一種豬極小胚胎樣干細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及干細(xì)胞工程、組織工程與生物起搏等領(lǐng)域，特別是涉及干細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景
[0002]極小胚胎樣干細(xì)胞(verysmall embryonic-like stem cells,VSELs)于2006年由美國(guó)肯塔基州路易斯維爾大學(xué)M.Ratajczak教授等從小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞中成功分離并命名，細(xì)胞表型為Sca-l(+)lin(_)⑶45(_)，直徑2-4μπι。該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)人骨髓、臍帶血、外周血、腦、心肌、腎臟、胰腺等組織中同樣存在，細(xì)胞表型為SSEA-4+/0ct-4 +/CD133+/CXCR4+/Lin-/CD45-，直徑為4-6μπι。人和鼠VSELs的生物學(xué)特性主要包括:較血小板大，紅細(xì)胞小，細(xì)胞核大，含常染色質(zhì)，表達(dá)原始多能干細(xì)胞標(biāo)志Oct-4和Nanog，可以向三個(gè)胚層分化，且無免疫排異與倫理問題，被認(rèn)為具有替代胚胎干細(xì)胞的潛力。由于VSELs在一般體外培養(yǎng)條件下極易分化且體外很難擴(kuò)增，甚至引起一些學(xué)者的質(zhì)疑。加州斯坦福大學(xué)Wei ssman按照Ratajczak團(tuán)隊(duì)最初所描述的方法重復(fù)實(shí)驗(yàn)并廣泛分析，盡管在他的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這些小細(xì)胞，但其并沒有像多能干細(xì)胞那樣，在體外聚集成球，也無法擴(kuò)增。M.Rata jczak團(tuán)隊(duì)研究結(jié)果也表明人或鼠的VSELs數(shù)量均極少(只占骨髓單個(gè)核細(xì)胞的0.01%-0.04%)，故即使存在VSELs，其極低的數(shù)量級(jí)也成為VSELs進(jìn)入臨床的瓶頸。因此，如何改進(jìn)培養(yǎng)和鑒定技術(shù)是VSELs研究中急需解決的問題。另外，迄今為止，尚缺乏大型偶蹄動(dòng)物VSELs的成功培養(yǎng)與鑒定報(bào)道或?qū)＠陥?bào)。
[0003]經(jīng)典的培養(yǎng)基有很多種，其中DMEM、F12、RPMI1640、MEM、DMEM/F12都是應(yīng)用最廣泛的非飼養(yǎng)層培養(yǎng)基，但由于VSELs類似于胚胎干細(xì)胞，維持其生長(zhǎng)代謝所需的營(yíng)養(yǎng)須十分充足，因此單純采用上述培養(yǎng)基體外培養(yǎng)VSELs很難擴(kuò)增且極易分化。乳豬成肌細(xì)胞飼養(yǎng)層以其易于取材、更能模擬體內(nèi)環(huán)境，給成體VSELs提供足夠營(yíng)養(yǎng)并抑分化效果好等特點(diǎn)，優(yōu)于上述廣泛應(yīng)用的飼養(yǎng)層。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]因此，針對(duì)目前極小胚胎樣干細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增困難、效率低、易分化、純度不高，難以鑒定以及迄今為止尚缺乏大型偶蹄類動(dòng)物VSELs分離、培養(yǎng)與鑒定的報(bào)道等突出問題。本發(fā)明提供了一種VSELs培養(yǎng)與鑒定方法，為VSELs的進(jìn)一步研究提供了重要的技術(shù)保障。
[0005]豬極小胚胎樣干細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，技術(shù)方案為:將分離、純化后得到的豬骨髓極小胚胎樣干細(xì)胞接種于鋪有成肌細(xì)胞飼養(yǎng)層的培養(yǎng)板中，用RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，置于37°C、5% C02的培養(yǎng)箱中，并添加雙抗(青-鏈霉素儲(chǔ)存液)、白血病抑制因子(LIF)、堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、干細(xì)胞因子(SCF)等細(xì)胞因子進(jìn)行培養(yǎng)，每2天更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)9至11天可以進(jìn)行傳代。
[0006]在本申請(qǐng)?zhí)峤恢?，本課題組已經(jīng)提交了一種豬極小胚胎樣干細(xì)胞分離與純化方法的發(fā)明專利申請(qǐng)，申請(qǐng)?zhí)?201510909419.3.，本發(fā)明將分離、純化后得到的極小胚胎樣干細(xì)胞接種于成肌細(xì)胞飼養(yǎng)層加以培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，及時(shí)更換培養(yǎng)液，3天呈現(xiàn)聚集趨勢(shì)，至5天形成類似細(xì)胞克隆的細(xì)胞集落，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞集落增大，數(shù)量也有所增加，可獲得擴(kuò)增且未分化的極小胚胎樣干細(xì)胞;而無飼養(yǎng)層組則不能形成類似細(xì)胞克隆的細(xì)胞集落且10天仍無明顯細(xì)胞擴(kuò)增。
[0007]作為本方法的優(yōu)選，所添加雙抗(青-鏈霉素儲(chǔ)存液)是取青、鏈霉素各100萬單位溶于lOOmLPBS緩沖液中。
[0008]作為本方法的優(yōu)選，所述的成肌細(xì)胞飼養(yǎng)層，其制備包括如下步驟:
一是乳豬成肌細(xì)胞分離，步驟包括:
將乳豬麻醉后，無菌條件下分離新生乳豬的骨骼肌樣本，用PBS清洗，并盡量剔除表面結(jié)締組織;將骨骼肌組織樣本剪成1 mm3的小塊置于離心管中，加入lg/L的膠原蛋白酶Π，置于37 °C恒溫水浴中消化，20?40分鐘后，1200 rpm離心6分鐘，棄上清;加入0.25%胰蛋白酶消化液，取上清液加入等體積含有10?15%胎牛血清的DMEM終止消化，剩余組織可重復(fù)消化1次;輕輕吹打細(xì)胞懸液，盡量吹散細(xì)胞，用400目過濾篩過濾，1200 rpm離心6分鐘，棄去上清液。用新鮮DMEM液洗2?3次，1200 rpm離心6分鐘；用10?15%胎牛血清+ 10%馬血清的F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng);培養(yǎng)1.5?2小時(shí)后，將上清液移于另一培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，以去除非肌原性細(xì)胞;培養(yǎng)5?6天，細(xì)胞生長(zhǎng)至80 %貼壁，可以進(jìn)行傳代;棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞3次，加入適量0.25%胰酶消化3?5分鐘，用含有10 %胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，1200 rpm離心6分鐘，用F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)皿中，置于37 °C，5 % C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng);40分鐘后，將上清液移于另一培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。
二是乳豬成肌細(xì)胞飼養(yǎng)層制備，步驟包括:
將傳至3代細(xì)胞的培養(yǎng)基吸出，加入適量絲裂霉素C，培養(yǎng)1?2小時(shí)后，棄去絲裂霉素C溶液，用清洗7?8次，加入適量0.25%胰酶消化液消化3?5分鐘，用含有10 %胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，1200 rpm離心6分鐘，用培養(yǎng)基重懸清洗細(xì)胞2次，1200 rpm離心6分鐘，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于96孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng);觀察到細(xì)胞融合至60 %左右，即獲得成肌細(xì)胞飼養(yǎng)層。
[0009]作為本方法的進(jìn)一步優(yōu)選，所選取用于麻醉的為出生2-4天的乳豬，雌雄不限，由揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均受到人道對(duì)待，符合美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用指南》。實(shí)驗(yàn)方案獲得揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)和江蘇省蘇北人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
[0010]作為本方法的進(jìn)一步優(yōu)選，上述所用的0.25%胰蛋白酶，是將0.25g胰蛋白酶溶于lOOmLPBS緩沖液中，調(diào)整PH值至7.2，使用0.22um微孔濾膜過濾除菌，分裝后置于_20°C環(huán)境中，常溫下應(yīng)用。
[0011]作為本方法的進(jìn)一步優(yōu)選，所應(yīng)用到的PBS緩沖液(不含Ca、Mg)，是取Na2HP04.12H20 1.4425g，KH2P04 0.1g，NaCl 4g，KCl 0.lg，溶解于500mL新制備的超純水中，定容后調(diào)整PH至7.2，高壓滅菌后，保存在4°C環(huán)境中。
[0012]本發(fā)明同時(shí)提供了3種方法鑒定分離或培養(yǎng)的豬VSELs。具體為:
1、透射電鏡鑒定豬VSELs的方法，步驟包括:將分離或培養(yǎng)后的⑶45 (-) CD133 ( + )lin (-)的單核細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞收集、固化、包埋進(jìn)行透視電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)。
[0013]2、免疫熒光鑒定豬VSELs的方法，步驟包括:將分離或培養(yǎng)后的VSELs培養(yǎng)液從培養(yǎng)孔板中吸出，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS潤(rùn)洗3次;0.2% Triton X -100透膜處理20min，PBS潤(rùn)洗3次;含10% FBS的封閉2 h;分別在不同孔中加一抗SSEA_1、S0X_2、0CT-4、NAN0G，4°C冰箱過夜;過夜細(xì)胞孵育后，分別加入相對(duì)應(yīng)的二抗;添加0.5%Tween 20的roS溶液(PBS-T)潤(rùn)洗3次，每次5min，滴加二抗，37°C溫育2 h(避光);PBS-T潤(rùn)洗3次，每次5min；5ng/yL DAPI常溫下染色2 min;熒光顯微鏡觀察;堿性磷酸酶(AKP)染色將熒光染色后的細(xì)胞孔板中的培養(yǎng)液吸出，加入配置好的堿性磷酸酶染色液，放在倒置顯微鏡下觀察。
[0014]3、基因水平鑒定豬VSELs方法，步驟包括:
一是RNA提取。包括先將細(xì)胞懸液收集至離心管中，lOOOrpm，6-8min，之后用PBS重懸細(xì)胞，重復(fù)三遍以達(dá)到清洗細(xì)胞的目的，按1 X 107細(xì)胞加入lmL TRIZ0L試劑；將上述樣品于15-30°C(常規(guī)室溫即可)靜置5min，使蛋白質(zhì)充分解離;加入0.2mL氯仿，蓋緊蓋子，充分劇烈振蕩15s并于15_30°C靜置2_3min;于2_8°C12000rpm離心15min。離心后樣品分層，上層水相中含RNA，下層有機(jī)相中含蛋白和DNA;取上清，加入0.5mL異丙醇，輕輕混勻，于15-30°C靜置lOmin后，在管底會(huì)出現(xiàn)膠狀沉淀，即為RNA;于4°C 12000rpm離心lOmin后，棄上清；向沉淀中加入lmL 75%乙醇，輕輕混勾；于4°C 7500rpm離心5min后，棄上清；將RNA樣品瞭干，加入適量去離子甲酰胺溶解(可于55-60°C促溶lOmin);
二是反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，步驟包括:制備gDNA去除反應(yīng)體系，將5XgDNA Buffer 2μΚTotal RNA -、RNase_FreeddH20補(bǔ)足至10μ1混合均勾，簡(jiǎn)短離心，于42°C孵育3min，至于冰上備用；制備反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:將 10 XFast RT Buffer 2μKRT Enzyme Mix lyl、FQ-RTPrimer Mix 2μ1、RNase_FreeddH20補(bǔ)足至10μ1混合；將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中的Mix加到gDNA去除步驟的反應(yīng)液中，充分混勻；42°C孵育15min，95°C孵育3min，得到的cDNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，或-20°C保存；
三是熒光定量PCR，步驟包括:建立20 μ?反應(yīng)體系，將2 X Super Real Pre Mix Plus10μ1、50 XROX Reference Dye _、模板-，正、反向引物各0.6μ1 和RNase-Free ddH20補(bǔ)足至20μ1混合，在室溫下平衡并徹底混勻，離心。設(shè)置熒光定量檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)；建立20 μ?反應(yīng)體系，將Template <lyl、Primer 1 lpKPrimer 2 1μΚ2XTaq PCR MasterMix 12.5μ 1,RNase-Free ddH20補(bǔ)足至25μ1混合均勻；PCR反應(yīng)循環(huán)的設(shè)置:反應(yīng)條件設(shè)置為94°C 3min、94°C 30 sec、56°C 15 sec、72°C 30 sec、72°C 5 min，以上反應(yīng)條件進(jìn)行34 個(gè)循環(huán)；瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)成肌細(xì)