專利名稱：表達(dá)gp64基因的新型基因工程重組病毒的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物殺蟲劑的遺傳改良領(lǐng)域，具體涉及一種在桿狀病毒組II核多角體病毒(group II NPV)中表達(dá)組I核多角體病毒(group I NPV)的囊膜糖蛋白基因的構(gòu)建方法。該表達(dá)組I核多角體病毒(group I NPV)毒株由中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中科院微生物研究所，100101)。保藏日期是2011年6月24日，保藏號(hào)為CGMCC No :4976。
背景技術(shù)：
桿狀病毒的天然宿主大部分是農(nóng)林業(yè)的害蟲。1973年，桿狀病毒被聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織推薦為化學(xué)農(nóng)藥的理想替代品。目前，我國已有6種桿狀病毒殺蟲劑正式登記注冊(cè)。桿狀病毒對(duì)宿主昆蟲具有專一而強(qiáng)烈的致病性，能夠在環(huán)境中長(zhǎng)期存活，對(duì)人、畜及其他脊椎動(dòng)物安全無害，不污染環(huán)境，是理想的“生物農(nóng)藥”。然而，桿狀病毒殺蟲速度較慢、殺蟲譜窄，嚴(yán)重阻礙其大規(guī)模應(yīng)用。在桿狀病毒出牙型病毒粒子(BV)囊膜的表面，存在許多由糖蛋白組成的刺突狀結(jié)構(gòu)，它們?cè)诮閷?dǎo)病毒與受體結(jié)合，膜融合及出芽等過程發(fā)揮關(guān)鍵作用。group I NPV BV的主要囊膜糖蛋白為GP64，group II NPV BV的主要囊膜糖蛋白是F蛋白。GP64和F蛋白均是低PH誘導(dǎo)的膜融合蛋白。研究表明，GP64比F蛋白具有更強(qiáng)大的膜融合能力，而含有GP64的group I代表株AcMNPV與含F(xiàn)蛋白的group 11代表株HearNPV相比，具有更廣的宿主域和更高的殺蟲活性。上述桿狀病毒組II核多角體病毒(group II NPV)中表達(dá)組I核多角體病毒(group I NPV)囊膜糖蛋白甜似基因的序列表在文章末尾。該序列表摘自NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/gene/1403961, Gene ID 為1403961)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種表達(dá)甜似基因的新型基因工程重組病毒的構(gòu)建方法，該方法操作簡(jiǎn)單，所構(gòu)建的重組病毒具有生物安全性，其在農(nóng)業(yè)的害蟲防治方面具有廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用以下的技術(shù)方案
本發(fā)明提供的表達(dá)甜似基因的新型基因工程重組病毒是在組II核多角體病毒的基因組中表達(dá)AcMNPV GP64，其中AcMNPV是苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒Auto耵aphacalifornica multiplenucleopolyhedrovirus 的英文縮寫，GP64 是 AcMNPV 的囊膜糖蛋白。本發(fā)明通過對(duì)野生型棉鈴蟲核多角體病毒W(wǎng)ico^rpa armigera singlenucleopolyhedrovirus,簡(jiǎn)稱為HearNPV進(jìn)行基因工程遺傳改良后得到。具體改良方法是在HearNPV bacmid HaBacHz8的多角體蛋白基因、polh )位點(diǎn)，插入由AcMNPV
基因啟動(dòng)子pPIO及冷杉毒蛾核多角體病毒Orgyia pseudotsugata multiplenucleopolyhedrovirus,簡(jiǎn)稱為OpMNPV的囊膜糖蛋白基因啟動(dòng)子p0pl66共同啟動(dòng)的AcMNPV的gp64基因，以及由AcMNPV多角體蛋白基因啟動(dòng)子pAcPoIh和HearNPV多角體蛋白基因啟動(dòng)子pHaPolh共同啟動(dòng)的HearNPV多角體蛋白基因，由此得到重組病毒。重組病毒所表達(dá)的外源基因?yàn)锳cMNPV的囊膜糖蛋白基因甜似以及與AcMNPVGP64氨基酸一致性達(dá)到75%以上的同源基因，或者基因突變修飾的衍生基因。本發(fā)明提供的上述AcMNPV GP64，其在改良基因組不含有^764的桿狀病毒的殺蟲活性方面的用途。本發(fā)明提供的表達(dá)甜似基因的新型基因工程重組病毒的構(gòu)建方法，其包括以下步驟
(1)重組bacmid^a&ac-gp64~polh的構(gòu)建將含有由AcMNPV 基因啟動(dòng)子pPIO及OpMNPV Op 166基因啟動(dòng)子p0pl66共同控制的AcMNPV gp64基因，以及由AcMNPV polh基因啟動(dòng)子PAcPolh和HearNPV卯煬基因啟動(dòng)子pHaPolh共同控制的HearNPV 煬基因的供體質(zhì)粒pFB-0p 166-^764-/70從，通過電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DHlOB感受態(tài)細(xì)胞(該DH10B感受態(tài)細(xì)胞中含有野生型棉鈴蟲核多角體病毒HearNPV bacmid HaBacHz8以及編碼轉(zhuǎn)座酶的helper質(zhì)粒的)中，然后通過轉(zhuǎn)座的方法獲得重組bacmid ^s&^-gp64-polh ；
(2)轉(zhuǎn)染-感染實(shí)驗(yàn)將腦ac-gp64-polhDNA 以及 Lipofectin (Invitrogen 公司)分別用無血清Grace培養(yǎng)基稀釋，充分混勻后轉(zhuǎn)染5 X IO5個(gè)HzAMl細(xì)胞；轉(zhuǎn)染6天后收集培養(yǎng)物上清，用其感染一批健康的HzAMl細(xì)胞以擴(kuò)增BV，感染6天后收集含感染性BV的上清，置于4 ° C避光保存，感染的細(xì)胞樣品存放于-20 ° C保存；
(3)病毒多角體的擴(kuò)增將重組病毒的BV注射至棉鈴蟲四齡幼蟲的血淋巴中，置于觀C培養(yǎng)，直至蟲體液化，收集蟲尸；用Vortex將液化的蟲尸震碎，通過差速離心的方法獲
取較純的多角體，對(duì)多角體進(jìn)行計(jì)數(shù)后保存于4 C備用；
經(jīng)過上述步驟，得到表達(dá)gp64基因的新型基因工程重組病毒^\aRac-gP64-Polh。該病毒的分類命名為棉鈴蟲核多角體病%Qklicoverpa armigera singlenuclearpolyhedrosis virus)。在步驟(2)中，是通過將5 μ g 腦ac-gp64-polh DNA 以及 12 μ 1 Lipofectinanvitrogen公司)分別用無血清Grace培養(yǎng)基稀釋至100 μ 1，充分混勻后轉(zhuǎn)染5 X IO5個(gè)HzAMl細(xì)胞。在步驟(3)中，是將10 μ 1的重組病毒的BV注射至棉鈴蟲四齡幼蟲的血淋巴中，置于觀 C培養(yǎng)，直至蟲體液化，收集蟲尸。所表達(dá)的外源基因?yàn)锳cMNPV gp64以及與AcMNPV GP64氨基酸一致性達(dá)到75%以上的同源基因，或者基因突變修飾的甜似衍生基因。本發(fā)明提供的上述構(gòu)建方法所制備的重組病毒，其在改良基因組不含有的桿狀病毒的殺蟲活性方面的用途。本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下主要的優(yōu)點(diǎn)其一.不需要對(duì)病毒基因組進(jìn)行復(fù)雜的基因操作。本方法采用Bac-to-Bac重組系統(tǒng)，與傳統(tǒng)的同源重組手段相比，可以快速簡(jiǎn)便的插入外源活性基因。其二.殺蟲活性提高。經(jīng)生物測(cè)定顯示，重組病毒的殺蟲活性明顯提高。重組病毒的LC5tl平均值為1. 6 X IO4 PIBs/ml，僅為野生型病毒的20%當(dāng)用3 X IO6 PIBs/ml感染時(shí)，重組病毒的ST5tl為90小時(shí)，比對(duì)照病毒縮短8個(gè)小時(shí)廣8%);而用更低濃度3 X IO5 PIBs/ml感染時(shí)，重組病毒的ST50為98小時(shí)，比對(duì)照病毒縮短16個(gè)小時(shí)廣14%)。其三.生物安全性高。構(gòu)建重組病毒過程中，采用的是桿狀病毒內(nèi)源性殺蟲活性基因AcMNPV甜似基因，避免外源毒素基因的引入，故具有生物安全性。


圖1是重組病毒N\ia&ac-gp64-polh的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是重組病毒嚇aC-gP64-Polh的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)圖。白色箭頭表示核內(nèi)有多角體聚集的HzAMl細(xì)胞。圖3是重組病毒偏aC-gP64-Polh的感染實(shí)驗(yàn)圖。白色箭頭表示核內(nèi)有多角體聚集的HzAMl細(xì)胞。圖4是重組病毒BV的Wfestern blot檢測(cè)圖。M表示蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1表示Y^3&ac-egfp~polh 的 BV ;2 表示 N\\a&ac-gp64~polh 的 BV。圖5是重組病毒vHaBac-a^^-po煬和對(duì)照病毒^aMc-egfP-Polh感染3齡棉鈴蟲的濃度-死亡率曲線。圖6是濃度為3 X IO6 PIBs/ml重組病毒^\a&ac-gP64-Polh和對(duì)照病毒NWa&ac-egfp-polh感染3齡棉鈴蟲的時(shí)間-死亡率曲線。圖7是濃度為3 X IO5 PIBs/ml重組病毒^\a&ac-gP64-Polh和對(duì)照病毒NWa&ac-egfp-polh感染3齡棉鈴蟲的時(shí)間-死亡率曲線。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及一種利用Bac-to-Bac系統(tǒng)對(duì)基因組不含有的桿狀病毒進(jìn)行基因工程遺傳改良的方法。該方法包括重組病毒的構(gòu)建，重組病毒多角體的擴(kuò)增和重組病毒的生物測(cè)定。構(gòu)建策略為在棉鈴蟲核多角體病毒HearNPV bacmid (HaBacHz8)的多角體蛋白基因bo從)位點(diǎn)，插入由苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcMNPV)/77i 基因啟動(dòng)子及冷杉毒蛾核多角體病毒(OpMNPV)的囊膜糖蛋白W66)基因啟動(dòng)子共同控制的(AcMNPV)的囊膜糖蛋白基因即甜似基因，以及在AcMNPV多角體蛋白基因啟動(dòng)子和HearNPV多角體蛋白基因啟動(dòng)子共同控制下的HearNPV多角體蛋白基因，構(gòu)建了一株共表達(dá)GP64和F蛋白兩種囊膜糖蛋白的重組棉鈴蟲核多角體病毒。通過對(duì)3齡初的棉鈴蟲幼蟲進(jìn)行生物測(cè)定發(fā)現(xiàn)重組病毒的LC5tl平均值為1. 6 X IO4 PIBs/ml，僅為野生型病毒的20%，重組病毒的ST5tl比對(duì)照病毒縮短8% 14%。本發(fā)明比野生型病毒具有更好的殺蟲活性，且具有很高的生物安全性。下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1.共表達(dá)兩種囊膜糖蛋白的基因工程重組病毒的構(gòu)建1.重組bacmid的構(gòu)建
將pFB-0pl66-a^4-/7o煬質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DHlOB (HaBacHz8 + helper)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布至LB固體培養(yǎng)基平板，于37 ° C倒置培養(yǎng)M 48小時(shí)。挑取白色單菌落，接入5ml LB培養(yǎng)基，37 ° C過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)物于12，000 rpm離心1 min收集菌體，按照Bac-to-Bac mannual (Invitrogen)il^d^abacmid 白勺_@^&DNA。^( 100 ng bacmidDNA為模板，分別以載體上的M13F、M13R和片段上的gp64_For引物進(jìn)行PCR鑒定，鑒定正確的重組bacmid命名為HaBac-a^^-po煬(圖1)。2.轉(zhuǎn)染-感染實(shí)驗(yàn)
將5 X IO5個(gè)HzAMl細(xì)胞接種至35 mm的小皿中，于觀 C培養(yǎng)過夜。將5 μ gWa&ac-gp64-polh DNA 以及 12 μ 1 Lipofectin Gnvitrogen 公司)分別用無血清 Grace，s培養(yǎng)基稀釋至100 μ 1，充分混勻后轉(zhuǎn)染HzAMl細(xì)胞，具體方法參考Bac-to-Bac說明書anvitrogen公司)。在轉(zhuǎn)染后96小時(shí)，可以觀察到HzAMl細(xì)胞出現(xiàn)因桿狀病毒感染所導(dǎo)致的核膨大特征，在核內(nèi)有多角體聚集(圖2)。在轉(zhuǎn)染6天后收集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清，感染一批健康的約1 X IO7個(gè)HzAMl細(xì)胞以擴(kuò)增BV，在96小時(shí)后發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞被感染，并伴有多角體的形成(圖3)。感染6天后收集含感染性BV的上清，置于4 ° C避光保存，感染的細(xì)胞樣品存放于-20 ° C保存。3.重組病毒多角體的擴(kuò)增
分別將10 μ 1的重組病毒的BV注射至棉鈴蟲四齡蟲的血淋巴中，置于觀 C培養(yǎng)，直至蟲體液化，收集蟲尸。用Vortex將液化的蟲尸震碎，通過差速離心的方法獲取較純的多角體。具體操作步驟為蟲尸于500 rpm離心5 min收集上清，再用5，000 rpm離心10min，棄去上清收集含多角體的沉淀。在經(jīng)過2輪的差速離心后，將含有多角體的沉淀懸于PBS中，加入0.01% SDS于37 ° C孵育半個(gè)小時(shí)，然后再用差速離心法進(jìn)行純化，直至獲得較純的多角體。最后，用PBS洗滌三遍去除SDS，對(duì)多角體進(jìn)行計(jì)數(shù)后保存于4 C備用。實(shí)施例2.共表達(dá)GP64和F蛋白兩種囊膜糖蛋白的重組病毒在降低對(duì)棉鈴蟲幼蟲施用劑量中的應(yīng)用
采用液滴飼喂法測(cè)定重組病毒的半數(shù)致死濃度LC5tlt5選取大小均一的、二齡末棉鈴蟲幼蟲，置于無菌的96孔板中于觀 C饑餓過夜，以獲取齡期均一的、三齡初的幼蟲。用PBS (含10%的蔗糖，1 mg/ml的食品染料)分別將重組病毒vWa&ac-卯64-polh和對(duì)照病毒vHaBac-￡^//7-/7o從的多角體稀釋成 3 X IO6 PIBs/mlU X 106PIBs/ml、3 X IO5 PIBs/ml U X IO5 PIBs/ml、3 X IO4 PIBs/mlU X IO4 PIBs/ml、3 X IO3 PIBs/mlU X IO3PIBs/ml的一系列濃度梯度的懸液。將稀釋后的多角體懸液飼喂饑餓后的棉鈴蟲幼蟲，將中腸變?yōu)樗{(lán)色的幼蟲轉(zhuǎn)入含有新鮮人工飼料的M孔板中，于觀 C培養(yǎng)。期間每隔M小時(shí)觀察感染幼蟲的死亡情況，直至所有的供試幼蟲液化死亡或者化蛹。實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。根據(jù)病毒的濃度值和對(duì)應(yīng)的死亡率繪制濃度-死亡率曲線。在較低劑量時(shí)，重組病毒^a&ac-gP64-Polh的致死率明顯高于對(duì)照病毒(圖4)。進(jìn)一步用ftObit回歸分析計(jì)算各病毒的LC5tl及其標(biāo)準(zhǔn)回歸斜率。根據(jù)95% CL數(shù)值是否包括1來判定是否具有顯著性差異，即若95% CL數(shù)值包括1則不具有顯著性差異，反之則有顯著性差異。統(tǒng)計(jì)分析表明，兩次實(shí)驗(yàn)重復(fù)中LC5tl測(cè)定結(jié)果的95% CL均不包含1，說明vHaBac-e^f/ -/^從和、憾aC-gP64-Polh 兩種病毒的LC5tl之間存在顯著性差異(表1 )。通過計(jì)算得出，對(duì)照病毒的LC5tl平均值為7. 9 X IO4 PIBs/ml，而重組病毒的LC5tl平均值為1.6 X IO4 PIBs/ml,僅為野生型病毒的20%，LC50的測(cè)定結(jié)果表明重組病毒的殺蟲施用劑量上顯著降低。實(shí)施例3.共表達(dá)GP64和F蛋白兩種囊膜糖蛋白的重組病毒在降低對(duì)棉鈴蟲幼蟲殺蟲時(shí)間中的應(yīng)用根據(jù)實(shí)施例2中LC5tl的測(cè)定值，選取3 X 106PIBs/ml、3 X IO5 PIBs/ml兩個(gè)濃度的病毒多角體懸液，用液滴飼喂法感染三齡初棉鈴蟲幼蟲，分別進(jìn)行半數(shù)存活時(shí)間ST5tl的測(cè)定。期間每隔4小時(shí)觀察感染幼蟲的死亡情況，直至所有供試幼蟲死亡或者化蛹。實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。根據(jù)感染時(shí)間和幼蟲死亡率繪制時(shí)間-死亡率曲線。當(dāng)用3 X IO6 PIBs/ml感染棉鈴蟲幼蟲時(shí)，重組病毒^\aRac-gP64-Polh比對(duì)照病毒更快達(dá)到100%的死亡率(圖6)，而當(dāng)用較低濃度3 X IO5 PIBs/ml感染棉鈴蟲幼蟲時(shí)，重組病毒vHaBac-a^^-po從在感染后110小時(shí)即達(dá)到了 100%的死亡率，對(duì)照病毒直到1 小時(shí)后，仍未達(dá)到100%的死亡率(圖7)。進(jìn)一步用Ifeplan-Meier生存分析計(jì)算各病毒的ST5tl及其標(biāo)準(zhǔn)誤，比較各病毒ST5tl之間的差異顯著性。當(dāng)用3 X IO6 PIBs/ml感染時(shí)，重組病毒vHaBac-甜似煬的ST5tl為90小時(shí)，比對(duì)照病毒縮短8個(gè)小時(shí)廣8%)(表2)；而當(dāng)用更低濃度3 X IO5 PIBs/ml感染時(shí)，N\\a&ac-gp64-polh的ST5tl為98小時(shí)，比對(duì)照病毒快16個(gè)小時(shí)( 14%)(表3)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明使用兩種不同濃度進(jìn)行感染時(shí)，兩種病毒的ST5tl之間均存在顯著性差異(P < 0.01)(表2，表3)，表明重組病毒的殺蟲速度顯著縮短，并且重組病毒在較低濃度即可達(dá)到100%的致死率。ST5tl的測(cè)定結(jié)果表明重組病毒的殺蟲速度顯著提高，且殺蟲施用劑量也有顯著降低。 附表
表1 ^\a&ac-gP64-Polh和vHaBac-￡^//7-/70煬感染3齡棉鈴蟲的濃度-死亡關(guān)系
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)甜似基因的新型基因工程重組病毒，其特征是在組II核多角體病毒的基因組中表達(dá)AcMNPV GP64，其中AcMNPV是苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒Auto耵aphacalifornica multiplenucleopolyhedrovirus 的英文縮寫，GP64 是 AcMNPV 的囊膜糖蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)基因的新型基因工程重組病毒，其特征是通過對(duì)野生型棉鈴蟲核多角體病毒Zfe^ZicorerjDa armigera single nucleopolyhedrovirus，簡(jiǎn)禾爾為HearNPV進(jìn)行基因工程遺傳改良后得到，具體改良方法是在HearNPV bacmid HaBacHz8的多角體蛋白基因Po從位點(diǎn)，插入由AcMNPV plO基因啟動(dòng)子pPIO及冷杉毒蛾核多角體病: Orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus,簡(jiǎn)稱為 OpMNPV 白勺囊膜糖蛋白基因啟動(dòng)子P0pl66共同啟動(dòng)的AcMNPV的甜似基因，以及由AcMNPV多角體蛋白基因啟動(dòng)子pAcPolh和HearNPV多角體蛋白基因啟動(dòng)子pHaPolh共同啟動(dòng)的HearNPV多角體蛋白基因，由此得到所述的重組病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)甜似基因的新型基因工程重組病毒，其特征是表達(dá)AcMNPV的囊膜糖蛋白基因以及與GP64氨基酸一致性達(dá)到75%以上的同源基因，或者基因突變修飾的gp64衍生基因。
4.一種權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求所述的表達(dá)基因的新型基因工程重組病毒，其特征是所述AcMNPV GP64在改良基因組不含有的桿狀病毒的殺蟲活性方面的用途。
5.一種表達(dá)基因的新型基因工程重組病毒的構(gòu)建方法，其特征是該方法包括以下步驟(1)重組bacmid^a&ac-gp64~polh的構(gòu)建將含有由AcMNPV 基因啟動(dòng)子pPIO及OpMNPV Op 166基因啟動(dòng)子p0pl66共同控制的AcMNPV gp64基因，以及由AcMNPV polh基因啟動(dòng)子PAcPolh和HearNPV卯煬基因啟動(dòng)子pHaPolh共同控制的HearNPV 煬基因的供體質(zhì)粒pFB-0p 166-^764-/70從，通過電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DHlOB感受態(tài)細(xì)胞中，該DHlOB感受態(tài)細(xì)胞中含有野生型棉鈴蟲核多角體病毒HearNPV bacmid HaBacHz8以及編碼轉(zhuǎn)座酶的helper質(zhì)粒，然后通過轉(zhuǎn)座的方法獲得重組kicmid ^a&ac-gp64-polh ；(2)轉(zhuǎn)染-感染實(shí)驗(yàn)將^a&ac-gP64-P0lhDNA以及轉(zhuǎn)染介質(zhì)Lipofectin分別用無血清Grace培養(yǎng)基稀釋，充分混勻后轉(zhuǎn)染5 X IO5個(gè)HzAMl細(xì)胞；轉(zhuǎn)染6天后收集培養(yǎng)物上清，用其感染一批健康的HzAMl細(xì)胞以擴(kuò)增BV，感染6天后收集含感染性BV的上清，置于4° C避光保存，感染的細(xì)胞樣品存放于-20 ° C保存；(3)病毒多角體的擴(kuò)增將重組病毒的BV注射至棉鈴蟲四齡幼蟲的血淋巴中，置于觀C培養(yǎng)，直至蟲體液化，收集蟲尸；用Vortex將液化的蟲尸震碎，通過差速離心的方法獲取較純的多角體，對(duì)多角體進(jìn)行計(jì)數(shù)后保存于4 C備用；經(jīng)過上述步驟，得到表達(dá)gp64基因的新型基因工程重組病毒^\aRac-gP64-Polh。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征是步驟(2)中，是通過將5yg腦ac-gp64-polh DNA以及12 μ 1 Lipofectin分別用無血清Grace培養(yǎng)基稀釋至100μ 1，充分混勻后轉(zhuǎn)染5 X IO5個(gè)HzAMl細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征是步驟(3)中，是將10μ 1的重組病毒的BV注射至棉鈴蟲四齡幼蟲的血淋巴中，置于觀 C培養(yǎng)，直至蟲體液化，收集蟲尸。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征是AcMNPVgp64以及與GP64氨基酸一致性達(dá)到75%以上的同源基因，或者基因突變修飾的甜似衍生基因。
9. 一種權(quán)利要求5至8中任一權(quán)利要求所述的構(gòu)建方法，其特征是AcMNPV GP64在改良基因組不含有的桿狀病毒的殺蟲活性方面的用途。
全文摘要
本發(fā)明是利用Bac-to-Bac系統(tǒng)對(duì)基因組不含有g(shù)p64的桿狀病毒進(jìn)行基因工程遺傳改良的方法，其包括重組病毒的構(gòu)建，重組病毒多角體的擴(kuò)增和重組病毒的生物測(cè)定；構(gòu)建策略為在棉鈴蟲核多角體病毒HearNPVbacmid的多角體蛋白基因位點(diǎn)，插入由苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒基因啟動(dòng)子及冷杉毒蛾核多角體病毒的囊膜糖蛋白基因啟動(dòng)子共同控制的gp64基因，以及在AcMNPV多角體蛋白基因啟動(dòng)子和HearNPV多角體蛋白基因啟動(dòng)子共同控制下的HearNPV多角體蛋白基因，構(gòu)建了一株共表達(dá)GP64和F蛋白兩種囊膜糖蛋白的重組棉鈴蟲核多角體病毒。本發(fā)明比野生型病毒具有更好的殺蟲活性，且有很高的生物安全性。
文檔編號(hào)C12N7/01GK102382803SQ201110349720
公開日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月8日
發(fā)明者干盈盈, 王華林, 王曼麗, 胡志紅, 鄧菲 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所