構(gòu)建重組mva病毒的帶有標(biāo)記基因自刪除系統(tǒng)的穿梭載體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及在基于痘苗病毒高度減毒毒株MVA的活載體疫苗 的構(gòu)建中，一種穿梭質(zhì)粒的設(shè)計(jì)與應(yīng)用，特別涉及一種構(gòu)建重組MVA病毒的帶有標(biāo)記基因 自刪除系統(tǒng)的穿梭載體。
【背景技術(shù)】
[0002] MVA(modified vaccinia virus Ankara改良型痕苗病毒安卡拉株）是高度減毒的 痘苗病毒毒株，是在人類尋求高度減毒的痘苗病毒作為天花疫苗的過程中獲得的。來源于 一個(gè)土耳其的痕苗病毒毒株 CVA (chorioallantois vaccinia virus Ankara)。CVA 在雞成 纖維細(xì)胞中傳代371代后，發(fā)現(xiàn)其生長特性已經(jīng)發(fā)生了改變，在傳代516代后改名為MVA。 與CVA相比，在雞成纖維細(xì)胞中傳代570代以后，MVA失去了在絕大部分哺乳動(dòng)物細(xì)胞中感 染和復(fù)制的能力。分析基因圖譜發(fā)現(xiàn)，在傳代的過程中MVA丟失了大約30KB的病毒基因，這 些基因大多與病毒的毒力和宿主選擇范圍密切相關(guān)。在體外研宄中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)痘苗病毒感染 細(xì)胞后，早期基因轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致病毒DNA復(fù)制，之后調(diào)芐基因和晚期基因表達(dá)。繼而，病毒DNA被 包裝到不成熟的蛋白粒子中成為有感染性的細(xì)胞內(nèi)成熟的粒子。MVA在允許細(xì)胞（BHK-21， CEF等）內(nèi)可以完成完整的生活周期，而在非允許細(xì)胞中，停止在了這個(gè)過程的某個(gè)步驟之 中。在人細(xì)胞內(nèi)，MVA起始了復(fù)制，但是不能繁殖生長而產(chǎn)生有感染性的成熟顆粒，從而使 之具有了良好的安全性。
[0003] MVA作為活載體疫苗的載體具有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢：（I)MVA在傳代過程中丟失了六個(gè) 主要的基因，在這六個(gè)刪除基因的部位可以用來插入外源基因，并且在外源基因插入后并 不影響病毒本身的感染能力和表達(dá)能力。（2)免疫原性高。外源蛋白基因在被病毒載體遞 送到體內(nèi)后，基因被忠實(shí)表達(dá)，并且能夠進(jìn)行正確的轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后的加工與修飾。表 達(dá)的蛋白具有天然的構(gòu)象與生物活性。較蛋白疫苗相比，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)而持久的體 液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。（3)MVA作為天花疫苗，在上個(gè)世紀(jì)七十年代，在消滅天花的戰(zhàn)役 中，成功的用于預(yù)防天花。并且已經(jīng)對超過120000人進(jìn)行了免疫，這些接受MVA接種的人群 只有小部分人有輕度的與之相關(guān)的副反應(yīng)發(fā)生（如：紅腫、發(fā)熱和流感樣癥狀）。MVA已經(jīng) 在動(dòng)物模型和人體試驗(yàn)中得到了很好的安全性評價(jià)，沒有引發(fā)任何的由于接種引起的嚴(yán)重 臨床疾病。總的來說，MVA穩(wěn)定性好，安全性高，并且能表達(dá)大的外源蛋白。MVA可以模仿病 毒感染，產(chǎn)生適當(dāng)?shù)奈ｋU(xiǎn)信號，并且誘導(dǎo)強(qiáng)而持久的細(xì)胞免疫應(yīng)答。這種復(fù)制缺陷的病毒提 供了滅活疫苗的特性但是卻有活疫苗的免疫原性，使之成為活載體疫苗的重要候選病毒。
[0004] 目前以MVA為活病毒載體正在進(jìn)行臨床研宄的主要是由四種病原物質(zhì)引起的感 染性疾病和腫瘤，分別是：HIV，HCV，HPV和結(jié)核分枝桿菌。到2012年底，以針對HIV感染的 MVA為活載體的疫苗大約有10個(gè)分別進(jìn)入I期或II期臨床研宄。針對HPV引起的子宮頸 癌的治療的MVA活載體疫苗有2個(gè)進(jìn)入了 II期臨床研宄。針對HCV感染的MVA活載體疫 苗有兩個(gè)已經(jīng)進(jìn)行到II期臨床研宄，此外還有一個(gè)針對HBV感染的MVA疫苗進(jìn)入了 IIa期 臨床研宄，一個(gè)結(jié)核桿菌的MVA疫苗進(jìn)入了 I期臨床。
[0005] 鑒于此，快速準(zhǔn)確的構(gòu)建攜帶有外源目標(biāo)基因的MVA病毒成為病毒載體疫苗的各 項(xiàng)工作的首要任務(wù)。MVA基因組龐大，外援基因的引入主要依靠病毒基因組與攜帶有外源目 標(biāo)基因的穿梭載體之間的隨機(jī)同源重組來完成。穿梭載體在與MVA基因組發(fā)生同源重組獲 得重組MVA病毒后，隨同目的基因轉(zhuǎn)入載體的還有標(biāo)記基因。利用標(biāo)記基因可以從大量非 轉(zhuǎn)化細(xì)胞中將陽性重組克隆篩選出來。但隨著重組病毒的傳代，標(biāo)記基因變得不再用，卻仍 在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。這些基因一旦進(jìn)入機(jī)體，對機(jī)體的影響很難確定，產(chǎn)生安全性隱患。同時(shí)也 是在今后藥品報(bào)批等過程中所不允許的。因此，構(gòu)建帶有標(biāo)記基因自刪除系統(tǒng)的穿梭質(zhì)粒， 在痘苗病毒MVA的應(yīng)用中的基礎(chǔ)與關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種構(gòu)建重組MVA病毒 的帶有標(biāo)記基因自刪除系統(tǒng)的穿梭載體，該穿梭質(zhì)粒載體，帶有標(biāo)記基因自刪除系統(tǒng)的同 時(shí)又能轉(zhuǎn)染和表達(dá)外源基因。
[0007] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0008] 構(gòu)建重組MVA病毒的帶有標(biāo)記基因自刪除系統(tǒng)的穿梭載體，該穿梭載體攜帶有痘 苗病毒胸腺激酶的側(cè)翼序列TKR與TKL，能插入外源目標(biāo)病毒基因的多克隆位點(diǎn)MCS，以及 啟動(dòng)插入的外源基因高效表達(dá)痘苗病毒早晚啟動(dòng)子P7. 5,還攜帶有兩端帶有同源序列的自 刪除標(biāo)記基因系統(tǒng)。
[0009] 進(jìn)一步的，所述自刪除標(biāo)記基因系統(tǒng)包括標(biāo)記基因啟動(dòng)子：痘苗病毒啟動(dòng)子Pll， 標(biāo)記基因 EGFP，以及兩者外側(cè)的同源序列。
[0010] 進(jìn)一步的，該穿梭載體還攜帶有抗性篩選標(biāo)記基因。
[0011] 進(jìn)一步的，該抗性篩選標(biāo)記基因?yàn)橛糜诖┧筚|(zhì)粒載體在大腸桿菌中的氨芐抗性篩 選。
[0012] 進(jìn)一步的，其序列為SEQ ID No. 1。該重組載體以EGFP基因?yàn)槠鹗迹?-721位為 EGFP基因序列，722-850為EGFP基因的啟動(dòng)子Pl 1，第850-1267位為TKL'序列，1267-1529 為啟動(dòng)多克隆位點(diǎn)中插入的外源序列的啟動(dòng)子P7. 5。1530-1595為具有BamHI、Sail、BglI、 Apnl、Kpnl、Notl、EcoRI七個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)（MCS)。第1596-2532 位為TKR序列，第2533-5161位為與質(zhì)粒復(fù)制與抗性（氨芐抗性）相關(guān)的基因序列。第 5162-5897 位為 TKL 序列。
[0013] 一種構(gòu)建重組MVA病毒的帶有標(biāo)記基因自刪除系統(tǒng)的穿梭載體的方法，包括如下 步驟：
[0014] 步驟一：設(shè)計(jì)引物 P-EGFP-I :5' -CCGCTCGAGGATGGTGAGCA AGGGCGAGG-3' 和 P-EGFP-2 :5' -CCCATCGAT TTATTATTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3'，并以 pEGFP-C3 質(zhì)粒上的 EGFP基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR，通過PCR反應(yīng)獲得兩端攜帶有XhoI和ClaI兩個(gè)限制性內(nèi)切酶 的酶切位點(diǎn)的EGFP基因，片段為745bp ;
[0015] 步驟二：以pSCll質(zhì)粒為出發(fā)質(zhì)粒。分析pSCll質(zhì)粒后發(fā)現(xiàn)在不影響其他原件的 功能的情況下，有兩個(gè)酶切位點(diǎn)XhoI和ClaI正好處于LacZ基因的兩側(cè)。將pSCll質(zhì)粒與 PCR產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行XhoI和ClaI雙酶切；酶切產(chǎn)物回收后以T4DNA連接酶連接；將連接后的 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5 α ;并進(jìn)行PCR鑒定、酶切鑒定與基因序列的測定；
[0016] 步驟三：在Pll與P7. 5兩個(gè)啟動(dòng)子之間插入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。
[0017] Pll與P7. 5是痘苗病毒的兩個(gè)高效啟動(dòng)子，在pSCll質(zhì)粒中這兩個(gè)啟動(dòng)子位置相 鄰方向相反，分別啟動(dòng)標(biāo)記基因 LacZ和MCS中連接的外源基因的表達(dá)。在兩個(gè)啟動(dòng)子之間 插入限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，用于插入TKL的同源序列以進(jìn)行分子內(nèi)同源重組而刪除標(biāo) 記基因。本研宄中插入的DNA序列為：CTTAAGTGTACAACTAGTGCTAGC下劃線為：Af III與NheI 兩個(gè)酶切位點(diǎn)。
[0018] 步驟四：在Pll與P7.5兩個(gè)啟動(dòng)子之間插入TKL的同源序列TKL'。設(shè)計(jì)引物 Ρ-homo-l和P-homo-2,引物兩端分別攜帶有AflII與NheI酶切位點(diǎn)（見引物表）。以p SCll質(zhì)粒上的TKL序列為模板進(jìn)行PCR，獲得序列為418bp。再利用AflII與NheI兩種酶 同時(shí)酶切上一步獲得的質(zhì)粒與PCR產(chǎn)物并回收。再將回收產(chǎn)物利用T4DNA連接酶連接，即 得到穿梭質(zhì)粒載體。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞