小鼠胚胎成纖維細(xì)胞nih/3t3電轉(zhuǎn)染的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因技術(shù)中細(xì)胞轉(zhuǎn)染領(lǐng)域，尤其涉及一種小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH/3T3 (以下簡稱NIH/3T3細(xì)胞)電轉(zhuǎn)染的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]NIH/3T3是從NIH Swiss小鼠胚胎培養(yǎng)物中建立的高度接觸抑制的連續(xù)細(xì)胞株。為了培育在形態(tài)學(xué)特征上更適合于進(jìn)行轉(zhuǎn)化分析的亞株，建立的NIH/3T3細(xì)胞株又進(jìn)行了五輪以上亞克隆。這株細(xì)胞對DNA轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)染研宄十分有用。
[0003]NIH/3T3細(xì)胞通常采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，操作周期為兩天，然而，脂質(zhì)體試劑本身較為昂貴，且?guī)в卸拘?，也會對?xì)胞的生理活動造成影響。病毒轉(zhuǎn)染方法的準(zhǔn)備程序復(fù)雜，常常用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，在一般實驗室中很難普及，且價格不菲，改造后病毒仍然可能具有侵染性，需考慮安全因素。DEAE-葡聚糖法是帶正電的DEAE-葡聚糖與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞，適應(yīng)細(xì)胞的種類有局限性，操作復(fù)雜，對細(xì)胞也有一定的毒性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡便快捷、對細(xì)胞毒性小且轉(zhuǎn)染效率高的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH/3T3電轉(zhuǎn)染的方法。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH/3T3電轉(zhuǎn)染的方法，采用低滲透壓的電轉(zhuǎn)染緩沖液，對小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH/3T3進(jìn)行一次放電；電轉(zhuǎn)染緩沖液的滲透壓為90?280m0smol/kg，一次放電的電壓為710?1100V，持續(xù)時間為45?75 μ S。
[0006]電轉(zhuǎn)染緩沖液的滲透壓為200?280m0smol/kg。
[0007]一次放電的電壓為700?800V或800?900V或900?1000V或1000?1100V，
持續(xù)時間為75 μ S。
[0008]電轉(zhuǎn)染緩沖液的滲透壓為280m0smol/kg，一次放電的電壓為710V或810V或910V或1100V，持續(xù)時間為75 μ S。
[0009]電轉(zhuǎn)染緩沖液由等滲透壓溶液配制而成；等滲透壓溶液組成為KCl 25mM、KH2PO40.3mM、K2HPO40.85mM、肌醇 280m0smol/kg，ρΗ7.I ?7.3，電導(dǎo)率，25 度 3.2 ?3.8mS/cm ο
[0010]電轉(zhuǎn)染是一種方便簡捷的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，只需普通緩沖鹽溶液即可，周期短，操作只需一天，不會對細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的毒副作用。針對脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、病毒轉(zhuǎn)染和DEAE-葡聚糖法的周期長、成本高、操作繁瑣的問題，發(fā)明人結(jié)合電轉(zhuǎn)染的上述優(yōu)點，建立了一種小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH/3T3電轉(zhuǎn)染的方法，該法主要采用等滲透壓的電轉(zhuǎn)染緩沖液，對小鼠成纖維細(xì)胞NIH/3T3進(jìn)行一次放電，通過等滲透壓和高壓脈沖電場壓組合，使得細(xì)胞體積增大，高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導(dǎo)入細(xì)胞質(zhì)中，從而提高電轉(zhuǎn)效率。實際試驗表明，應(yīng)用本發(fā)明質(zhì)粒pmaxGFP(綠色熒光蛋白)轉(zhuǎn)染到小鼠成纖維細(xì)胞NIH/3T3，轉(zhuǎn)染效率最高可以達(dá)到55%左右。本發(fā)明可以縮短試驗周期，節(jié)約成本，減少繁瑣的操作步驟，并且安全無害，為小鼠成纖維細(xì)胞NIH/3T3細(xì)胞系的后續(xù)研宄提供了關(guān)鍵的技術(shù)支持。
【附圖說明】
[0011]圖1是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NIH/3T3細(xì)胞的熒光顯微鏡圖。
[0012]圖2是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NIH/3T3細(xì)胞不加質(zhì)粒的陰性對照的熒光顯微鏡圖。
[0013]圖3是本發(fā)明電轉(zhuǎn)染(710V)NIH/3T3細(xì)胞的熒光顯微鏡圖。
[0014]圖4是本發(fā)明電轉(zhuǎn)染(810V)NIH/3T3細(xì)胞的熒光顯微鏡圖。
[0015]圖5是本發(fā)明電轉(zhuǎn)染(910V)NIH/3T3細(xì)胞的熒光顯微鏡圖。
[0016]圖6是本發(fā)明電轉(zhuǎn)染(1100V)NIH/3T3細(xì)胞的熒光顯微鏡圖。
[0017]圖7是各種不同條件下轉(zhuǎn)染進(jìn)綠色熒光蛋白的細(xì)胞占總細(xì)胞的比例的柱狀圖。
【具體實施方式】
[0018]采用傳統(tǒng)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和本發(fā)明電轉(zhuǎn)染方法的轉(zhuǎn)染率進(jìn)行對比，同時設(shè)置不轉(zhuǎn)質(zhì)粒的組作為陰性對照。
[0019]一、小鼠成纖維細(xì)胞NIH/3T3電轉(zhuǎn)染的方法
[0020]試驗方法:通過本發(fā)明電轉(zhuǎn)染方法將AMAXA公司的貨號為VPA1001的pmaxGFP (綠色熒光蛋白)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到小鼠成纖維細(xì)胞NIH/3T3，采用熒光顯微鏡拍照計算發(fā)綠色熒光數(shù)目的細(xì)胞以分析轉(zhuǎn)染效率。試驗中包括了對細(xì)胞實施四種不同電壓，采取相同滲透壓的緩沖液以及相同脈沖時長的放電時間。
[0021]試驗設(shè)備:型號eppendorf multiporator，貨號 4308CG831520。
[0022]電轉(zhuǎn)染方法:采用等滲透壓的電轉(zhuǎn)染緩沖液，對小鼠成纖維細(xì)胞NIH/3T3進(jìn)行一次放電；電轉(zhuǎn)染緩沖液的滲透壓為280m0smol/kg，一次放電的電壓分別為710V、810V、910V、1100V，持續(xù)時間為 75 μ S。等滲透壓溶液組成為:KCl,25mM ；KH2P04,0.3mM ；K2HPO40.85mM ;肌醇 280m0smol/kg，ρΗ7.I ?7.3，電導(dǎo)率，25 度 3.2 ?3.8mS/cm。
[0023]具體試驗步驟如下:
[0024]在指數(shù)時期收集細(xì)胞，用280m0smol/kg滲透壓的等滲緩沖液稀釋細(xì)胞，并加入pmaxGFP質(zhì)粒，使其終密度約為2x 16ce 11 s/ml，質(zhì)粒終濃度為20 μ g/ml ;分裝到四個400 μ 1，直徑為2mm的電轉(zhuǎn)杯后，按以下要求施加電壓；
[0025]第一次條件為:電壓710V，滲透壓280m0smol/kg，持續(xù)時間75 μ s ;
[0026]第二次條件為:電壓810V，滲透壓280m0smol/kg，持續(xù)時間75 μ s ;
[0027]第三次條件為:電壓910V，滲透壓280m0smol/kg，持續(xù)時間75 μ s ;
[0028]第四次條件為:電壓1100V，滲透壓280m0smol/kg，持續(xù)時間75 μ S。
[0029]二、小鼠成纖維細(xì)胞ΝΙΗ/3Τ3脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法
[0030]在孔板中先培養(yǎng)細(xì)胞，待其密度約為2X106cellS/ml時，開始進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，將I μ g的質(zhì)粒和I μ I的脂質(zhì)體分別加入50 μ I的optin-DMEM培養(yǎng)基中，靜置5min ;混合均勻后室溫靜置20min，然后加入到孔板中；用optin-DMEM培養(yǎng)基補(bǔ)足剩余的培養(yǎng)基，6h后換液。第二天觀察結(jié)果。
[0031]三、實驗數(shù)據(jù)及結(jié)果
[0032]如圖1至7所示，傳統(tǒng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率在40%左右，而采用本發(fā)明方法隨著電壓不斷地增高，NIH/3T3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率呈梯度增高趨勢，當(dāng)電壓為710V時，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到10%左右，當(dāng)電壓為81V時，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到20%左右，當(dāng)電壓91V時，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到50%左右，當(dāng)電壓為1100V時，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到55%左右，超過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率。
[0033]通過對比數(shù)據(jù)可知，本發(fā)明通過高壓脈沖電場和等滲透壓組合的方式，在對細(xì)胞施加不同電壓后，外源DNA分子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的數(shù)量呈遞增趨勢，在電壓1100V的條件下，NIH/3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)染pmax(綠色熒光蛋白)細(xì)胞學(xué)實驗結(jié)果的轉(zhuǎn)染效率超過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率，達(dá)到55%左右。試驗周期短，成本節(jié)約，操作簡捷，安全無害，為NIH/3T3下一步試驗研宄提供便捷條件。
【主權(quán)項】
1.一種小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH/3T3電轉(zhuǎn)染的方法，其特征在于采用等滲透壓的電轉(zhuǎn)染緩沖液，對小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH/3T3進(jìn)行一次放電；所述電轉(zhuǎn)染緩沖液的滲透壓為280m0smol/kg，一次放電的電壓為710?1100V，持續(xù)時間為45?75 μ S。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞ΝΙΗ/3Τ3電轉(zhuǎn)染的方法，其特征在于:所述電轉(zhuǎn)染緩沖液的滲透壓為280m0smol/kg。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH/3T3電轉(zhuǎn)染的方法，其特征在于:所述一次放電的電壓為700?800V或800?900V或900?1000V或1000?1100V，持續(xù)時間為75 μ S。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞ΝΙΗ/3Τ3電轉(zhuǎn)染的方法，其特征在于:所述電轉(zhuǎn)染緩沖液的滲透壓為280m0smol/kg，一次放電的電壓為710V或810V或910V或1100￥，持續(xù)時間為75 4 8。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH/3T3電轉(zhuǎn)染的方法，其特征在于:所述電轉(zhuǎn)染緩沖液由等滲透壓溶液配制而成；所述等滲透壓溶液組成為KCl 25mM、KH2PO40.3mM、K2HPO40.85mM、肌醇 280m0smol/kg，ρΗ7.I ?7.3，電導(dǎo)率，25 度 3.2 ?3.8mS/cm ο
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH/3T3電轉(zhuǎn)染的方法，該法主要采用等滲透壓的電轉(zhuǎn)染緩沖液，對小鼠成纖維細(xì)胞NIH/3T3進(jìn)行一次放電，通過等滲透壓和高壓脈沖電場壓組合，使得細(xì)胞體積增大，高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導(dǎo)入細(xì)胞質(zhì)中，從而提高電轉(zhuǎn)效率。實際試驗表明，應(yīng)用本發(fā)明質(zhì)粒pmaxGFP(綠色熒光蛋白)轉(zhuǎn)染到小鼠成纖維細(xì)胞NIH/3T3，轉(zhuǎn)染效率最高可以達(dá)到55％左右。本發(fā)明可以縮短試驗周期，節(jié)約成本，減少繁瑣的操作步驟，并且安全無害，為小鼠成纖維細(xì)胞NIH/3T3細(xì)胞系的后續(xù)研究提供了關(guān)鍵的技術(shù)支持。
【IPC分類】C12N15/87
【公開號】CN104975045
【申請?zhí)枴緾N201510280081
【發(fā)明人】周磊, 鄒知明, 崔涵, 李一星
【申請人】廣西大學(xué)
【公開日】2015年10月14日
【申請日】2015年5月27日