology,2001,Vo119,pp.971-974nBiomaterials,2010,Nov；Vo1.31(32), pp · 8281-8288及Nature biotechnology, 2010 ,Vol · 28 ,No · 6 ,pp · 606-610中所公開的可代 替飼養(yǎng)細胞的材料，或如日本專利公表2013-510567號公報中所公開的適合于多能干細胞 培養(yǎng)的培養(yǎng)基，但要求具有更優(yōu)異的多能干細胞的細胞培養(yǎng)性能的培養(yǎng)方法。
[0012] 因此本發(fā)明的目的在于提供一種多能干細胞的細胞培養(yǎng)性能尤其細胞增殖能力 優(yōu)異的多能干細胞的培養(yǎng)方法、該方法中所使用的多能干細胞的培養(yǎng)用試劑盒及培養(yǎng)基。
[0013] 用于解決技術(shù)課題的手段
[0014] 本發(fā)明人等為了解決所述課題，對多能干細胞的培養(yǎng)方法，不斷進行深入研究的 結(jié)果，發(fā)現(xiàn)通過使用包含人玻連蛋白或人玻連蛋白的規(guī)定的部分氨基酸序列的多肽與包含 規(guī)定量的抗壞血酸衍生物的培養(yǎng)基培養(yǎng)多能干細胞，多能干細胞的細胞培養(yǎng)性能尤其細胞 增殖能力優(yōu)異，由此完成了本發(fā)明。
[0015] 即，本發(fā)明的多能干細胞的培養(yǎng)方法包含：
[0016] 在支撐體的細胞培養(yǎng)表面賦予(a)具有由序列號1表示的氨基酸序列的多肽，
[0017] (b)具有與由序列號1表示的氨基酸序列的同源性為80%以上的氨基酸序列且具 有多能干細胞的培養(yǎng)性能的多肽、或
[0018] (c)具有序列號1中缺失、取代或附加1或數(shù)個(優(yōu)選1~5個)氨基酸的氨基酸序列 且具有多能干細胞的培養(yǎng)性能的多肽，
[0019] 以獲得多肽包覆培養(yǎng)表面的階段;及
[0020] 在所述多肽包覆培養(yǎng)表面上接種多能干細胞并使用抗壞血酸衍生物的含量為 1.5mmol/L(mM)以上的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的階段。
[0021] 并且，本發(fā)明的其他多能干細胞的培養(yǎng)方法包含：
[0022] 在支撐體的細胞培養(yǎng)表面賦予下述(d)的多肽，以獲得多肽包覆培養(yǎng)表面的階段， (d)包含：
[0023] (1)包含選自由CSYYQSC(序列號2)表示的氨基酸序列及由RGD表示的氨基酸序列 中的至少一個的第1區(qū)域、及
[0024] (2)包含（2-i)由 PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQN(序列號 3)表示的氨基酸序 列、（2-ii)與由序列號3表示的氨基酸序列具有80%以上的同源性且具有對支撐體的細胞 培養(yǎng)表面的吸附能力的氨基酸序列、或(2-iii)相對由序列號3表示的氨基酸序列缺失、取 代或附加1或數(shù)個(優(yōu)選1~5個)氨基酸殘基且具有對支撐體的細胞培養(yǎng)表面的吸附能力的 氨基酸序列的第2區(qū)域，
[0025] 且由40個~450個氨基酸殘基構(gòu)成;及
[0026] 在所述多肽包覆培養(yǎng)表面上接種多能干細胞并使用抗壞血酸衍生物的含量為 1.5mmol/L(mM)以上的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的階段。
[0027] 本發(fā)明的多能干細胞的培養(yǎng)用試劑盒，其由
[0028] (a)具有由序列號1表示的氨基酸序列的多肽、
[0029] (b)具有與由序列號1表示的氨基酸序列的同源性為80%以上的氨基酸序列且具 有多能干細胞的培養(yǎng)性能的多肽、或
[0030] (c)具有序列號1中缺失、取代或附加 1或數(shù)個(優(yōu)選1~5個)氨基酸的氨基酸序列 且具有多能干細胞的培養(yǎng)性能的多肽、及
[0031] 抗壞血酸衍生物的含量為1.5mm〇l/L(mM)以上的培養(yǎng)基構(gòu)成。
[0032] 并且，本發(fā)明的其他的多能干細胞的培養(yǎng)用試劑盒，其由
[0033]下述（d)的多肽及抗壞血酸衍生物的含量為1.5mmol/L(mM)以上的培養(yǎng)基構(gòu)成， (d)包含：
[0034] (1)包含選自由CSYYQSC(序列號2)表示的氨基酸序列及由RGD表示的氨基酸序列 中的至少一個的第1區(qū)域、及
[0035] (2)包含（2-i)由 PRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQN (序列號 3)表示的氨基酸序 列、（2-ii)與由序列號3表示的氨基酸序列具有80%以上的同源性且具有對支撐體的細胞 培養(yǎng)表面的吸附能力的氨基酸序列、或(2-iii)相對由序列號3表示的氨基酸序列缺失、取 代或附加1或數(shù)個(優(yōu)選1~5個)氨基酸殘基且具有對支撐體的細胞培養(yǎng)表面的吸附能力的 氨基酸序列的第2區(qū)域，
[0036] 且由40個~450個氨基酸殘基構(gòu)成。
[0037]本發(fā)明的培養(yǎng)基為抗壞血酸衍生物的含量為1.5mm〇l/L(mM)以上的培養(yǎng)基。
[0038]發(fā)明效果
[0039]根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種多能干細胞的細胞培養(yǎng)性能尤其細胞增殖能力優(yōu)異的 多能干細胞的培養(yǎng)方法、該方法中所使用的多能干細胞的培養(yǎng)用試劑盒及培養(yǎng)基。
【附圖說明】
[0040] 圖1是表示本發(fā)明所涉及的各多肽的培養(yǎng)板表面的吸附試驗結(jié)果的曲線圖。
[0041] 圖2是表示使用本發(fā)明所涉及的各多肽的iPS細胞的增殖曲線的曲線圖。
[0042]圖3A是在本發(fā)明所涉及的各多肽上進行了培養(yǎng)時的iPS細胞集落的形態(tài)圖像(左 欄)及放大圖像(右欄）。
[0043]圖3B是在本發(fā)明所涉及的各多肽上進行了培養(yǎng)時的iPS細胞集落的形態(tài)圖像(左 欄)及放大圖像(右欄）。
[0044] 圖3C是在本發(fā)明所涉及的各多肽上進行了培養(yǎng)時的iPS細胞集落的形態(tài)圖像(左 欄)及放大圖像(右欄）。
[0045] 圖3D是在本發(fā)明所涉及的各多肽上進行了培養(yǎng)時的iPS細胞集落的形態(tài)圖像(左 欄)及放大圖像(右欄）。
[0046] 圖3E是在本發(fā)明所涉及的各多肽上進行了培養(yǎng)時的iPS細胞集落的形態(tài)圖像(左 欄)及放大圖像(右欄）。
[0047]圖4A是在本發(fā)明所涉及的各多肽上進行了培養(yǎng)時的iPS細胞的DAPI染色圖像(左 欄)及NAN0G染色圖像(右欄）。
[0048]圖4B是在本發(fā)明所涉及的各多肽上進行了培養(yǎng)時的iPS細胞的DAPI染色圖像(左 欄)及NAN0G染色圖像(右欄）。
[0049] 圖4C是在本發(fā)明所涉及的各多肽上進行了培養(yǎng)時的iPS細胞的DAPI染色圖像(左 欄)及NAN0G染色圖像(右欄）。
[0050] 圖4D是在本發(fā)明所涉及的各多肽上進行了培養(yǎng)時的iPS細胞的DAPI染色圖像(左 欄)及NANOG染色圖像(右欄）。
[0051]圖4E是在本發(fā)明所涉及的各多肽上進行了培養(yǎng)時的iPS細胞的DAPI染色圖像(左 欄)及NAN0G染色圖像(右欄）。
【具體實施方式】
[0052]以下，對本發(fā)明的實施方式進行詳細的說明。
[0053] < 多肽 >
[0054] 本發(fā)明所涉及的多肽為(a)具有由序列號1表示的氨基酸序列的多肽、
[0055] (b)具有與由序列號1表示的氨基酸序列的同源性為80%以上的氨基酸序列且具 有多能干細胞的培養(yǎng)性能的多肽、或
[0056] (c)具有序列號1中缺失、取代或附加 1或數(shù)個氨基酸的氨基酸序列且具有多能干 細胞的培養(yǎng)性能的多肽。
[0057] 序列號1:
[0058] DQESCKGRCTEGFNVDKKCQCDELCSYYQSCCTDYTAECKPQVTRGDVFTMPEDEYTVYDDGEEKNNATVHEQVGGP SLTSDLQAQSKGNPEQTPVLKPEEEAPAPEVGASKPEGIDSRPETLHPGRPQPPAEEELCSGKPFDAFTDLKNGSLF AFRGQYCYELDEKAVRPGYPKLIRDVWGIEGPIDAAFTRINCQGKTYLFKGSQYWRFEDGVLDPDYPRNISDGFDGI PDNVDAALALPAHSYSGRERVYFFKGKQYWEYQFQHQPSQEECEGSSLSAVFEHFAMMQRDSWEDIFELLFWGRTSA GTRQPQFISRDWHGVPGQVDAAMAGRIYISGMAPRPSLAKKQRFRHRNRKGYRSQRGHSRGRNQNSRRPSRATWLSL FSSEESNLGANNYDDYRMDWLVPATCEPIQSVFFFSGDKYYRVNLRTRRVDTVDPPYPRSIAQYWLGCPAPGHL
[0059] 在此，"具有多能干細胞的培養(yǎng)性能"是指具有多能干細胞的增殖活性，可通過如 下進行對于是否具有增殖活性的評價，例如在吸附該多肽的細胞培養(yǎng)表面上接種多能干細 胞使其細胞密度達到250cell S/孔，并培養(yǎng)8天后用PBS清洗方式除去非粘附細胞時，粘附細 胞是否存在2500cellS/孔(接種細胞數(shù)的10倍)以上。
[0060] 在此粘附細胞數(shù)的定量可通過對多能干細胞所表現(xiàn)的堿性磷酸酶的活性進行定 量的方法或MTT試驗等來進行定量。
[0061] 由上述序列號1所表示的全長495氨基酸殘基構(gòu)成的多肽為玻連蛋白，在本發(fā)明 中，玻連蛋白是指人玻連蛋白。另外，確認了天然的玻連蛋白為序列的一部分中具有糖鏈的 糖蛋白質(zhì)。
[0062]以下，本說明書中，有時將本發(fā)明所涉及的多肽稱為"培養(yǎng)用多肽"。
[0063]在本說明書中"工序"這一用語，不只是獨立的工序，即使無法與其他工序明顯地 區(qū)別的情況下也能夠?qū)崿F(xiàn)本工序所期望的目的，則也包含在本用語中。
[0064] 并且，在本說明書中用"~"來表示的數(shù)值范圍表示分別將"~"的前后所記載的數(shù) 值作為最小值及最大值來包含的范圍。
[0065] 并且，在本說明書中，對于組合物中的各成分的量，在存在多個相當于組合物中各 成分的物質(zhì)時，若無特別說明，表示組合物中存在的該多個物質(zhì)的總量。
[0066] 本申請說明書中，"1或數(shù)個"表示例如"1個~5個"。
[0067] 在本說明書中，"同種"是指人，"異種"是指除人以外的動物。
[0068] 本說明書中，有時將氨基酸序列中的氨基酸殘基以本技術(shù)領(lǐng)域中周知的單字母標 記(例如，將甘氨酸殘基標記為"G"）或三字母標記(例如，將甘氨酸殘基標記為"Gly"）來進 行標記。
[0069]本發(fā)明中，對于與多肽的氨基酸序列有關(guān)的"％"，若無特別說明，以氨基酸(或亞 氨基酸)殘基的個數(shù)為基準。
[0070] 在本說明書中，對于氨基酸序列的特定氨基酸殘基所使用的"對應(yīng)的氨基酸殘基" 等的表述是指將進行對比的兩個以上氨基酸序列，以本技術(shù)領(lǐng)域中周知的方法，在插入、缺 失及取代考慮在內(nèi)的基礎(chǔ)上，以相等的氨基酸殘基達到最多的方式進行排列(對齊)時，與 成為基準的氨基酸序列中的特定氨基酸殘基的位置一致的其他氨基酸序列中的氨基酸殘 基。
[0071] 有關(guān)本說明書中的氨基酸序列的"同源性"可以是指使用BLAST軟件包（參考 Ausubel等，1999Short Protocols in Molecular Biology，4thEd_C hapter 18)計算的 值。例如，相對序列號1的同源性為80%以上是指BLAST中的Max. Identities的值為80以上。
[0072] (b)的多肽優(yōu)選為具有與由序列號1表示的氨基酸序列的同源性為90%以上（即 90%~100%)的氨基酸序列且具有多能干細胞的培養(yǎng)性能的多肽，更優(yōu)選為具有與由序列 號1表示的氨基酸序列的同源性為95%以上（即95%~100%)的氨基酸序列且具有多能干 細胞的培養(yǎng)性能的多肽。
[0073]并且，（c)的多肽優(yōu)選為具有序列號1中缺失、取代或附加1~5個氨基酸的氨基酸 序列且具有多能干細胞的培養(yǎng)性能的多肽。
[0074]本發(fā)明所涉及的多肽優(yōu)選為(al)由序列號1所表示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽、 [0075] (bl)由與序列號1所表示的氨基酸序列的同源性為80%以上（即80%~100%)的 氨基酸序列構(gòu)成且具有多能干細胞的培養(yǎng)性能的多肽、或
[0076] (cl)由序列號1中缺失、取代或附加 1或數(shù)個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成且具有