含人類骨保護(hù)素基因的重組慢病毒載體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種制備重組慢病毒載體的方法。更具體 地，涉及含有人類骨保護(hù)素基因的重組慢病毒及其制備方法以及該重組慢病毒載體在制備 治療牙周骨缺損材料中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 牙周病是發(fā)生在牙齒支持組織的炎癥性、破壞性疾病，以牙槽骨的吸收破壞為主 要特征。在臨床治療中通過牙周病的基礎(chǔ)治療、牙周手術(shù)（根面處理技術(shù)、引導(dǎo)性牙周組織 再生術(shù)、骨移植）和藥物治療，對(duì)消除致病因素、促使炎癥減輕有一定療效，但難以恢復(fù)正 常的牙槽嵴高度、形成新附著。
[0003] 組織工程技術(shù)為牙周組織再生提供了新方法。生長(zhǎng)因子是組織工程的重要因素， 它們能調(diào)控包括牙周來源在內(nèi)的多種細(xì)胞的增殖、遷移、分化和外基質(zhì)的合成，在牙周組織 再生的修復(fù)中發(fā)揮重要作用。但是傳統(tǒng)的組織工程方法應(yīng)用生長(zhǎng)因子時(shí)，多將生長(zhǎng)因子局 部注射或復(fù)合細(xì)胞和支架材料后植入體內(nèi)，由于生長(zhǎng)因子多為蛋白質(zhì)或多肽，在體內(nèi)極易 降解，生物半衰期短，容易被體液沖走或稀釋，因此難以保持局部有效治療濃度。
[0004] 基因治療為生長(zhǎng)因子持續(xù)、穩(wěn)定表達(dá)提供了新方法。借助基因治療的手段（如轉(zhuǎn) 基因技術(shù)），將生長(zhǎng)因子的基因轉(zhuǎn)移到牙周組織相關(guān)靶細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)基因?qū)氚屑?xì)胞后，這些 細(xì)胞便可以充當(dāng)微型"生物工廠"，持續(xù)釋放細(xì)胞因子，促使靶細(xì)胞的表型向再生方向分化； 并通過自分泌或旁分泌作用對(duì)細(xì)胞自身以及周圍未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn)生作用，促使整個(gè)缺損區(qū) 的所有細(xì)胞活化，從而提高牙周組織再生的成功率。
[0005]目前利用組織工程和基因治療技術(shù)以及兩者相結(jié)合促進(jìn)牙周組織修復(fù)再生已成 為牙周領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。有部分學(xué)者利用該技術(shù)在牙周病治療、促進(jìn)牙槽骨新生方面進(jìn)行 了研究，通過牙周膜細(xì)胞（Periodontalligamentcell^roLCj體外培養(yǎng)，并將骨形成蛋 白（Bonemorphogeneticprotein，BMPs)或血小板生長(zhǎng)因子（Platelet-derivedgrowth factor，TOGF)等促進(jìn)骨形成基因轉(zhuǎn)染至牙周膜細(xì)胞，回植到牙周組織缺損處，發(fā)現(xiàn)有促進(jìn) 牙槽骨形成的作用。然而，牙周組織是由牙骨質(zhì)、牙周膜、牙槽骨與牙齦共同構(gòu)成的三維結(jié) 構(gòu)，牙周病是細(xì)菌等各種病原因素對(duì)這四者的共同破壞，雖然通過牙周手術(shù)，包括使用牙周 組織工程方法在提供修復(fù)用細(xì)胞、促進(jìn)組織形成等方面有一定作用，但是，在病變牙周組織 中主要是各種刺激因素導(dǎo)致的大量破骨細(xì)胞活化，抑制了牙周組織的成骨能力，使組織修 復(fù)無法達(dá)到理想效果。因此，單一依靠促進(jìn)骨形成來治療牙周病效果未盡人意。
[0006]骨保護(hù)素（osteoprotegerin，0PG)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種能阻止破骨細(xì)胞分化、 成熟，抑制骨吸收的關(guān)鍵因子。骨保護(hù)素是核因子kB受體活化因子配體（receptor activatorofnuclearfactorkBligand，RANKL)的天然誘傅受體，能競(jìng)爭(zhēng)性地與核因 子kB受體活化因子配體結(jié)合，阻斷核因子kB受體活化因子（Receptoractivatorof nuclearfactor-kB，RANK)與核因子kB受體活化因子配體間的相互作用，從而抑制破骨 細(xì)胞的形成和活化，抑制骨吸收。研究發(fā)現(xiàn)，核因子KB受體活化因子配體水平升高可以導(dǎo) 致牙周組織的破壞；檢測(cè)牙周病患者齦溝液顯示，RANKL/OPG比率比健康人群明顯升高；細(xì) 菌產(chǎn)生的毒素或是組織表達(dá)的炎癥介質(zhì)也是通過影響RANKL/OPG比率而影響組織修復(fù)的。 這些研究結(jié)果表明，OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)在牙周骨代謝中是重要的分子調(diào)節(jié)機(jī)制之一。
[0007] 牙周組織中最重要的一種細(xì)胞是roixs，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)roixs可以表達(dá)骨保護(hù)素 和核因子kB受體活化因子配體，在沒有受到外界刺激時(shí)骨保護(hù)素表達(dá)較核因子kB受體 活化因子配體強(qiáng)，不利于破骨生成，以維持牙周內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。揭示了H)LCS是通過0PG/ RANKL系統(tǒng)來調(diào)節(jié)牙槽骨代謝的。由于H)LCS位于牙槽骨和牙骨質(zhì)之間，其分泌的骨保護(hù)素 可能在抵御炎癥組織中核因子kB受體活化因子配體介導(dǎo)的骨吸收中發(fā)揮一定的防御功 能。
[0008] 近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用骨保護(hù)素防治因破骨細(xì)胞過度活化而引起的骨吸收疾病 做了大量研究，發(fā)現(xiàn)骨保護(hù)素可有效抑制骨質(zhì)疏松性骨吸收、惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移破壞等骨質(zhì) 吸收疾病。但使用骨保護(hù)素治療牙周骨缺損還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：
[0010] 發(fā)明人將組織工程化骨植入兔牙周骨缺損處，以磷酸三鈣作為生長(zhǎng)空間，植 入的牙周膜干細(xì)胞在局部分化成成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，直接參與牙周骨 組織的再生；同時(shí)植入的牙周膜干細(xì)胞在體內(nèi)存活、發(fā)生遷移、吞噬及分泌細(xì)胞外基質(zhì)，并 吸引體內(nèi)細(xì)胞至缺損區(qū)域，從而促進(jìn)了牙周骨組織再生；另外植入的牙周膜干細(xì)胞不斷分 泌骨保護(hù)素蛋白，通過抑制核因子KB受體活化因子配體與破骨細(xì)胞表面的核因子KB受 體活化因子結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞活化，抑制牙槽骨吸收，從而提高牙周骨愈合過程。
[0011] 本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明提供了一種含有 人類骨保護(hù)素基因（hOPG)的重組慢病毒載體。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了 一種含有人類骨保護(hù)素基因重組慢病毒載 體的制備方法。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，該方法包括：
[0013] (1)合成人類骨保護(hù)素基因的編碼序列區(qū)域；
[0014] (2)將人類骨保護(hù)素基因的編碼序列區(qū)域克隆連接到T載體上；
[0015] (3)使用第一引物從連接骨保護(hù)素的T載體擴(kuò)增兩端含有酶切位點(diǎn)的人類骨保護(hù) 素基因的編碼序列片段；
[0016] (4)將步驟（3)得到的基因片段連接到pIRES-EGFP載體上，獲得0PG-IRES-EGFP 載體；
[0017] (5)將步驟⑷制備的0PG-IRES-EGFP重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽(yáng)性克??；
[0018] (6)使用第二引物從陽(yáng)性克隆擴(kuò)增出0PG-IRES-EGFP序列，亞克隆到載體 pcDNA6. 2w上；
[0019] (7)將步驟（6)制備的重組載體上的所述0PG-IRES-EGFP序列經(jīng)BP重組到入門載 體上，再經(jīng)LR重組到pLenti6. 3/V5載體上，得到pLenti6. 3-hOPG-IRES-EGFP重組載體。
[0020] 發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明制備載體的方法簡(jiǎn)單，易于操作，并且利用該方法可以 獲得重組慢病毒載體，該案重組慢病毒載體能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)染基因在體內(nèi)持續(xù)、穩(wěn)定的表達(dá)；并 能用于極難轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞和原代細(xì)胞。
[0021] 重組慢病毒載體根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，本發(fā)明制備方法中選用的酶切位點(diǎn)是Bgll 和BamHI。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，本發(fā)明實(shí)施例前述的第一引物序列為：SEQN0 1(命名為 SF-F1)、SEQN0 2(命名為SF-R1)，第一引物的具體序列如下：
[0023]SF-F1 :5, -AAATAGATCTGCCACCATGAACAACTTGCT-3'（SEQNO1);
[0024]SF-R1 :5, -ATACGTCGACAGCTGGGTCTTATAAGCAGC-3,（SEQNO2);
[0025] 由此，擴(kuò)增的精確率好、效率高。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，本發(fā)明實(shí)施例前述的第二引物序列為：SEQN0 3(命
[0027]名為SF-F)、SEQN0 4(命名為SF-R2)，第二引物的具體序列如下：
[0028]SF-F:5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCGCCACCATGAACAACTTGCTGTGCTGC G-3'（SEQN0 3);
[0029]SF-R2:5 '-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCACTTGTACAGCTCATCCATGCCG-3'（S EQN0 4)。
[0030] 由此，擴(kuò)增特異性好、效率高。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種含骨保護(hù)素基因的重組慢病毒載體。 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，該載體是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例前述的方法制備的。
[0032] 發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的重組慢病毒載體能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)染基因在體內(nèi)持續(xù)、穩(wěn) 定的表達(dá)；并能用于極難轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞和原代細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明又一方面，本發(fā)明還提供了pLenti6. 3-h0PG-IRES-EGFP重組載體在 制備含有人類0PG基因的重組慢病毒中的用途。
[0034] 發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的重組載體制備的重組慢病毒，能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)染基 因在體內(nèi)持續(xù)、穩(wěn)定的表達(dá)；并能用于極難轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞和原代細(xì)胞；同時(shí)，以該慢病毒為 載體的基因轉(zhuǎn)染不影響種子細(xì)胞與支架材料的黏附及其正常的生長(zhǎng)。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，所述重組慢病毒是將本發(fā)明前述構(gòu)建的重組載體與慢病毒包 裝蛋白表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，并將包裝細(xì)胞裂解獲得所述重組慢病毒。由此，轉(zhuǎn)染效率 商。
[0036] 根據(jù)本