專利名稱：基因工程重組桿狀病毒殺蟲劑的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明公開了一種基因工程重組桿狀病毒殺蟲劑，它是利用當代先進的基因工程技術(shù)創(chuàng)造的一種全新的生物殺蟲劑，它屬于生物工程技術(shù)領域，它的國際專利分類號為C12。
目前，由于化學農(nóng)藥污染環(huán)境，破壞生態(tài)平衡，且害蟲抗藥性的增強也使其用量不斷增大，因此，對害蟲的生物防治倍受重視。桿狀病毒作為生物殺蟲劑具有嚴格宿主專一性，不危害人畜、天敵昆蟲、爬行動物、鳥類及植物，且具有持續(xù)性和流行性；已有少數(shù)野生型桿狀病毒商品化出售(Samon，1986)，但其對大田作物防治效果并不理想，主要障礙是病毒毒力不高，殺蟲速度慢。為使桿狀病毒成為理想的生物殺蟲劑，各國研究者利用基因工程手段對其基因組進行了多方改造，這些研究大多處在實驗室階段。整合在桿狀病毒基因組中的外源基因包括昆蟲利尿激素基因(Maeda等，1989，Biochem.Biophy.Res.Comm.，1651177)，昆蟲青春激素酯酶基因(Hammock等，1990，Nature，344451)，蘇蕓金桿菌(Bt)內(nèi)毒素蛋白基因(Merrywheather等1990，J.G.virolo-gy，711535；Martens等1990，Appll.Environ.Microbiol.562764，Pang等，1992，J.G.Virology，7389；Vlak等，1993)，這些基因在宿主體內(nèi)得到表達，但由于各種原因殺蟲效果并不理想。一些人開始用蝎或螨的神經(jīng)毒素基因構(gòu)建重組病毒(Tomalski等，1991，Nature，35282，Stewart等，1991，Nature，35285；Cory等，1994，Nature，370138)，取得了不同程度的較好效果。為此，1994年Cory等進行了28m2的半田間試驗，因為他們將重組病毒施到田里后，分別于第2，7，11，16天將害蟲提回在室內(nèi)隔離人工飼養(yǎng)，直到第11天才看到害蟲死亡，沒有實用價值。目前，我國國內(nèi)除我們報導的兩種重組桿狀病毒殺蟲劑vABBt101(齊義鵬等，科學通報1993，1994)和vAcPhBtT(王福山等，1995科學通報4020)外，還未見其他人關于重組桿狀病毒殺蟲劑的報導。
本發(fā)明的目的是為構(gòu)建廣譜、高效、安全且具有實際應用價值的基因工程桿狀病毒殺蟲劑。
為實現(xiàn)本發(fā)明目的所采取的技術(shù)措施是我們以苜蓿尺蠖核型多角體病毒(AcNPV)為對象，首先通過一系列基因工程操作手段，得到一種轉(zhuǎn)移載體，該轉(zhuǎn)移載體克隆有AcNPV的多角體基因(ocu)，在此基因5’端非調(diào)控區(qū)插入由AcNPV的P10基因啟動子和3’端部分截短的蘇蕓金桿菌δ-內(nèi)毒素CryIA(b)基因組成的表達盒，將此轉(zhuǎn)移載體與多角體基因缺失(ocu-)的AcNPVDNA共轉(zhuǎn)染昆蟲sf9細胞，通過體內(nèi)同源重組將上述表達盒整合到AcNPVocu基因5’調(diào)控區(qū)上游，經(jīng)單細胞克隆法篩選得到重組病毒vACPhBtT。而后，我們另構(gòu)建了另一種轉(zhuǎn)移載體，該載體克隆有AcNPV的多角體外膜(PE)基因，在PE基因中插入有早期基因(IE1)啟動子驅(qū)動的新霉素抗性基因(neor)，將此轉(zhuǎn)移載體與重組病毒vAcPhBtT DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲sf9細胞，通過體內(nèi)第二次同源重組將IE1/neor表達盒整合到vAcPhBtT的PE基因中，經(jīng)G418富集篩選法篩選出重組病毒vAcPhBtTPE-，以上即是我們得到的兩種主要的基因工程重組桿狀病毒殺蟲劑的毒種。
本發(fā)明的重組桿狀病毒殺蟲劑，其生產(chǎn)同野生型桿狀病毒的生產(chǎn)一樣，可通過感染昆蟲而在昆蟲體內(nèi)得以大量擴增，其生產(chǎn)工藝如下將重組病毒VAcPhBtTPE接種于昆蟲組培養(yǎng)細胞中，收集重組病毒，再將該病毒感染昆蟲來生產(chǎn)重組病毒感染的病死蟲尸，病蟲尸加入無菌水經(jīng)勻漿、離心、計數(shù)，按基因工程重組桿狀病毒殺蟲劑的有效含量加入遮光劑、乳化劑等，分裝得到的產(chǎn)品，貼產(chǎn)品標簽。
以銀蛾夜蛾計，每頭3齡幼蟲受染后可產(chǎn)生10億個多角體，通過大規(guī)模養(yǎng)蟲即可大規(guī)模生產(chǎn)。
與已有技術(shù)相比較，本發(fā)明已達到的技術(shù)效果本發(fā)明利用基因工程手段所得到的重組桿狀病毒和國內(nèi)外研究工作比較有如下多重特性，具有顯著的創(chuàng)新性，是國內(nèi)外首次報導1.保持了ocu基因完整性，能產(chǎn)生多角體，這是重組病毒能通過昆蟲口服感染并在田間保持穩(wěn)定性的必需條件。
2.具有完整的P10基因P10蛋白能啟動細胞裂解和多角體從細胞和組織中釋放，且對病毒復制和保持多角體結(jié)構(gòu)有重要作用。
3.克隆有3’端截短的蘇蕓金桿菌δ內(nèi)毒素CryIA(b)基因，能直接表達CryIA(b)晶體蛋白的可溶性毒素蛋白(80KDa)，而全長的CryIA(b)晶體蛋白是不具毒性的原毒素，需在昆蟲中腸通過降解后才能產(chǎn)生有毒性的毒蛋白，我們的重組病毒能直接表達可溶性毒蛋白，提高了殺蟲效力和殺蟲速度。
4.多角體外膜缺失重組病毒vAcPhBtTPE-的多角體外膜(PE)基因由于插入失活，使病毒粒子不能形成多角體外膜，從而使病毒粒子的釋放速度加快，因而也可提高其殺蟲速度。
5.具有篩選標記在重組病毒vAcPhBtTPE-的基因組中由于新霉素抗性基因的插入和表達，使此重組病毒感染的細胞在G418壓力下得以存活，而無neo基因的病毒被G418殺死，使重組病毒得以富集，十分簡單和快速地得到篩選和純化。
國外雖有一些重組桿狀病毒殺蟲劑構(gòu)建成功的報導，但一般都有不足之處，有的是ocu-，有的是P10-，有的是全長cry基因，本發(fā)明構(gòu)建的重組病毒vAcPhBtT具有ocu+、P10+和截短cryIA(b)，巧妙地既利用了非必需超表達P10基因的啟動子，表達出80KDa的可溶性毒蛋白，又保持了原ocu基因和P10基因的完整性，這是國外未報道的。特別是在此基礎上，經(jīng)過第二次共轉(zhuǎn)染和同源重組，在親本重組病毒vAcPhBtT的PE基因中插入IE1/neo表達盒，使PE基因失活，造成囊膜表型缺失，同時獲得篩選標記基因neo，根據(jù)湖北省情報所的查新報告，我們構(gòu)建的有多重表型的重組病毒vAcPhBtTPE-是國內(nèi)外的首創(chuàng)，具有國際領先水平。
國外重組桿狀病毒殺蟲劑除用神經(jīng)毒基因的有一定效果外，其余重組病毒均不能提高殺蟲效率和速度，更未發(fā)現(xiàn)在田間施用。
本發(fā)明的這兩種主要重組桿狀病毒有十分明顯的效果。室內(nèi)毒力測定結(jié)果，vAcPhBtT72小時殺死小菜蛾3齡幼蟲75-80％；對4齡甜菜夜蛾幼蟲的LD50，72小時vAcPhBtT為424PIB/cm2，vAcPhBtTPE-為360PIB/cm2，比新本野生型病毒(LD50 3289PIB/cm2)低近十倍(即毒力提高10倍)。
田間應用效果我們首次于1995年8月在漢陽農(nóng)村1畝蔬菜地施用重組病毒防治害蟲，蔬菜為花菜和豆角，有甜菜夜蛾、小菜蛾和菜青蟲等發(fā)生，結(jié)果證明對這三種害蟲都有顯著的效果，以2～3齡甜菜夜蛾幼蟲計，vAcPhBtT殺蟲率為45％(48小時)、80.4％(72小時)，vAcPhBtTPE-為66.9％(48小時)，81.1％(72小時)；化學農(nóng)藥(coscack)為91.1％(48小時和72小時)，說明重組病毒對害蟲的效率比親本病毒[29.8％(48小時)，32.6％(72小時)]提高一倍多，和化學農(nóng)藥幾乎接近。9月我們又于漢陽江堤鄉(xiāng)的蘿卜地對小菜蛾幼蟲進行了第二次田間試驗，取得了比第一次更好的結(jié)果。重組病毒vAcPhBtTPE-殺蟲率為56.7％(24小時)，81.8％(48小時)，遠優(yōu)于親本病毒，超過了化學農(nóng)藥(氯氫菊酯)的效果(24和48小時分別為23％和22.8％)。在生物農(nóng)藥中如此快速的控制害蟲危害，在整個學術(shù)界和農(nóng)業(yè)實踐中還是第一次。
基因工程桿狀病毒殺蟲劑，為有別于化學農(nóng)藥和天然的生物農(nóng)藥可稱之為基因農(nóng)藥，它具有廣譜、安全，對人畜無毒害，高效、快速、不污染環(huán)境，保持生態(tài)平衡等優(yōu)點，可以代替或部分代替化學農(nóng)藥，將引起傳統(tǒng)的農(nóng)藥行業(yè)的根本革新，產(chǎn)生巨大的社會和經(jīng)濟效益。
權(quán)利要求
1.一種利用基因工程技術(shù)的基因工程重組桿狀病毒殺蟲劑，其特征在于由苜蓿尺蠖核型多角體病毒(AcNPV)經(jīng)基因工程而得到一種轉(zhuǎn)移載體，在該轉(zhuǎn)移載體克隆有AcNPV的多角體基因(ocu)，在ocu基因5’端非調(diào)控區(qū)插入由AcNPV的P10基因啟動子和3’端截短的蘇蕓金桿菌δ內(nèi)毒素CryIA(b)基因組成的表達盒，再將此轉(zhuǎn)移載體與多角體基因缺失(ocu-)的AcNPV DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細胞，通過體內(nèi)同源重組將上述表達盒整合到AcNPV ocu基因5’調(diào)控區(qū)上游，經(jīng)單細胞克隆法篩選得到重組病毒vAcPhBtT；
2.一種利用基因工程技術(shù)的基因工程重組桿狀病毒殺蟲劑，其特征在于經(jīng)基因工程技術(shù)得到一種轉(zhuǎn)移載體，在該載體上克隆有AcNPV的多角體外膜(PE)基因，在PE基因中再插入早期基因(IE1)啟動子驅(qū)動的新霉素抗性基因(neor)，再將此轉(zhuǎn)移載與重組病毒vAcPhBtT DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細胞，通過體內(nèi)同源重組將IE1/neor表達盒整合到vAcPhBtT的基因中，經(jīng)G418富集篩選法篩選出重組的桿狀病毒vAcPhBtTPE-；
3.按權(quán)利要求1和2所述的基因工程重組桿狀病毒殺蟲劑，其特征在于本發(fā)明的生產(chǎn)工藝為將重組病毒VAcPhBtTPE接種于昆蟲組培養(yǎng)細胞中，收集重組病毒，再將該病毒感染昆蟲來生產(chǎn)重組病毒感染的病死蟲尸，病蟲尸加入無菌水經(jīng)勻漿、離心、計數(shù)，按基因工程重組桿狀病毒殺蟲劑的有效含量加入遮光劑、乳化劑等，分裝得到的產(chǎn)品，貼產(chǎn)品標簽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種全新的基因工程桿狀病毒殺蟲劑，其主要內(nèi)容是用基因工程手段對苜蓿尺蠖核型多角體病毒(AcNPV)基因組進行多方改造構(gòu)建兩類轉(zhuǎn)移載體，并克隆毒素基因或報道基因的表達盒，與野生的或重組的AcNPV共轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，通過體內(nèi)同源重組將表達盒整合到病毒基因組中，篩選得到兩種重組病毒，vAcPhBtT和vAcPhBtTPE
文檔編號A01N63/00GK1147555SQ95117749
公開日1997年4月16日 申請日期1995年10月9日 優(yōu)先權(quán)日1995年10月9日
發(fā)明者齊義鵬, 黃永秀, 王福山, 李凌云, 杜全勝, 李曉峰, 呂利群, 朱印, 周湘鄂, 楊芳 申請人:武漢大學