一種間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基、細(xì)胞分離培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，它包括如下體積配比的成分：DMEM/F12 94～97份、人血小板裂解物2～5份、非必需氨基酸1份。本發(fā)明還提供了所述培養(yǎng)基的用途，及一種間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基，可用于有效分離培養(yǎng)胎盤及臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，效果優(yōu)于市售培養(yǎng)基，而且成本低、安全性高，應(yīng)用前景良好。
【專利說明】
一種間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基、細(xì)胞分離培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基、細(xì)胞分離培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類來源于中胚層的多能干細(xì)胞，具有高度自我更新和多系分化潛能，它在特定誘導(dǎo)條件下可分化為多種類型的組織細(xì)胞，是細(xì)胞移植和組織工程的良好種子細(xì)胞，應(yīng)用前景非常廣闊。
[0003]根據(jù)來源劃分，MSCs可分為兩大類:一類是成體組織來源的MSCs，如骨髓和脂肪組織；另一類是胎兒/圍產(chǎn)期組織來源的MSCs，如胎盤、臍帶等。成體組織來源的MSCs由于增殖潛能有限很難大規(guī)模生產(chǎn)用于臨床治療，而胎兒/圍產(chǎn)期組織來源的MSCs則不存在這樣的缺陷，更有可能為臨床應(yīng)用提供理想的間充質(zhì)干細(xì)胞來源。
[0004]現(xiàn)有的從胎盤、臍帶中獲取間充質(zhì)干細(xì)胞的技術(shù)尚不完善，仍存在分離使用的培養(yǎng)基成分復(fù)雜或含有胎牛血清等動物源性成分、分離成功率低、分離成本高等缺點，使分離的細(xì)胞不利于臨床應(yīng)用。例如公開號為CN103243071A的專利申請公開了一種用于間充質(zhì)干細(xì)胞分離及培養(yǎng)的培養(yǎng)基，雖然其不含有血清，但培養(yǎng)基中含有多種維生素、金屬離子及其它成分，配制復(fù)雜，且成本高。公開號為CN103805562A的專利申請也面臨同樣的高成本問題。
[0005]因此，目前迫切需要對分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法進行改進，以滿足實際應(yīng)用的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基及細(xì)胞分離培養(yǎng)方法。
[0007]本發(fā)明提供了一種間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，它包括如下體積配比的成分:DMEM/F1294?97份、人血小板裂解物2?5份、非必需氨基酸I份。
[0008]其中，它包括如下體積配比的成分:DMEM/F1297份、人血小板裂解物2份、非必需氨基酸I份。
[0009]進一步地，所述人血小板裂解物購自MiI Iipore公司；所述非必需氨基酸購自Gibco公司。
[0010]DMEM/F12:為液體培養(yǎng)基，可通過購買市售產(chǎn)品獲得;也可購買干粉培養(yǎng)基配制；也可將F12培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基以1:1混合制備。
[0011]人血小板裂解物(HPL)、非必需氨基酸可通過購買市售產(chǎn)品獲得，也可采用現(xiàn)在文獻報道方法制備。
[0012]本發(fā)明還提供了上述無血清培養(yǎng)基在分離培養(yǎng)人胎盤或臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中的用途。
[0013]其中，所述胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞為胎盤羊膜、絨毛膜和/或基蛻膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0014]本發(fā)明還提供了一種間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，它包括如下步驟:
[0015]a、取人胎盤組織或臍帶組織，無菌條件下，將所取組織剪成小塊；
[0016]b、清洗步驟a的小塊組織，剪碎，加入上述無血清培養(yǎng)基，貼壁培養(yǎng)6天；
[0017]C、換液，此后每4天換液，直至細(xì)胞匯合度達到80?90%，即可。
[0018]其中，步驟c后，還包括消化傳代步驟:取細(xì)胞進行胰酶消化傳代，培養(yǎng)至第三代細(xì)胞，即可。
[0019]其中，步驟a中，所述胎盤組織為胎盤的羊膜、絨毛膜和/或基蛻膜。
[0020]其中，步驟b中，所述清洗用生理鹽水;所述剪碎為剪成I?3mm3的碎塊;優(yōu)選地，剪碎為手動進行。
[0021]人工手動方式將胎盤組織或臍帶組織剪成極小的碎塊(l-3mm3)，既與組織剪碎機獲得的小碎塊無顯著差異，又避免了組織在剪碎機機械剪碎時過熱影響到細(xì)胞活性，極為利于直接接種到培養(yǎng)皿之后細(xì)胞向組織外地游移，從而實現(xiàn)貼壁生長。
[0022]其中，步驟b中，所述培養(yǎng)是在溫度為37°C、體積分?jǐn)?shù)為5%的C02、飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中進行。
[0023]本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，可用于有效分離培養(yǎng)胎盤及臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，效果甚至優(yōu)于市售培養(yǎng)基。而且本發(fā)明培養(yǎng)基成分簡單，不使用動物血清，完全排除了動物源成分的干擾，安全性高，方便應(yīng)用于臨床。
[0024]本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，可以從人胎盤、臍帶中高效獲得間充質(zhì)干細(xì)胞;而且本發(fā)明方法操作簡單、制備時間短;成本低、不使用任何蛋白酶制劑;分離培養(yǎng)效率尚，適用于大規(guī)模細(xì)胞制備，應(yīng)用前景良好。
[0025]顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0026]以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0027]圖1為絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)圖；
[0028]圖2為絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞流式表型圖；
[0029]圖3為絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞成脂、成骨和成軟骨分化圖；成脂分化用油紅O染色，成骨分化用茜素紅染色，成軟骨分化用阿爾新藍染色；
[0030]圖4為羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)圖；
[0031 ]圖5為基蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)圖；
[0032]圖6為羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞流式表型圖；
[0033]圖7為基蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞流式表型圖；
[0034]圖8為羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞成脂、成骨和成軟骨分化圖；成脂分化用油紅O染色，成骨分化用茜素紅染色，成軟骨分化用阿爾新藍染色；
[0035]圖9為基蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞成脂、成骨和成軟骨分化圖；成脂分化用油紅O染色，成骨分化用茜素紅染色，成軟骨分化用阿爾新藍染色；
[0036]圖10為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)圖；
[0037]圖11為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞流式表型圖；
[0038]圖12為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成脂、成骨和成軟骨分化圖；成脂分化用油紅O染色，成骨分化用茜素紅染色，成軟骨分化用阿爾新藍染色；
[0039]圖13為羊膜(AM)、絨毛膜(CP)和臍帶(HU)來源間充質(zhì)干細(xì)胞分別用市售無血清培養(yǎng)基(Lonza)和本發(fā)明培養(yǎng)基(HPL培養(yǎng)基)培養(yǎng)圖，從第5代培養(yǎng)到第9代的平均群體倍增時間比較。
【具體實施方式】
[0040]下面以實施例作進一步說明，但本發(fā)明不局限于這些實施例。
[0041 ]本發(fā)明所用的實驗試劑與儀器如下:
[0042]實驗試劑:DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco，貨號:11039-021 )、人血小板裂解物(HPL，Millipore，貨號:SCM141)、非必需氨基酸(Gibco，貨號:11140-050)、生理鹽水、0.25%的胰酶-EDTA(Gibco，貨號:25200-056)、成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Gibco，貨號:A10070-01)、成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Gibco，貨號:A10072-01)、成軟骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Gibco，貨號:A10071-01)
[0043]儀器及器材:生物安全柜、敷料鑷、組織鑷、不銹鋼敷料盒、電動移液器、移液管、離心管、培養(yǎng)皿、眼科剪。
[0044]實施例1本發(fā)明無血清培養(yǎng)基的配制
[0045]取DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基97mL，加入人血小板裂解物2mL、非必需氨基酸lmL，無菌過濾，即可，于4°C保存。
[0046]實施例2本發(fā)明無血清培養(yǎng)基的配制
[0047]取DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基94mL，加入人血小板裂解物5mL、非必需氨基酸lmL，無菌過濾，即可，于4°C保存。
[0048]實施例3本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定(胎盤)
[0049]—、分離培養(yǎng)方法
[0050]1、采集人類胎盤(在產(chǎn)婦簽署知情同意書的前提下，剖腹產(chǎn)和順產(chǎn)皆可，不做無菌要求)，低溫冰盒運送。
[0051 ] 2、胎盤絨毛膜板取材和接種:
[0052]I)高溫消毒手術(shù)器械和大號不銹鋼敷料盒，同時紫外線消毒生物安全柜；
[0053]2)嚴(yán)格篩選供者，血液化驗排除傳染病(包括艾滋病，甲、乙、丙型肝炎和梅毒)；
[0054]3)將胎盤浸泡于裝有預(yù)冷生理鹽水的大號不銹鋼敷料盒，以下步驟均在無菌條件下進行，剝除絨毛膜板上的羊膜后，從絨毛膜板上剪下5 X 5cm的方塊，用生理鹽水清洗組織數(shù)次，洗干凈絨毛膜板殘留血液；
[0055]4)將清洗干凈的絨毛膜板組織轉(zhuǎn)移至無菌的10mm培養(yǎng)皿中，手動剪碎成Imm3的碎塊，分別鋪勻于其余1個I OOmm培養(yǎng)皿中，小心加入少量完全培養(yǎng)基(即實施例1制備的無血清培養(yǎng)基)，使培養(yǎng)液既能覆蓋絨毛膜組織碎片，又不至于使其漂浮起來，置于37 V、飽和濕度5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0056]3、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的擴增與傳代:
[0057]I)培養(yǎng)過程中觀察可見細(xì)胞從組織塊邊緣逐漸游移出來，并進一步實現(xiàn)貼壁生長和增殖，在培養(yǎng)的第7天全部更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；
[0058]2)此后每4天換一次培養(yǎng)液，直到細(xì)胞長滿80?90%培養(yǎng)皿底面積，便進行胰酶消化傳代；
[0059]3)胰酶消化傳代:吸棄培養(yǎng)液，用生理鹽水清洗細(xì)胞兩次，盡量去除貼壁的組織塊，每皿加入I毫升質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.25%的胰酶-EDTA在37°C消化5分鐘左右，待細(xì)胞懸浮后每個培養(yǎng)皿加入I毫升完全培養(yǎng)基以中和胰酶反應(yīng)，1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，再懸浮于完全培養(yǎng)基中，按照5000?10000個細(xì)胞/cm2培養(yǎng)底面積接種傳代到新T75培養(yǎng)瓶中；傳代培養(yǎng)即可。
[0060]二、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的冷凍保存和復(fù)蘇[0061 ] 步驟如下:
[0062]1、取培養(yǎng)至第三代的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(細(xì)胞長滿90?100%培養(yǎng)瓶底面積)，用生理鹽水洗兩次以洗掉HPL殘留，0.25 %胰酶-EDTA消化，每瓶T75用2毫升，37 °C，5分鐘，待細(xì)胞懸浮后每個T75加入2毫升完全培養(yǎng)基以中和胰酶反應(yīng)。在1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；
[0063]2、再按細(xì)胞密度1.2?2 XlOVmL左右懸浮于細(xì)胞凍存液中，分裝到2mL凍存管中，使用程控降溫儀緩慢降溫凍存，再轉(zhuǎn)移到液氮罐中長期保存?zhèn)溆?所述細(xì)胞凍存液組成:總質(zhì)量1 %的DMSO，總質(zhì)量90 %的完全培養(yǎng)基；
[0064]3、使用細(xì)胞前，將凍存管中細(xì)胞在37°C水浴中迅速解凍，再轉(zhuǎn)移至裝有1mL預(yù)冷完全培養(yǎng)基的離心管中，在1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，吸棄上清，再用生理鹽水洗兩遍，最后用完全培養(yǎng)基重懸，接種到新T75培養(yǎng)瓶中，置于37°C、飽和濕度5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0065]三、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定
[0066]1、鑒定方法
[0067]胰酶消化傳到第三代時，用顯微鏡鑒定所獲細(xì)胞的形態(tài)，用流式細(xì)胞儀鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的純度:
[0068]胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記物包括:陽性標(biāo)記物有⑶73，CD90和⑶105，陰性標(biāo)記物有CDl4，CD34，CD45和HLA-DR；
[0069](間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記物參見文獻DominiciM et al.,Minimal criteria fordefining multipotentmesenchymaI stromal cells.The Internat1nal Society forCellular Therapy posit1n statement?Cytotherapy?2006?8(4):315-317)
[0070]分化鑒定:成脂、成骨和成軟骨分化；
[0071]成脂、成骨和成軟骨分化:以4X14細(xì)胞/孔接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24小時后細(xì)胞貼壁，棄去培養(yǎng)液。分別按下述方式誘導(dǎo):
[0072]I)加入成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每3天換液I次，共誘導(dǎo)21天。棄掉培養(yǎng)液，PBS洗2次，10 %甲醛固定30分鐘。PBS再洗3次。加入0.2 %油紅O染液，37 °C染色30分鐘。吸出染液回收，PBS洗3次。顯微鏡下觀察并照相。
[0073]2)加入成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每3天換液I次，共誘導(dǎo)21天。棄上清，PBS清洗I遍，4%多聚甲醛室溫固定30min。棄多聚甲醛，PBS清洗2遍，2%茜素紅(pH4.2，使用前過濾)室溫30min。棄茜素紅，PBS清洗至上清無顏色或淺色，最后加入PBS，顯微鏡下觀察并拍照。
[0074]3)加入成軟骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每3天換液I次，共誘導(dǎo)21天。棄上清，PBS清洗I遍，4%多聚甲醛室溫固定30min。棄多聚甲醛，PBS清洗2遍，0.1N HCL室溫潤洗5min。棄0.1N HCL，I %阿爾新藍室溫30min。棄亞甲基藍，0.1N HCL潤洗3次，加入蒸餾水中和酸性，顯微鏡下觀察并拍照。
[0075]2、鑒定結(jié)果
[0076]I)形態(tài)學(xué)鑒定
[0077]顯微鏡下可觀察到細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)為典型的紡錘形(見圖1)，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)。
[0078]2)細(xì)胞活率及表面標(biāo)記鑒定
[0079]流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞活率達到90%以上，陽性標(biāo)記純度達到95%以上，陰性標(biāo)記純度在2 %以下(見圖2)，符合間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記。
[0080]3)分化能力鑒定
[0081]本發(fā)明所獲得的細(xì)胞可以通過誘導(dǎo)向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞定向分化(見圖3)，具備間充質(zhì)干細(xì)胞的多系分化能力。
[0082]可見，本發(fā)明得到的細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0083]實施例4本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定(胎盤)
[0084]—、分離培養(yǎng)方法
[0085]1、采集人類胎盤(在產(chǎn)婦簽署知情同意書的前提下，剖腹產(chǎn)和順產(chǎn)皆可，不做無菌要求)，低溫冰盒運送。
[0086]2、胎盤羊膜和基蛻膜的取材和接種:
[0087]I)高溫消毒手術(shù)器械和大號不銹鋼敷料盒，同時紫外線消毒生物安全柜；
[0088]2)嚴(yán)格篩選供者，血液化驗排除傳染病(包括艾滋病，甲、乙、丙型肝炎和梅毒)；
[0089]3)胎盤羊膜的取材和接種
[0090]將胎盤浸泡于裝有預(yù)冷生理鹽水的大號不銹鋼敷料盒，以下步驟均在無菌條件下進行，將胎盤臍帶面向上，剝除絨毛膜板上的羊膜后，從羊膜上剪下5X5cm的方塊，用生理鹽水清洗組織數(shù)次，洗干凈殘留血液；
[0091 ]將清洗干凈的羊膜組織轉(zhuǎn)移至無菌的10mm培養(yǎng)皿中，手動剪碎成Imm3的碎塊，分別鋪勻于其余10個10mm培養(yǎng)皿中，小心加入少量完全培養(yǎng)基(即實施例1制備的無血清培養(yǎng)基)，使培養(yǎng)液既能覆蓋羊膜組織碎片，又不至于使其漂浮起來，置于37°C、飽和濕度5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0092]4)胎盤基蛻膜的取材和接種
[0093]再將胎盤臍帶面向下，小心剝除絨毛膜上的基蛻膜，收集到足夠量(7g)的基蛻膜后，用生理鹽水清洗組織數(shù)次，洗干凈殘留血液；
[0094]將清洗干凈的基蛻膜組織轉(zhuǎn)移至無菌的10mm培養(yǎng)皿中，手動剪碎成Imm3的碎塊，分別鋪勻于其余10個10mm培養(yǎng)皿中，小心加入少量完全培養(yǎng)基(即實施例1制備的無血清培養(yǎng)基)，使培養(yǎng)液既能覆蓋基蛻膜組織碎片，又不至于使其漂浮起來，置于37°C、飽和濕度5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0095]3、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的擴增與傳代
[0096]I)培養(yǎng)過程中觀察可見細(xì)胞從組織塊邊緣逐漸游移出來，并進一步實現(xiàn)貼壁生長和增殖，在培養(yǎng)的第7天全部更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；
[0097]2)此后每4天換一次培養(yǎng)液直到細(xì)胞長滿80?90%培養(yǎng)皿底面積，便進行胰酶消化傳代；
[0098]3)胰酶消化傳代:吸棄培養(yǎng)液，用生理鹽水清洗細(xì)胞兩次，盡量去除貼壁的組織塊，每皿加入I毫升質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.25%的胰酶-EDTA在37°C消化5分鐘左右，待細(xì)胞懸浮后每個培養(yǎng)皿加入I毫升完全培養(yǎng)基以中和胰酶反應(yīng)，1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，再懸浮于完全培養(yǎng)基中，按照5000?10000個細(xì)胞/cm2培養(yǎng)底面積接種傳代到新T75培養(yǎng)瓶中；傳代培養(yǎng)即可。
[0099]二、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的冷凍保存和復(fù)蘇
[0100]步驟如下:
[0101]1、取培養(yǎng)至第三代的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(細(xì)胞長滿90?100%培養(yǎng)瓶底面積)，用生理鹽水洗兩次以洗掉HPL殘留，0.25 %胰酶-EDTA消化，每瓶T75用2毫升，37 °C，5分鐘，待細(xì)胞懸浮后每個T75加入2毫升完全培養(yǎng)基以中和胰酶反應(yīng)。在1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；
[0102]2、再按細(xì)胞密度1.2?2 XlOVmL左右懸浮于細(xì)胞凍存液中，分裝到2mL凍存管中，使用程控降溫儀緩慢降溫凍存，再轉(zhuǎn)移到液氮罐中長期保存?zhèn)溆?所述細(xì)胞凍存液組成:總質(zhì)量1 %的DMSO，總質(zhì)量90 %的完全培養(yǎng)基；
[0103]3、使用細(xì)胞前，將凍存管中細(xì)胞在37°C水浴中迅速解凍，再轉(zhuǎn)移至裝有1mL預(yù)冷完全培養(yǎng)基的離心管中，在1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，吸棄上清，再用生理鹽水洗兩遍，最后用完全培養(yǎng)基重懸，接種到新T75培養(yǎng)瓶中，置于37°C、飽和濕度5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0104]三、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定
[0105]胰酶消化傳到第三代時，用顯微鏡鑒定所獲細(xì)胞的形態(tài)，用流式細(xì)胞儀鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的純度:
[0106]胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記物包括:陽性標(biāo)記物有⑶73，CD90和⑶105，陰性標(biāo)記物有CDl4，CD34，CD45和HLA-DR；
[0107]分化鑒定:成脂、成骨和成軟骨分化；
[0108]成脂、成骨和成軟骨分化:以4X14細(xì)胞/孔接種于6孔板內(nèi)。培養(yǎng)24小時后細(xì)胞貼壁，棄去培養(yǎng)液。分別按下述方式誘導(dǎo):
[0109]I)加入成脂分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每3天換液I次，共誘導(dǎo)21天。棄掉培養(yǎng)液，PBS洗2次，10 %甲醛固定30分鐘。I3BS再洗3次。加入0.2 %油紅O染液，37 °C染色30分鐘。吸出染液回收，PBS洗3次。顯微鏡下觀察并照相。
[0110]2)加入成骨分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每3天換液I次，共誘導(dǎo)21天。棄上清，PBS清洗I遍，4%多聚甲醛室溫固定30min。棄多聚甲醛，PBS清洗2遍，2%茜素紅(pH4.2，使用前過濾)室溫30min。棄茜素紅，PBS清洗至上清無顏色或淺色，最后加入PBS，顯微鏡下觀察并拍照。
[0111]3)加入成軟骨分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每3天換液I次，共誘導(dǎo)21天。棄上清，PBS清洗I遍，4%多聚甲醛室溫固定30min。棄多聚甲醛，I3BS清洗2遍，0.1N HCL室溫潤洗5min。棄0.1N HCL，I %阿爾新藍室溫30min。棄亞甲基藍，0.1N HCL潤洗3次，加入蒸餾水中和酸性，顯微鏡下觀察并拍照。
[0112]2、鑒定結(jié)果
[0113]I)形態(tài)學(xué)鑒定
[0114]顯微鏡下可觀察到細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)為典型的紡錘形(見圖4、5)，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)。
[0115]2)細(xì)胞活率及表面標(biāo)記鑒定
[0116]流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞活率達到90%以上，陽性標(biāo)記純度達到95%以上，陰性標(biāo)記純度在2%以下(見圖6、7)，符合間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記。
[0117]3)分化能力鑒定
[0118]本發(fā)明所獲得的細(xì)胞可以通過誘導(dǎo)向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞定向分化(見圖8、9)，具備間充質(zhì)干細(xì)胞的多系分化能力。
[0119]可見，本發(fā)明得到的細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0120]實施例5本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定(臍帶)
[0121]—、分離培養(yǎng)方法
[0122]1、采集人類臍帶(在產(chǎn)婦簽署知情同意書的前提下，剖腹產(chǎn)和順產(chǎn)皆可，不做無菌要求)，低溫冰盒運送。
[0123]2、臍帶取材和接種:
[0124]I)高溫消毒手術(shù)器械，同時紫外線消毒生物安全柜；
[0125]2)嚴(yán)格篩選供者，血液化驗排除傳染病(包括艾滋病，甲、乙、丙型肝炎和梅毒)；
[0126]3)將臍帶浸泡于裝有預(yù)冷生理鹽水的10mm培養(yǎng)皿中，以下步驟均在無菌條件下進行，從臍帶上剪下2cm長的一段，用生理鹽水清洗組織數(shù)次，洗干凈殘留血液；
[0127]4)將清洗干凈的臍帶組織轉(zhuǎn)移至無菌的10mm培養(yǎng)皿中，手動剪碎成2?3mm3的碎塊，分別鋪勻于其余5個10mm培養(yǎng)皿中，小心加入少量完全培養(yǎng)基(即實施例1制備的無血清培養(yǎng)基)，使培養(yǎng)液既能覆蓋臍帶組織碎片，又不至于使其漂浮起來，置于37°C、飽和濕度5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0128]3、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的擴增與傳代
[0129]I)培養(yǎng)過程中觀察可見細(xì)胞從組織塊邊緣逐漸游移出來，并進一步實現(xiàn)貼壁生長和增殖，在培養(yǎng)的第7天全部更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；
[0130]2)此后每4天換一次培養(yǎng)液，直到細(xì)胞長滿80?90%培養(yǎng)皿底面積，便進行胰酶消化傳代；
[0131]3)胰酶消化傳代:吸棄培養(yǎng)液，用生理鹽水清洗細(xì)胞兩次，盡量去除貼壁的組織塊，每皿加入I毫升質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.25%的胰酶-EDTA在37°C消化5分鐘左右，待細(xì)胞懸浮后每個培養(yǎng)皿加入I毫升完全培養(yǎng)基以中和胰酶反應(yīng)，1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，再懸浮于完全培養(yǎng)基中，按照5000?10000個細(xì)胞/cm2培養(yǎng)底面積接種傳代到新T75培養(yǎng)瓶中；傳代培養(yǎng)即可。
[0132]二、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的冷凍保存和復(fù)蘇
[0133]步驟如下:
[0134]1、取培養(yǎng)至第三代的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(細(xì)胞長滿90?100%培養(yǎng)瓶底面積)，用生理鹽水洗兩次以洗掉HPL殘留，0.25 %胰酶-EDTA消化，每瓶T75用2毫升，37 °C，5分鐘，待細(xì)胞懸浮后每個T75加入2毫升完全培養(yǎng)基以中和胰酶反應(yīng)。在1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；
[0135]2、再按細(xì)胞密度1.2?2 XlOVmL左右懸浮于細(xì)胞凍存液中，分裝到2mL凍存管中，使用程控降溫儀緩慢降溫凍存，再轉(zhuǎn)移到液氮罐中長期保存?zhèn)溆?所述細(xì)胞凍存液組成:總質(zhì)量1 %的DMSO，總質(zhì)量90 %的完全培養(yǎng)基；
[0136]3、使用細(xì)胞前，將凍存管中細(xì)胞在37°C水浴中迅速解凍，再轉(zhuǎn)移至裝有1mL預(yù)冷完全培養(yǎng)基的離心管中，在1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，吸棄上清，再用生理鹽水洗兩遍，最后用完全培養(yǎng)基重懸，接種到新T75培養(yǎng)瓶中，置于37°C、飽和濕度5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0137]三、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定
[0138]1、鑒定方法
[0139]胰酶消化傳到第三代時，用顯微鏡鑒定所獲細(xì)胞的形態(tài)，用流式細(xì)胞儀鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的純度:
[0140]臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記物包括:陽性標(biāo)記物有⑶73，CD90和⑶105，陰性標(biāo)記物有CDl4，CD34，CD45和HLA-DR；
[0141]分化鑒定:成脂、成骨和成軟骨分化；
[0142]成脂、成骨和成軟骨分化:以4X14細(xì)胞/孔接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24小時后細(xì)胞貼壁，棄去培養(yǎng)液。分別按下述方式誘導(dǎo):
[0143]I)加入成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每3天換液I次，共誘導(dǎo)21天。棄掉培養(yǎng)液，PBS洗2次，10 %甲醛固定30分鐘。PBS再洗3次。加入0.2 %油紅O染液，37 °C染色30分鐘。吸出染液回收，PBS洗3次。顯微鏡下觀察并照相。
[0144]2)加入成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每3天換液I次，共誘導(dǎo)21天。棄上清，PBS清洗I遍，4%多聚甲醛室溫固定30min。棄多聚甲醛，PBS清洗2遍，2%茜素紅(pH4.2，使用前過濾)室溫30min。棄茜素紅，PBS清洗至上清無顏色或淺色，最后加入PBS，顯微鏡下觀察并拍照。
[0145]3)加入成軟骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每3天換液I次，共誘導(dǎo)21天。棄上清，PBS清洗I遍，4%多聚甲醛室溫固定30min。棄多聚甲醛，PBS清洗2遍，0.1N HCL室溫潤洗5min。棄0.1N HCL，I %阿爾新藍室溫30min。棄亞甲基藍，0.1N HCL潤洗3次，加入蒸餾水中和酸性，顯微鏡下觀察并拍照。
[0146]2、鑒定結(jié)果
[0147]I)形態(tài)學(xué)鑒定
[0148]顯微鏡下可觀察到細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)為典型的紡錘形(見圖10)，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)。
[0149]2)細(xì)胞活率及表面標(biāo)記鑒定
[0150]流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞活率達到90%以上，陽性標(biāo)記純度達到95%以上，陰性標(biāo)記純度在2 %以下(見圖11)，符合間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記。
[0151]3)分化能力鑒定
[0152]本發(fā)明所獲得的細(xì)胞可以通過誘導(dǎo)向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞定向分化(見圖12)，具備間充質(zhì)干細(xì)胞的多系分化能力。
[0153]可見，本發(fā)明得到的細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0154]以下用實驗例的方式說明本發(fā)明的有益效果:
[0155]實驗例I本發(fā)明培養(yǎng)基與市售無血清培養(yǎng)基的效果比較
[0156]用本發(fā)明培養(yǎng)基與市售無血清培養(yǎng)基(品牌:Lonza，貨號:00192125)同時培養(yǎng)羊膜、絨毛膜和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，分別檢測從第5代開始培養(yǎng)到第9代的平均群體倍增時間、細(xì)胞形態(tài)。
[0157]結(jié)果:本發(fā)明培養(yǎng)基，與市售無血清培養(yǎng)基相比，培養(yǎng)的細(xì)胞在形態(tài)上保持一致，無明顯差異。
[0158]在群體倍增時間上，用本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的平均群體倍增時間與市售無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的同類組織細(xì)胞相當(dāng)；而羊膜和絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞的平均群體倍增時間顯著低于用市售無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的同類組織細(xì)胞(見圖13)。
[0159]結(jié)果表明，使用本發(fā)明培養(yǎng)基，可促進羊膜和絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞快速增殖，更適于間充質(zhì)干細(xì)胞生長，總體效果優(yōu)于市售無血清培養(yǎng)基。
[0160]綜上，本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，可用于有效分離培養(yǎng)胎盤及臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，效果優(yōu)于市售培養(yǎng)基，而且成本低、安全性高。本發(fā)明的分離培養(yǎng)方法，可以從人胎盤、臍帶中高效獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，適用于大規(guī)模細(xì)胞制備，應(yīng)用前景良好。
【主權(quán)項】
1.一種間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于，它包括如下體積配比的成分: DMEM/F1294?97份、人血小板裂解物2?5份、非必需氨基酸I份。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無血清培養(yǎng)基，其特征在于:它包括如下體積配比的成分: DMEM/F1297份、人血小板裂解物2份、非必需氨基酸I份。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無血清培養(yǎng)基，其特征在于:所述人血小板裂解物購自MiIIipore公司；所述非必需氨基酸購自Gibco公司。4.權(quán)利要求1-3任意一項所述的無血清培養(yǎng)基在分離培養(yǎng)人胎盤或臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中的用途。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于:所述胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞為胎盤羊膜、絨毛膜和/或基蛻膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。6.一種間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:它包括如下步驟: a、取人胎盤組織或臍帶組織，無菌條件下，將所取組織剪成小塊； b、清洗步驟a的小塊組織，剪碎，加入權(quán)利要求1-3任意一項所述的無血清培養(yǎng)基，貼壁培養(yǎng)6天； c、換液，此后每4天換液，直至細(xì)胞匯合度達到80?90%，即可。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟c后，還包括消化傳代步驟:取細(xì)胞進行胰酶消化傳代，培養(yǎng)至第三代細(xì)胞，即可。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟a中，所述胎盤組織為胎盤的羊膜、絨毛膜和/或基蛻膜。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟b中，所述清洗用生理鹽水;所述剪碎為剪成I?3mm3的碎塊;優(yōu)選地，剪碎為手動進行。10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟b中，所述培養(yǎng)是在溫度為370C、體積分?jǐn)?shù)為5 %的CO2、飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中進行。
【文檔編號】C12N5/0775GK105950550SQ201610578158
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月21日
【發(fā)明人】伍明俊, 陳瑤瑤, 周敏, 鄒慶, 陳強
【申請人】四川新生命干細(xì)胞科技股份有限公司