專利名稱：含有Telomelysin GFP基因的重組病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種癌細(xì)胞檢測用或癌診斷用試劑以及細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑。
背景技術(shù)：
在癌化細(xì)胞或無限增殖化細(xì)胞株中，端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性增大的頻率高，在生殖細(xì)胞系、血球細(xì)胞系、上皮細(xì)胞系等以外的正常體細(xì)胞中卻幾乎檢測不到端粒末端轉(zhuǎn)移酶的活性。因此，現(xiàn)已嘗試了以端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性作為指標(biāo)檢測癌(Shay JW，Zou Y，Hiyama E，Wright WE.Telomerase and cancer.Hum Mol Genet 10(7)677-85，2001)。
另一方面，正在圖像診斷領(lǐng)域中正嘗試進(jìn)行在生物體中檢測癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的研究。例如，現(xiàn)已報道了利用PET的生物學(xué)的診斷和運用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的圖像分析等。此外，也有一些關(guān)于限制增殖型病毒的抗腫瘤活性和安全性的研究報告(DeWeese TL，van der Poel H，LiS，Mikhak B，Drew R，Goemann M，Hamper U，DeJong R，Detorie N，Rodriguez R，Haulk T，DeMarzo AM，Piantadosi S，Yu DC，Chen Y，Henderson DR，Carducci MA，Nelson WG，Simons JW.A phase I trialof CV706，a replication-competent，PSA selective oncolytic adenovirus，for the treatment of locally recurrent prostate cancer followingradiation therapy.Cancer Res 61(20)7464-72，2001)，本發(fā)明人通過使具有端粒末端轉(zhuǎn)移酶的啟動子并具有增殖能力的病毒感染癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)通過病毒增殖可以使癌細(xì)胞死亡Kawashima T，Kagawa S，Kobayashi N，Shirakiya Y，Umeoka T，Teraishi F，Taki M，Kyo S，Tanaka N，F(xiàn)ujiwara T.Related Articles，Links Abstract Telomerase-specific replication-selective virotherapy for human cancer.Clin CancerRes 10(1)285-92，2004)。
但是，由于靶向癌細(xì)胞的困難，還沒有開發(fā)出手術(shù)中進(jìn)行原位癌檢測的系統(tǒng)。此外，至今為止還沒有在病毒感染生物體的情況下的癌細(xì)胞內(nèi)，動態(tài)地、實際使癌組織可視化的研究。
發(fā)明的公開如上所述，一直希望開發(fā)出生物體內(nèi)可視化的癌細(xì)胞檢測用或癌診斷用試劑，和細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑。
本發(fā)明人為了解決上述問題，進(jìn)行了積極的研究，結(jié)果，通過在病毒基因組的E3區(qū)域中整合編碼熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)的基因，在E1區(qū)域整合按以下順序含有人端粒末端轉(zhuǎn)移酶的啟動子，E1A基因，IRES序列和E1B基因的復(fù)制盒，發(fā)現(xiàn)通過使兩個盒(cassette)表達(dá)，可以以極高密度檢測癌細(xì)胞，并且可以在生物體內(nèi)進(jìn)行檢測，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明如下所述。
(1)一種癌細(xì)胞檢測用試劑，其含有一種重組病毒，所述病毒基因組的E1區(qū)域中整合了按如下順序含有人端粒末端轉(zhuǎn)移酶的啟動子、E1A基因、IRES序列和E1B基因的復(fù)制盒，并且病毒基因組的E3區(qū)域中整合了含有編碼標(biāo)記蛋白質(zhì)的基因以及可以調(diào)控該基因的表達(dá)的啟動子的標(biāo)記盒。
(2)一種癌診斷用試劑，其含有一種重組病毒，所述病毒基因組的E1區(qū)域中整合了按如下順序含有人端粒末端轉(zhuǎn)移酶的啟動子、E1A基因、IRES序列和E1B基因的復(fù)制盒，并且病毒基因組的E3區(qū)域中整合了含有編碼標(biāo)記蛋白質(zhì)的基因以及可以調(diào)控該基因的表達(dá)的啟動子的標(biāo)記盒。
在上述(1)和(2)中，這些試劑，可以用于體內(nèi)檢測、診斷或?qū)Ш绞中g(shù)。作為上述的人端粒末端轉(zhuǎn)移酶啟動子，可以例舉，如hTERT啟動子，作為標(biāo)記蛋白質(zhì)，例如GFP。作為可以調(diào)控該編碼標(biāo)記蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)的啟動子，可以使用例如，巨細(xì)胞病毒啟動子或hTERT啟動子。進(jìn)而，作為病毒，例如腺病毒。
(3)一種細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑，其含有一種重組病毒，其中所述病毒基因組的E1區(qū)域中整合了按如下順序含有人端粒末端轉(zhuǎn)移酶的啟動子、E1A基因、IRES序列和E1B基因的復(fù)制盒，并且病毒基因組的E3區(qū)域中整合了含有編碼標(biāo)記蛋白質(zhì)的基因以及可以調(diào)控該基因的表達(dá)的啟動子的標(biāo)記盒。
此時，人端粒末端轉(zhuǎn)移酶的啟動子也可以是hTERT啟動子。此外，作為細(xì)胞死亡誘導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)，例如有免疫相關(guān)蛋白質(zhì)、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白質(zhì)、和端粒末端轉(zhuǎn)移酶相關(guān)蛋白質(zhì)。進(jìn)而，作為免疫相關(guān)蛋白質(zhì)，可以例舉如PA28，作為細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白質(zhì)，可以例舉如TRAIL，作為端粒末端轉(zhuǎn)移酶相關(guān)蛋白質(zhì)，可以例舉如AU5。此外，可以調(diào)控細(xì)胞死亡誘導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)的啟動子可以是巨細(xì)胞病毒啟動子或hTERT啟動子，而且所述病毒可以是腺病毒。作為本發(fā)明的細(xì)胞，也可以使用癌細(xì)胞。
(4)一種癌細(xì)胞的檢測方法，其特征在于使上述(1)的試劑感染癌細(xì)胞，檢測由所述癌細(xì)胞發(fā)出的熒光。
(5)一種癌的診斷方法，其特征在于使上述(2)的試劑感染癌細(xì)胞，檢測由所述癌細(xì)胞發(fā)出的熒光。
(6)一種誘導(dǎo)靶細(xì)胞的細(xì)胞死亡方法的方法，其特征在于使上述(3)的誘導(dǎo)劑感染該靶細(xì)胞。
附圖的簡要說明

圖1是表示Telomelysin-GFP結(jié)構(gòu)的圖。
圖2是表示非增殖性病毒的增殖的圖。
圖3是表示在體外通過Ad-GFP共感染進(jìn)行的癌細(xì)胞的檢測結(jié)果的圖。
圖4是表示在體內(nèi)通過Ad-GFP共感染進(jìn)行的人癌組織的檢測結(jié)果的圖。
圖5是表示通過Telomelysin-GFP感染人肺癌細(xì)胞產(chǎn)生的形態(tài)學(xué)的變化的圖。
圖6是表示通過Telomelysin-GFP感染人肺癌細(xì)胞產(chǎn)生的GFP熒光表達(dá)的圖。
圖7是表示通過定量的實時PCR確定的Telomelysin-GFP增殖的圖。
圖8是表示通過Telomelysin-GFP感染人大腸癌細(xì)胞產(chǎn)生的GFP熒光表達(dá)的圖。
圖9是表示通過定量的實時PCR確定的Telomelysin-GFP增殖的圖。
圖10是表示由Telomelysin-GFP感染正常人肺成纖維細(xì)胞(NHLF)產(chǎn)生的形態(tài)學(xué)變化的圖。
圖11是表示由Telomelysin-GFP感染正常人肺成纖維細(xì)胞(NHLF)產(chǎn)生的GFP熒光表達(dá)的圖。
圖12是表示通過定量的實時PCR確定的Telomelysin-GFP增殖的比較的圖。
圖13是表示通過熒光成像觀察的Telomelysin-GFP的腫瘤內(nèi)增殖·復(fù)制的圖。
圖14是表示通過熒光成像觀察的Telomelysin-GFP的腫瘤內(nèi)增殖·復(fù)制的圖。
圖15是表示通過熒光成像觀察的Telomelysin-GFP的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型中腫瘤內(nèi)增殖·復(fù)制的圖。
圖16是表示使用裸鼠和HT29人大腸癌細(xì)胞的原位(orthotopic)直腸癌模型中的組織學(xué)的分析的圖。
圖17是表示使用裸鼠和HT29人大腸癌細(xì)胞的原位直腸癌模型中的剖腹所見的圖。
圖18是表示通過熒光成像觀察的表示HT29直腸腫瘤和主動脈旁淋巴結(jié)中Telomelysin-GFP的腫瘤內(nèi)增殖·復(fù)制的圖。
圖19是表示通過熒光成像觀察的主動脈旁淋巴結(jié)中Telomelysin-GFP的腫瘤內(nèi)增殖·復(fù)制的圖。
圖20是表示通過熒光成像觀察的主動脈旁淋巴結(jié)中Telomelysin-GFP的腫瘤內(nèi)增殖·復(fù)制的圖。
用于實施發(fā)明的最佳方式以下，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。
記載于本說明書中的參考文獻(xiàn)并入本說明書作為參照。
1.癌細(xì)胞檢測用試劑和檢測方法本發(fā)明涉及人癌細(xì)胞檢測用試劑，其含有一種重組病毒，該病毒基因組的E1區(qū)域中整合了按如下順序含有人端粒末端轉(zhuǎn)移酶的啟動子、E1A基因、IRES序列和E1B基因的復(fù)制盒，并且病毒基因組的E3區(qū)域中整合了含有編碼標(biāo)記蛋白質(zhì)的基因以及可以調(diào)控該基因的表達(dá)的啟動子的標(biāo)記盒。此外，本發(fā)明涉及癌細(xì)胞的檢測方法，其特征在于使所述試劑感染癌細(xì)胞，檢測由所述癌細(xì)胞發(fā)出的熒光。在本發(fā)明中，所謂“重組病毒”是指其基因組中整合了后述的復(fù)制盒和標(biāo)記盒的病毒?？梢允褂玫牟《緵]有特別的限定，但是從安全性等方面出發(fā)，優(yōu)選腺病毒。此外，即使在腺病毒中，從使用方便等方面考慮，更為優(yōu)選5型腺病毒。
本發(fā)明中使用的重組病毒在相當(dāng)于腺病毒基因組的E1區(qū)域的區(qū)域中整合了復(fù)制盒，并且在相當(dāng)于腺病毒基因組的E3區(qū)域的區(qū)域中整合了標(biāo)記盒。復(fù)制盒是按如下順序含有人端粒末端轉(zhuǎn)移酶啟動子、E1A基因、IRES序列和E1B基因的盒，由人端粒末端轉(zhuǎn)移酶啟動子驅(qū)動E1A基因、IRES序列和E1B基因，癌細(xì)胞特異性和端粒末端轉(zhuǎn)移酶特異性增殖·復(fù)制。此外，標(biāo)記盒是含有啟動子和編碼標(biāo)記蛋白質(zhì)的基因的盒，由例如CMV(巨細(xì)胞病毒)啟動子或hTERT啟動子驅(qū)動編碼標(biāo)記蛋白質(zhì)的基因(圖1)。
“端粒末端轉(zhuǎn)移酶啟動子”決定端粒末端轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄起始部位，直接調(diào)節(jié)其頻率。所謂端粒末端轉(zhuǎn)移酶，是拮抗真核生物染色體復(fù)制時的收縮，維持端粒長度的酶。這種端粒末端轉(zhuǎn)移酶啟動子的種類，只要是與用于表達(dá)靶基因的病毒相適應(yīng)的啟動子即可，沒有特別的限定，但是優(yōu)選，例如人端粒末端轉(zhuǎn)移酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的啟動子。確認(rèn)在hTERT 5’末端上游1.4kbp的區(qū)域中有許多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列，該區(qū)域被認(rèn)為是hTERT啟動子，其中，翻譯起始部位的上游181bp的序列是下游基因表達(dá)中重要的核心區(qū)域。在本發(fā)明中，只要是含有該核心區(qū)域的啟動子即可不受限制地使用，但是優(yōu)選使用完全含有該核心區(qū)域的上游378bp左右的序列作為hTERT啟動子。確認(rèn)了，該378bp左右的序列與單獨使用181bp的核心區(qū)域的情況基因表達(dá)效率同等。長度為455bp的hTERT啟動子的堿基序列如SEQ ID NO.1所示。
作為hTERT啟動子，除了SEQ ID NO.1中所示的堿基序列外，還包括與互補于包含SEQ ID NO.1的DNA的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)緊條件下雜交、并且具有hTERT啟動子活性的核苷酸的堿基序列。這種核苷酸可以以包含SEQ ID NO.1所示的堿基序列的多核苷酸、或其片段作為探針，通過菌落雜交、噬斑雜交、Southern印跡等公知的雜交法，從cDNA文庫和基因組文庫中獲得。cDNA文庫的制備方法可以參照《分子克隆第2版》(「Molecular Cloning，A Laboratory Manual2nd ed.」)(Cold Spring Harbor Press(1989))。此外，也可以使用市售的cDNA文庫和基因組文庫。
作為在上述雜交中的嚴(yán)緊條件，可以例舉有例如，1×SSC～2×SSC、0.1％～0.5％SDS和42℃～68℃的條件，更具體地，可以例舉有60～68℃下進(jìn)行30分以上的預(yù)雜交后，在2×SSC、0.1％SDS中、室溫下進(jìn)行4～6次5～15分鐘的清洗的條件。
對于雜交法的詳細(xì)步驟，可以參照《分子克隆第2版》(「MolecularCloning，A Laboratory Manual 2nd ed.」)(Cold Spring HarborPress(1989)；尤其是Section9.47-9.58)等。
在本發(fā)明中之所以按如下順序含有E1A基因、IRES序列和E1B基因，是因為使用在E1A基因和E1B基因之間插入IRES序列的病毒，在病毒感染宿主細(xì)胞時，其增殖能力提高。并且，E1A基因和E1B基因是包括于E1基因的基因，但是所謂E1基因，是指病毒具有的與DNA復(fù)制相關(guān)的早期基因(early:E)和晚期基因(late:L)中的早期基因的一種，其編碼與病毒基因組的轉(zhuǎn)錄的調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)。由E1A基因編碼的E1A蛋白質(zhì)可以活化產(chǎn)生感染病毒所必需的基因群(E1B、E2、E4等)的轉(zhuǎn)錄。由E1B基因編碼的E1B蛋白質(zhì)有助于晚期基因(L基因)的mRNA在被感染的宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中積累，通過抑制宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)病毒的復(fù)制。E1A基因、E1B基因的堿基序列分別如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
E1A和E1B除分別包括SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的堿基序列外，還包括與互補于包含SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的DNA的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)緊條件下雜交，并且編碼具有E1A和E1B活性的蛋白質(zhì)的堿基序列。這種堿基序列可以分別包含SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的堿基序列的多核苷酸、或其片段作為探針，通過菌落雜交、噬斑雜交、Southern印跡等公知的雜交法，從cDNA文庫和基因組文庫中獲得。對于cDNA文庫的制備方法，可以參照《分子克隆第2版》(「Molecular Cloning，A Laboratory Manual 2nded.」)(Cold Spring Harbor Press(1989)。此外，也可以使用市售的cDNA文庫和基因組文庫。在上述雜交中，作為嚴(yán)緊條件，可以例舉有例如，1×SSC～2×SSC、0.1％～0.5％SDS和42℃～68℃的條件，更詳細(xì)的是，可以例舉有60～68℃下進(jìn)行30分以上的預(yù)雜交后，在2×SSC、0.1％SDS中、室溫下進(jìn)行4～6次5～15分鐘的清洗的條件。對于雜交法的詳細(xì)步驟，可以參照《分子克隆第2版》(「Molecular Cloning，ALaboratory Manual 2nd ed.」)(Cold Spring Harbor Press(1989)；尤其是Section9.47-9.58)等。
所謂IRES(Internal Ribosome Entry Site)，是微小核糖核酸病毒科中特異的蛋白質(zhì)合成起始信號，由于具有與18S核糖體RNA的3’末端互補的序列，因此起到核糖體結(jié)合部位的作用。已知微小核糖核酸病毒科病毒來源的mRNA通過該序列的介導(dǎo)得以翻譯。由IRES序列的翻譯效率高，即使從mRNA中部開始，也可以以非依賴于帽結(jié)構(gòu)地方式進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。因此，所述病毒中，由人端粒末端轉(zhuǎn)移酶的啟動子獨立地翻譯E1A基因和存在于IRES序列下游的E1B基因。如果使用IRES，端粒末端轉(zhuǎn)移酶啟動子的表達(dá)調(diào)控可以獨立涉及E1A基因、E1B基因，因此與用端粒末端轉(zhuǎn)移酶啟動子調(diào)控E1A基因或E1B基因任意一方的情況相比，病毒的增殖可以更為嚴(yán)格地限制在具有端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性的細(xì)胞之中。IRES序列如SEQ ID NO.4所示。
此外，IRES除了包括SEQ ID NO.4中所示的堿基序列之外，還包括與互補于包含SEQ ID NO.4的DNA的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)緊條件下雜交、且編碼具有IRES活性的蛋白質(zhì)的堿基序列。這種堿基序列，可以以包含SEQ ID NO.4所示的堿基序列的多核苷酸、或其片段作為探針，通過菌落雜交、噬斑雜交、Southern印跡等公知的雜交法，從cDNA文庫和基因組文庫中獲得。cDNA文庫的制備方法可以參照《分子克隆第2版》(「Molecular Cloning，A Laboratory Manual 2nded.」)(Cold Spring Harbor Press(1989))。此外，也可以使用市售的cDNA文庫和基因組文庫。作為在上述雜交中的嚴(yán)緊條件，可以例舉有例如，1×SSC～2×SSC、0.1％～0.5％SDS和42℃～68℃的條件，更詳細(xì)的是，可以例舉有60～68℃下進(jìn)行30分以上的預(yù)雜交后，在2×SSC、0.1％SDS中、室溫下進(jìn)行4～6次5～15分鐘的清洗的條件。對于雜交法的詳細(xì)步驟，可以參照《分子克隆第2版》(「Molecular Cloning，ALaboratory Manual 2nd ed.」)(Cold Spring Harbor Press(1989)；尤其是Section9.47-9.58)等。
此外，在本發(fā)明中，在E1基因的上游具有人端粒末端轉(zhuǎn)移酶的啟動子。是因為可以在具有端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性的細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)增殖。
包含于本發(fā)明的復(fù)制盒中的基因可以通過通常的基因工程學(xué)方法獲得。例如，作為基因工程的方法，可以使用采用一般使用的DNA合成裝置的核酸合成法。此外，在分離或合成作為模板的基因序列后，設(shè)計特異于各基因的引物，可以使用通過PCR裝置擴(kuò)增所述基因序列的PCR法(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons(1987)Section 6.1-6.4)或采用克隆載體的基因擴(kuò)增法。上述方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以按照《分子克隆第2版》，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)等容易地進(jìn)行。獲得的PCR產(chǎn)物的純化，可以使用公知的方法。例如使用溴化乙錠的方法，使用SYBRGreenI(Molecular probes社)的方法，采用用GENECLEAN(FUNAKOSHI)、QIAGEN(QIAGEN社)等瓊脂糖凝膠的方法，使用DEAE-纖維素濾紙的方法，冷凍&壓縮法、使用透析管的方法等。在使用瓊脂糖凝膠時，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，從瓊脂糖凝膠切出DNA片段后進(jìn)行純化。根據(jù)需要，可以通過常用的序列測定法確認(rèn)獲得所預(yù)期的基因。例如，可以通過雙脫氧核苷酸鏈終止法(Sanger等人(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463)等進(jìn)行。此外，通過也可以利用適當(dāng)?shù)腄NA測序儀(例如，ABI PRISM(Applied Biosystems公司))分析序列。
然后，使上述獲得的各個基因按預(yù)定順序連結(jié)。首先，用公知的制限性酶等切斷上述各個基因，按照公知的方法將切斷的這些基因的DNA片段插入公知的載體中，進(jìn)行連結(jié)。作為公知的載體，可以使用含有腦心肌炎病毒(ECMV)的IRES(mRNA內(nèi)部的核糖體結(jié)合位點)，可以由1種mRNA翻譯兩個位點的開放閱讀框(ORF)的pIRES載體，以及大腸桿菌來源的質(zhì)粒(pCR4、pCR2、pCR2.1、pBR322、pBR325、pUC12、pUC13等)、枯草桿菌來源的質(zhì)粒(pUB110、pTP5、pC194等)、酵母來源的質(zhì)粒(pSH19、pSH15等)、λ噬菌體等噬菌體、逆轉(zhuǎn)錄病毒、牛痘病毒、桿狀病毒等動物病毒等，以及pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo等。對于本發(fā)明，如果使用pIRES載體，由于通過在多克隆位點順次插入必需的基因，可以制備依次含有「人端粒末端轉(zhuǎn)移酶的啟動子、E1A基因、IRES序列和E1B基因」的復(fù)制盒，因此而優(yōu)選。DNA的連結(jié)中可以使用DNA連接酶。在本發(fā)明中，以下就使用人端粒末端轉(zhuǎn)移酶hTERT的情況，進(jìn)行具體的說明。
使用E1A-S、E1A-AS、E1B-S、E1B-AS等適當(dāng)?shù)囊铮瑥?93細(xì)胞等表達(dá)E1基因的細(xì)胞中，通過進(jìn)行RT-PCR和/或DNA-PCR，擴(kuò)增E1A基因和E1B基因，根據(jù)需要通過TA克隆等的公知的方法確認(rèn)序列后，用公知的制限性酶切出E1A和E1B的DNA片段。
接著，通過利用多克隆位點等，在pIRES載體等公知的載體中按「hTERT啟動子序列-E1A-IRES-E1B」的順序插入各基因，可以制備本發(fā)明中使用的包含hTERT-E1A-IRES-E1B的復(fù)制盒。此外，根據(jù)需要，可以用公知的制限性酶切出包含于pShuttle等公知載體中的巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子，在該部位插入用適當(dāng)?shù)闹葡扌悦笍膒hTERT-E1A-IRES-E1B切出的序列。如上所述，本發(fā)明中使用的只整合了包含hTERT-E1A-IRES-E1B的復(fù)制盒的腺病毒稱為“Telomelysin”。通過在hTERT啟動子的調(diào)控下使腺病毒增殖所必需的E1基因表達(dá)，可以使病毒癌細(xì)胞特異性地增殖。
在作為本發(fā)明的試劑使用的重組病毒中，包括復(fù)制盒和標(biāo)記盒。該「標(biāo)記盒」整合到，例如，腺病毒中的E3區(qū)域中。
其中，可以在本發(fā)明中使用的重組病毒病毒載體本來的功能是由于病毒增殖導(dǎo)致細(xì)胞損壞。因此，對于以微小癌組織的診斷目的使用本發(fā)明的試劑，發(fā)生上述細(xì)胞損壞的時期盡可能晚的情況是優(yōu)選的。其原因是，如果細(xì)胞受到破壞，本發(fā)明的重組病毒的增殖中產(chǎn)生的熒光表達(dá)就消失，鑒定其存在部位變得困難。
另一方面，例如，E3A和E3B存在于腺病毒E3區(qū)域中，E3A區(qū)域的11.6kDa的ADP(adenovirus death protein)具有促進(jìn)細(xì)胞損壞和病毒的擴(kuò)散的功能。
因此，本發(fā)明中使用的重組病毒，通過除去含有ADP的E3區(qū)域等編碼具有促進(jìn)細(xì)胞損壞和病毒的擴(kuò)散功能的蛋白質(zhì)的病毒基因組區(qū)域，使細(xì)胞死亡的時間延遲，由此易于通過GFP等熒光表達(dá)鑒定癌組織。
構(gòu)成標(biāo)記盒的標(biāo)記蛋白質(zhì)是在上述病毒增殖的細(xì)胞內(nèi)通過發(fā)光而可視化的蛋白質(zhì)，優(yōu)選使用發(fā)出熒光的物質(zhì)。作為這種物質(zhì)，可以例舉有例如，Aequorea victorea等的發(fā)光水母來源的綠色熒光蛋白質(zhì)(綠熒光蛋白GFP)，對其進(jìn)行改變的變異體(GFP變異體)，EGFP(Enhanced-humanized GFP)或rsGFP(red-shift GFP)等。此外，也可以使用黃色熒光蛋白質(zhì)(黃熒光蛋白YFP)、藍(lán)綠色熒光蛋白質(zhì)(藍(lán)綠熒光蛋白CFP)、藍(lán)色熒光蛋白質(zhì)(藍(lán)熒光蛋白BFP)、海腎(Renillareniformis)來源的GFP，也可以將編碼這些蛋白質(zhì)的基因用于本發(fā)明中。
此外，所謂可以調(diào)控上述基因表達(dá)的啟動子，如果是可對應(yīng)于表達(dá)作為靶的上述基因使用的病毒的適當(dāng)?shù)膯幼?，可以是任意一種。例如，可以例舉有巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子、hTERT啟動子、SV40晚期啟動子、MMTV LTR啟動子、RSV LTR啟動子、SRα啟動子等，但不限于此。優(yōu)選，可以使用CMV啟動子或hTERT啟動子。
包含于本發(fā)明的標(biāo)記盒的重組基因，可以通過通常的基因工程方法獲得。例如，作為基因工程的方法，可以使用采用一般使用的DNA合成裝置的核酸合成法。此外，在分離或合成作為模板的基因序列后，設(shè)計特異于各基因的引物，可以使用采用PCR裝置擴(kuò)增所述基因序列的PCR法(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons(1987)Section 6.1-6.4)或采用克隆載體的基因擴(kuò)增法。上述方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以按照《分子克隆第2版》，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)等容易地進(jìn)行。獲得的PCR產(chǎn)物的純化，可以使用公知的方法。例如、有使用溴化乙錠的方法，使用SYBRGreenI(Molecular probes公司)的方法，采用用GENECLEAN(funakoshi)、QIAGEN(QIAGEN公司)等瓊脂糖凝膠的方法，使用DEAE-纖維素濾紙的方法，冷凍&壓縮法、使用透析管的方法等。在使用瓊脂糖凝膠時，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，從瓊脂糖凝膠切出DNA片段后進(jìn)行純化。根據(jù)需要，通過常用的序列測定法可以確認(rèn)獲得所預(yù)期的基因。例如，可以通過雙脫氧核苷酸鏈終止法(Sanger等人(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463)等進(jìn)行。此外，也可以通過利用適當(dāng)?shù)腄NA測序儀(例如，ABI PRISM(Applied Biosystems公司))分析序列。然后，用公知的制限性酶等切斷上述獲得的基因，將經(jīng)切斷的基因的DNA片段配置成下述的重組基因，即在上述編碼標(biāo)記蛋白質(zhì)的基因片段的上游配置編碼可以驅(qū)動該基因的DNA片段的上述啟動子。此時，作為質(zhì)粒，可以使用穿梭質(zhì)粒pHM11等。然后，使用DNA連接酶使兩個基因連結(jié)，插入于載體中，制備標(biāo)記盒重組基因。
作為公知的載體、可以使用pShuttle載體、大腸桿菌來源的質(zhì)粒(pCR4、pCR2、pCR2.1、pBR322、pBR325、pUC12、pUC13等)、枯草桿菌來源的質(zhì)粒(pUB110、pTP5、pC194等)、酵母來源的質(zhì)粒(pSH19、pSH15等)、λ噬菌體等噬菌體、逆轉(zhuǎn)錄病毒、牛痘病毒、桿狀病毒等動物病毒等，和pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo等。
然后，通過用適當(dāng)?shù)闹葡扌悦盖谐龊猩鲜鰪?fù)制盒和標(biāo)記盒的重組基因，插入適當(dāng)?shù)牟《颈磉_(dá)載體，可以制備重組病毒。病毒表達(dá)載體中可以例舉有腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、牛痘病毒、桿狀病毒等，但是如上所述，優(yōu)選腺病毒，尤為優(yōu)選5型腺病毒。盒向病毒的整合，可以使用例如電穿孔法、脂質(zhì)體法、原生質(zhì)體法、醋酸鋰法等。
本發(fā)明中，更具體的是，可以通過在穿梭質(zhì)粒pHM11中插入pEGFP-N1(CLONTECH)來源的CMV-EGFP-SV40P(A)，通過在整合了phTERT-E1A-IRES-E1B的pShuttle載體的ClaI部位插入該質(zhì)粒的Csp45I片段而獲得。
本發(fā)明中，更具體的是，從如上制備的重組基因中通過公知的制限性酶切出必要部分的序列，用Adeno-X表達(dá)系統(tǒng)(CLONTECH)等市售的試劑盒，可以插入于Adeno-X病毒DNA等病毒的DNA中(將獲得的產(chǎn)物稱為“AdenoX-hAIB”。)。
然后，用公知的制限性酶將該AdenoX-hAIB線性化后，通過轉(zhuǎn)染293細(xì)胞等培養(yǎng)細(xì)胞，可以制備具有感染性的重組病毒。
作為本發(fā)明中檢測對象的癌細(xì)胞的種類沒有限定，可以使用所有種類的癌細(xì)胞。例如，對于頭頸部、胃、大腸、肺、肝、前列腺、胰腺、食道、膀胱、膽囊·膽管、乳房、子宮、甲狀腺、卵巢等中的實體癌、或白血病、淋巴瘤、肉瘤、間質(zhì)系腫瘤等有效。人組織來源的癌細(xì)胞的大部分顯示出端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性的上升，本發(fā)明通過其端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性可以全部檢測增殖變活躍的癌細(xì)胞。
由于與正常細(xì)胞相比，癌細(xì)胞中端粒末端轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)極高，在含有端粒末端轉(zhuǎn)移酶的癌細(xì)胞中表達(dá)hTERT，復(fù)制盒發(fā)揮功能。因此病毒增殖，而且由于增殖使標(biāo)記蛋白質(zhì)的復(fù)制增加，因此通過標(biāo)記蛋白質(zhì)表達(dá)實現(xiàn)可視化。
因此，使本發(fā)明的試劑在正常細(xì)胞中不發(fā)生熒光，含有本發(fā)明的試劑的癌細(xì)胞則發(fā)光，由此可以在視覺上觀察癌細(xì)胞。
為了使重組病毒感染細(xì)胞，例如，有以下的方法。首先、將人大腸癌細(xì)胞SW620、人肺癌細(xì)胞A549、H1299等細(xì)胞接種于加入了適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，在二氧化碳存在下，于37℃培養(yǎng)。培養(yǎng)液，采用動物細(xì)胞培養(yǎng)中一般使用的DMEM、MEM、RPMI-1640等，根據(jù)需要，可以添加血清、抗生物質(zhì)、維生素等。通過在培養(yǎng)的細(xì)胞中接種一定量的本病毒、例如，0.1～10MOI(感染復(fù)數(shù))、優(yōu)選、1MOI，使之感染。所謂MOI，是指使一定量的病毒粒子感染一定量的培養(yǎng)細(xì)胞時的病毒量(感染單位)與細(xì)胞數(shù)之比，可以作為使病毒感染細(xì)胞時的指標(biāo)使用。
并且，為了確認(rèn)病毒增殖，回收病毒感染細(xì)胞，提取DNA，通過使用以該病毒具有的適當(dāng)?shù)幕蜃鳛槟繕?biāo)的引物進(jìn)行實時PCR，可以定量分析。
對于被標(biāo)記的細(xì)胞的檢測，推定病毒增殖的細(xì)胞由于通過碰到激發(fā)光而發(fā)出預(yù)定的熒光(例如GFP時為綠色熒光)，由此可以使癌細(xì)胞可視化。例如，如果在熒光顯微鏡下觀察病毒感染細(xì)胞，可以在細(xì)胞中看到GFP熒光表達(dá)。并且，為了隨著時間推移觀察病毒感染細(xì)胞，使用CCD照相機，可以隨著時間推移觀察GFP熒光表達(dá)。
為了實時標(biāo)記和檢測生物體內(nèi)細(xì)胞，可以在生物體內(nèi)施加本發(fā)明的重組病毒。
本發(fā)明的試劑也可以在原患部位應(yīng)用，也可以通過所有公知的方法、例如，在靜脈、肌肉、腹腔內(nèi)或皮下等，注射、從鼻腔、口腔或肺吸入、口服給藥、使用導(dǎo)管等的血管內(nèi)給藥等導(dǎo)入于生物體(作為對象的細(xì)胞和器官)內(nèi)。給藥量可以根據(jù)有效成分的種類、給藥途徑、給藥對象、患者的年齡、體重、性別、癥狀，其它條件進(jìn)行適當(dāng)選擇，但是，作為一日給藥量，通常有效成分的本發(fā)明病毒的量可以是106～1011PFU(噬斑形成單位，plaque forming units)左右，優(yōu)選109～1011PFU左右，可以1天1次給藥，也可以分成數(shù)次給藥。
在生物體內(nèi)實時觀察標(biāo)記，具有用于體內(nèi)診斷劑的優(yōu)點。這對于所謂導(dǎo)航手術(shù)等有用。
在外科手術(shù)中，如果進(jìn)行包括病變器官在內(nèi)的大范圍的切除，經(jīng)歷手術(shù)的患者可以獲得長期生存。但是，手術(shù)本身引發(fā)的并發(fā)癥的發(fā)生率高，而且由于喪失功能，不能避免對術(shù)后日常生活的影響。一邊維持長期生存的遠(yuǎn)期成績，一邊導(dǎo)入減輕患者負(fù)擔(dān)的低侵襲性的治療在癌治療中十分重要。
以縮小必要最低限度切除手術(shù)的范圍、實現(xiàn)低侵襲化為目的時，所希望了解的信息之一就是是否存在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，作為了解這些信息的方法，目前警戒淋巴結(jié)(sentinel node，SN)倍受關(guān)注。所謂SN是最早從腫瘤接受淋巴液流的淋巴結(jié)，存在著其中產(chǎn)生最早的微小轉(zhuǎn)移這種假說。該假說被稱為SN理論。針對乳腺癌中，現(xiàn)已開始了以歐美為中心的大規(guī)模的臨床試驗，但是對于這種方法在其它實體瘤中是否通用還不清楚，其驗證已經(jīng)開始了。
使用本發(fā)明的試劑的體內(nèi)癌診斷系統(tǒng)，可以建立在癌細(xì)胞中使熒光蛋白質(zhì)直接表達(dá)，通過高感度術(shù)中熒光檢測系統(tǒng)鑒定腫瘤組織或轉(zhuǎn)移陽性淋巴結(jié)的技術(shù)作為比SN更有效的方法，即“導(dǎo)航手術(shù)”的技術(shù)。本發(fā)明的重組病毒在具有端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性的許多癌細(xì)胞中增殖，可以發(fā)出例如GFP的強綠色熒光。
根據(jù)胃癌的單發(fā)淋巴結(jié)(単発リンパ節(jié))轉(zhuǎn)移部位的分析，報道了10％前后的skip轉(zhuǎn)移、也就是越過第1組淋巴結(jié)向第2組遠(yuǎn)端淋巴結(jié)的初發(fā)轉(zhuǎn)移，以此為根據(jù)，提倡SN導(dǎo)航的危險性的意見很多。但是，使用本發(fā)明的試劑的體內(nèi)癌診斷系統(tǒng)在手術(shù)中直接實時鑒定腫瘤組織或轉(zhuǎn)移陽性淋巴結(jié)，成為切除范圍的導(dǎo)航，是獨創(chuàng)的并且是劃時代的，而且由于更為順利地進(jìn)行手術(shù)因此極為實用。具體的是，通過與SN導(dǎo)航時相同的技術(shù)，在手術(shù)前數(shù)日，用內(nèi)視鏡在腫瘤部位(例如胃癌和大腸癌周圍的胃·大腸粘膜、胃癌·大腸癌·肺癌·胰腺癌等腫瘤內(nèi)部等)注入本發(fā)明的試劑，病毒向腫瘤浸潤組織、腫瘤轉(zhuǎn)移組織、或所屬淋巴結(jié)分布，為腫瘤部位或轉(zhuǎn)移陽性部位中的病毒增殖提供了充分的時間。
手術(shù)時，在開腹后以GFP熒光激發(fā)光源投射手術(shù)的區(qū)域，將特殊3CCD照相機攝下的映像投影于眼罩顯示器(face mount display)。通過使用透過性鏡片，可以確保實際的手術(shù)的區(qū)域視野，可以通過重疊的GFP圖像檢測轉(zhuǎn)移陽性淋巴結(jié)。進(jìn)而，通過裝備專用的濾鏡，可以不使用照相機而用肉眼識別熒光。
2.體外診斷用試劑本發(fā)明的試劑也可以作為用于篩選的體外診斷劑來應(yīng)用?，F(xiàn)在，腫瘤標(biāo)記的定量是了解無法用肉眼檢測、或無法鑒定原發(fā)病灶的癌的存在的最一般的方法。但是，腫瘤標(biāo)記的癌特異性未必可以滿足需要，并且以單一的標(biāo)記探索所有的癌種類極為困難。
已經(jīng)確認(rèn)，端粒末端轉(zhuǎn)移酶在85％以上的人惡性腫瘤中活性上升，與其癌特異性相關(guān)性極高。
使用本發(fā)明的試劑的體外的癌診斷可以通過例如以下方式進(jìn)行。
除去從被檢者采集的全血中的紅血球，在其余細(xì)胞懸浮液中加入一定比率(0.1～10MOI、優(yōu)選、1MOI)的本發(fā)明的試劑，在試管內(nèi)混合。放置一定時間(例如12～48時間)，促進(jìn)病毒向癌細(xì)胞的感染和增殖，用流式細(xì)胞儀定量分析其細(xì)胞組分中GFP表達(dá)。使用該系統(tǒng)可以以高敏感度檢測存在于外周血中的游離癌細(xì)胞?？墒褂迷摲椒▉頇z測外周血中是否存在極為微量的游離癌細(xì)胞。
3.細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法本發(fā)明提供了一種細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑，其含有一種重組病毒，該病毒基因組的E1區(qū)域中整合了按如下順序含有人端粒末端轉(zhuǎn)移酶的啟動子、E1A基因、IRES序列和E1B基因的復(fù)制盒，并且病毒基因組的E3區(qū)域中整合了含有編碼標(biāo)記蛋白質(zhì)的基因以及可以調(diào)控該基因的表達(dá)的啟動子的標(biāo)記盒。優(yōu)選，作為癌細(xì)胞的細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)劑，也可以用于癌的基因治療，以及預(yù)防手術(shù)后的復(fù)發(fā)、防止和/或預(yù)防轉(zhuǎn)移等。
本發(fā)明的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑所含的重組病毒的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)盒中整合了由啟動子驅(qū)動的并且編碼可以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的蛋白質(zhì)的基因。
該重組病毒中使用的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)盒中可以含有編碼細(xì)胞死亡誘導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)的基因和可以調(diào)控該基因的表達(dá)的啟動子。因此，例如，如果在癌細(xì)胞中導(dǎo)入本發(fā)明的誘導(dǎo)劑，病毒在癌細(xì)胞中特異性增殖的結(jié)果是，細(xì)胞死亡誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量提高，其它正常細(xì)胞沒有受損，可以只在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
所謂編碼細(xì)胞死亡誘導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)的基因是指編碼與特定細(xì)胞的細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì)的基因。
作為細(xì)胞死亡誘導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)，可以例舉有例如，如下所示的蛋白質(zhì)，在本發(fā)明中可以整合編碼這些蛋白質(zhì)的基因。
例如、作為免疫相關(guān)蛋白質(zhì)，可以例舉有PA28。PA28是使細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶體活化的蛋白質(zhì)，在由于過量表達(dá)而引起免疫反應(yīng)的同時誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的蛋白質(zhì)。此外，作為細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白質(zhì)，可以例舉有TRAIL。TRAIL是指通過與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡細(xì)胞死亡的分子。作為端粒末端轉(zhuǎn)移酶相關(guān)蛋白質(zhì)，可以例舉有AU5。AU5具有在具有端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性的細(xì)胞中可以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的序列。
這些細(xì)胞死亡誘導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)的基因可以通過通常的基因工程的方法獲得。例如，作為基因工程的方法，可以采用使用一般可以使用的DNA合成裝置的核酸合成法。此外，分離或合成作為模板的基因序列后，設(shè)計特異于各基因的引物，可以使用采用PCR裝置擴(kuò)增所述基因序列的PCR法(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons(1987)Section 6.1-6.4)或采用克隆載體的基因擴(kuò)增法。上述方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以按照《分子克隆第2版》，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)等容易地進(jìn)行。獲得的PCR產(chǎn)物的純化，可以使用公知的方法。例如、有使用溴化乙錠的方法，使用SYBRGreenI(Molecular probes社)的方法，采用用GENECLEAN(funakoshi)、QIAGEN(QIAGEN社)等瓊脂糖凝膠的方法，使用DEAE-纖維素濾紙的方法，冷凍&壓縮法、使用透析管的方法等。在使用瓊脂糖凝膠時，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，從瓊脂糖凝膠切出DNA片段后進(jìn)行純化。根據(jù)需要，通過常用的序列測定法可以確認(rèn)獲得所預(yù)期的基因。例如，可以通過雙脫氧核苷酸鏈終止法(Sanger等人(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463)等進(jìn)行。此外，也可以通過利用適當(dāng)?shù)腄NA測序儀(例如，ABI PRISM(Applied Biosystems公司))分析序列。
此外，作為癌細(xì)胞的細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)物質(zhì)，也包括癌抑制基因。這是因為癌抑制基因具有抑制癌細(xì)胞的增殖的功能。此時，癌抑制基因可以例舉有，例如，在以往的基因治療中可以使用的以下基因。
p53(SEQ ID NO.11；Accesion No.M14694)多種癌p15(SEQ ID NO.12；Accesion No.L36844)多種癌p16(SEQ ID NO.13；Accesion No.L27211)多種癌APC(SEQ ID NO.14；Accesion No.M74088)大腸癌、胃癌、胰腺癌BRCA-1(SEQ ID NO.15；Accesion No.U14680)卵巢癌、乳腺癌DPC-4(SEQ ID NO.16；Accesion No.U44378)大腸癌、胰腺癌FHIT(SEQ ID NO.17；Accesion No.NM 112012)胃癌、肺癌、子宮癌p73(SEQ ID NO.18；Accesion No.Y11416)成神經(jīng)細(xì)胞瘤PATCHED(SEQ ID NO.19；Accesion No.U59464)基底細(xì)胞癌Rb p 110(SEQ ID NO.20；Accesion No.M15400)肺癌、骨肉瘤DCC(SEQ ID NO.21；Accesion No.X76132)大腸癌NF1(SEQ ID NO.22；Accesion No.NM 000267)1型神經(jīng)纖維瘤病NF2(SEQ ID NO.23；Accesion No.L11353)2型神經(jīng)纖維瘤病WT-1(SEQ ID NO.24；Accesion No.NM 000378)維爾姆斯瘤(Wilms tumor)這些癌抑制基因可以通過通常的基因工程的方法獲得。例如，作為基因工程的方法，可以使用采用一般使用的DNA合成裝置的核酸合成法。此外，在分離或合成作為模板的基因序列后，設(shè)計特異于各基因的引物，可以使用采用PCR裝置擴(kuò)增所述基因序列的PCR法或采用克隆載體的基因擴(kuò)增法。根據(jù)需要，可以用DNA測序儀確認(rèn)獲得所預(yù)期的基因。
作為可以調(diào)控上述基因表達(dá)的啟動子，如果是可對應(yīng)于表達(dá)作為靶的上述基因使用的病毒的適當(dāng)?shù)膯幼?，可以是任意一種?？梢詢?yōu)選使用CMV啟動子或hTERT啟動子，但是不限于這些啟動子，例如，可以使用SV40晚期啟動子、MMTV LTR啟動子、RSV LTR啟動子、SRα啟動子等。
本發(fā)明的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑也可以在原患部位應(yīng)用，也可以通過所有公知的方法、例如，在靜脈、肌肉、腹腔內(nèi)或皮下等，注射、從鼻腔、口腔或肺吸入、口服給藥、使用導(dǎo)管等的血管內(nèi)給藥等導(dǎo)入于生物體(作為對象的細(xì)胞和器官)內(nèi)。
此外，例如通過冷凍干燥等方法處理便于操作后，可以以其原狀或與賦形劑、增量劑、粘合劑、潤滑劑等公知的藥學(xué)上可接受的載體、公知的添加劑(包括緩沖劑、等滲化劑、螯合劑、著色劑、保存劑、香料、調(diào)味劑、甜味劑等)等相混合，可制備醫(yī)藥組合物。
本發(fā)明的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑根據(jù)片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、丸劑、液劑、糖漿等口服劑；注射劑、外用劑、栓劑、滴眼劑等非口服劑等形態(tài)，可經(jīng)口服或不經(jīng)口服給藥。優(yōu)選例如經(jīng)肌肉、腹腔等局部注射、經(jīng)靜脈注射等。
給藥量，根據(jù)有效成分的種類、給藥路徑、給藥對象、患者的年齡、體重、性別、癥狀等其它條件適當(dāng)選擇，但是，作為一日給藥量，通常作為有效成分的本發(fā)明病毒量為106～1011PFU(plaque formingunits)左右，優(yōu)選為109～1011PFU左右，可以每日給藥一次，也可以每日給藥多次。
此外，在使用本發(fā)明的病毒時，通過使用公知的免疫抑制劑等，抑制生物體的免疫，也可使該病毒感染易于進(jìn)行。
而且，本發(fā)明的病毒也可與選自于公知的抗癌劑和放射線中的至少一種抗癌劑組合使用?？拱﹦┛梢园幌抻谝韵挛镔|(zhì)。
(1)烷基化活性劑這種制劑具有通過在癌細(xì)胞的核酸蛋白質(zhì)中導(dǎo)入烷基，使細(xì)胞損壞發(fā)生的作用，可以例舉有例如卡波醌、白消安(マスタ一ド藥)、尼莫司汀(亞硝基脲類)等。
(2)代謝拮抗活性劑這種制劑具有通過在代謝過程中拮抗酶，抑制細(xì)胞合成的作用，可以例舉有，例如甲氨蝶呤(葉酸類)、巰基嘌呤(嘌呤類)、阿糖胞苷(嘧啶類)、氟尿嘧啶、替加氟、卡莫氟等。
(3)抗生物質(zhì)可以例舉有具有抗癌作用的放線菌素D、滿霉素(pleomycin)、阿霉素、絲裂霉素C等。
(4)微小管阻害活性劑這種制劑通過對微小管作用顯示出抗腫瘤效果，可以例舉有，例如多西他賽、紫杉醇(Taxane)、長春瑞賓、ピンクリスチン、長春堿(生物堿類)等。
(5)鉑制劑這種制劑具有通過構(gòu)成DNA鏈內(nèi)或鏈間結(jié)合或DNA蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制DNA合成的作用，例如，可以例舉有順鉑、アルボプラチン、奈達(dá)鉑等。
(6)拓?fù)洚悩?gòu)酶阻害活性劑抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的伊立替康(拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制藥)、鬼臼毒素衍生物(拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制藥)等。并且，所謂拓?fù)洚悩?gòu)酶，是指催化通過在DNA中暫時加入缺口改變DNA鏈的連接數(shù)目的反應(yīng)的酶。
據(jù)認(rèn)為，本發(fā)明的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑等由于以下理由產(chǎn)生副作用的可能性極低，可以認(rèn)為是一種非常安全的制劑。
(1)在正常體細(xì)胞中，幾乎沒有端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性，而且，本發(fā)明的病毒難以感染造血細(xì)胞等懸浮細(xì)胞。
(2)由于本發(fā)明的病毒具有增殖能力，所以可以比常規(guī)基因治療中使用的非增殖性病毒更低的濃度進(jìn)行使用。
(3)即使在本發(fā)明的病毒過量給藥的情況下，也可通過生物體內(nèi)常規(guī)免疫作用起到抗病毒的作用。
通過使本發(fā)明的重組病毒感染靶細(xì)胞，可以在靶細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。靶細(xì)胞的種類沒有特別的限定，可以例舉有，例如腫瘤細(xì)胞，增殖活躍的細(xì)胞、端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性上升的細(xì)胞等。
為了判斷細(xì)胞死亡是否被誘導(dǎo)，可以通過以下方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察。也就是說，如果使本發(fā)明的重組病毒感染附著于培養(yǎng)容器的底面的細(xì)胞一定時間，倒立顯微鏡下，細(xì)胞圓形化，從底面脫落，成為具有光澤的細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中。此時，細(xì)胞中維持其生命的機制被破壞，可以評斷細(xì)胞死亡已經(jīng)被誘導(dǎo)。此外，使用采用四唑鹽(MTT、XTT等)的市售的活細(xì)胞檢測試劑盒，可以確認(rèn)細(xì)胞死亡。
以下，通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明。但是，本發(fā)明并不受這些實施例的限定。
實施例1在體外通過共感染進(jìn)行的癌細(xì)胞顯像本實施例在使含有復(fù)制盒的病毒「Telomelysin」和含有標(biāo)記盒的非增殖型病毒「Ad-GFP」共感染時，預(yù)備在體外研究是否發(fā)出熒光。
使0.1MOI的Ad-GFP感染人大腸癌細(xì)胞SW620、人肺癌細(xì)胞A549、H1299(圖2)。
其結(jié)果是，即使使0.1MOI Ad-GFP感染人大腸癌細(xì)胞SW620、人肺癌細(xì)胞A549、H1299，也幾乎無法確認(rèn)綠色傾向，但是如果與1MOI的TRAD合用，可以只在癌細(xì)胞中檢測熒光，在WI38和NHLF等人成纖維細(xì)胞和人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)等正常細(xì)胞中完全沒有發(fā)現(xiàn)熒光(圖3)。
實施例2顯示在體外通過Telomelysin與Ad-GFP的共感染進(jìn)行的人癌組織本實施例在使含有復(fù)制盒的病毒「Telomelysin」和含有標(biāo)記盒的非增殖型病毒「Ad-GFP」共感染時，預(yù)備在體內(nèi)研究是否發(fā)出熒光。
在移植于裸鼠的背部皮下的人大腸癌SW620和人肺癌A549腫瘤中腫瘤內(nèi)給藥8×105PFU的Ad-GFP和8×106PFU的TRAD，隨時間推移觀察熒光。
其結(jié)果顯示，在任一腫瘤中給藥后第2天后檢測到斑狀的熒光，漸漸消失直至第14天(圖4)。
實施例3用Telomelysin-GFP進(jìn)行的癌細(xì)胞檢測1.在單一病毒中包括含有端粒末端轉(zhuǎn)移酶啟動子和E1基因的復(fù)制盒，以及含有編碼GFP蛋白質(zhì)的基因的標(biāo)記盒的GFP表達(dá)增殖型病毒(Telomelysin-GFP)的制備Telomelysin-GFP的概要如圖1所示。Telomelysin-GFP，由hTERT啟動子驅(qū)動E1A/IRES/E1B，可確認(rèn)其癌細(xì)胞特異性和端粒末端轉(zhuǎn)移酶特異性增殖·復(fù)制，另一方面，而且由啟動子驅(qū)動的Aequorea victorea來源的GFP基因整合到E3區(qū)域中。因此。發(fā)現(xiàn)病毒增殖的細(xì)胞通過激發(fā)光發(fā)出綠色熒光，可以使癌細(xì)胞可視化。
這種非增殖型病毒如下述方式制備。
2.重組病毒的制備根據(jù)從293細(xì)胞提取的RNA，使用以下特異的引物(E1A-S、E1A-AS)和PCR條件進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增出897bp的E1A基因。
E1A-S5’-ACA CCG GGA CTG AAA ATG AG-3’(SEQ IDNO.5)E1A-AS5’-CAC AGG TTT ACA CCT TAT GGC-3’(SEQ IDNO.6)PCR液組成1×PCR緩沖液0.2mM各dNTP5mM MgCl22.5U AmpliTaq Gold0.2μM各引物反應(yīng)條件95℃10分(95℃1分、56℃1分、72℃1.5分)×32個循環(huán)72℃7分4℃5分根據(jù)從293細(xì)胞提取的DNA，使用以下的引物(E1B-S、E1B-AS)進(jìn)行DNA-PCR，擴(kuò)增出1822bp的E1B基因。
E1B-S5’-CTG ACC TCA TGG AGG CTT GG-3’(SEQ IDNO.7)E1B-AS5’-GCC CAC ACA TTT CAG TAC CTC-3’(SEQ IDNO.8)PCR液組成、反應(yīng)條件(循環(huán)、溫度)與E1A基因的情況相同。
進(jìn)行各個PCR產(chǎn)物的TA克隆(TA Cloning kit dual Promoter；Invitrogen)，測定序列后，用制限性酶EcoRI切出分別為911bp(E1A)、1836bp(E1B)的DNA片段。
在pIRES載體(CLONTECH)的MluI切斷部位，SaII部位延其方向分別插入E1A，E1B(E1A-IRES I-E1B)。
在存在于E1A-IRES-E1B的E1A上游的XhoI部位延其方向插入用制限性酶MluI和BglII切出的455bp的hTERT啟動子序列(phTERT-E1A-IRES-E1B)。
通過制限性酶MfeI和NheI處理切出包含于pShuttle載體的巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子，在其部位插入用制限性酶NheI和NotI從phTERT-E1A-IRES-E1B中切出的3828bp的序列(pSh-hAIB)。
用AgeI/NheI切斷pEGFP-N1(CLONTECH)，用Klenow片段平末端化并自連(pEGFP-N2)。
用NsiI/AflII切斷該pEGFP-N2，用T4DNA聚合酶平末端化，使用BglII連接子制備BglII位點。在pHM11的BamHI部位插入該BglII片段(pHM11-EGFP-N2)。
進(jìn)而、在整合了phTERT-E1A-IRES-E1B的pShuttle載體(pSh-hAIB)的ClaI部位插入pHM11-EGFP-N2的Csp45I片段。
用制限性酶I-CeuI和PI-SceI從制備的重組基因切出4381bp的序列，插入于Adeno-X Expression System(CLONTECH)的Adeno-X ViralDNA中(AdenoX-hAIB)。用制限性酶PacI處理AdenoX0-hAIB，使之線狀化后，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，制備具有感染性的重組腺病毒(以下、稱為“Telomelysin-GFP”)。
實施例4人肺癌細(xì)胞的檢測試驗1.通過Telomelysin-GFP感染人肺癌細(xì)胞而產(chǎn)生的形態(tài)學(xué)的變化在體外使1MOI和10MOI Telomelysin-GFP感染培養(yǎng)中的人非小細(xì)胞肺癌來源的H1299細(xì)胞。具體的是，將5×104個H1299細(xì)胞接種于24孔板中，24小時后計算細(xì)胞數(shù)，然后以1MOI或10MOI的濃度的病毒添加于培養(yǎng)液中。然后，在倒立顯微鏡下隨著時間推移觀察細(xì)胞形態(tài)，研究病毒的細(xì)胞損壞活性。
其結(jié)果是，由于病毒濃度依賴性地且時間依賴性地增殖誘導(dǎo)了細(xì)胞死亡。10MOI感染后120小時，在倒立顯微鏡下大部分細(xì)胞呈圓形懸浮(圖5)。
2.通過Telomelysin-GFP感染人肺癌細(xì)胞產(chǎn)生的GFP熒光表達(dá)在熒光顯微鏡下觀察圖6中所示的倒立顯微鏡像。確認(rèn)了表示病毒以濃度依賴性以及時間依賴性增殖的GFP綠色熒光(圖6)。發(fā)現(xiàn)10MOI感染后72小時GFP表達(dá)的細(xì)胞最多，然后在細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)的同時，GFP陽性細(xì)胞數(shù)也減少了(圖6)。
3.通過定量的實時PCR進(jìn)行的Telomelysin-GFP增殖的驗證使10MOI的Telomelysin-GFP感染H1299人肺癌細(xì)胞，自2小時后，26、50、74小時后回收細(xì)胞，提取DNA。以Telomelysin-GFP所具有的E1A基因為靶，使用引物進(jìn)行實時PCR，定量分析病毒增殖·復(fù)制。所使用的引物和PCR條件如下所示。
E1A-S5’-CCT GTG TCT AGA GAA TGC AA-3’(SEQ IDNO.9)E1A-AS5’-ACA GCT CAA GTC CAA AGG TT-3’(SEQ IDNO.10)PCR液組成1×LC FastStart DNA Master SYBR Green I3mM MgCl20.5μM各引物反應(yīng)條件95℃10分(95℃10秒、60℃15秒、72℃8秒)×40個循環(huán)70℃15秒40℃30秒其結(jié)果表示，Telomelysin-GFP在26小時后已經(jīng)增殖成100萬倍(圖7)，然后，到達(dá)曲線平穩(wěn)段，但是稍延遲一會后，GFP熒光漸漸增強(圖7)。
實施例5人大腸癌細(xì)胞的檢測試驗1.通過Telomelysin-GFP感染人肺癌細(xì)胞產(chǎn)生的GFP熒光表達(dá)使10MOI Telomelysin-GFP感染人大腸癌來源的SW620細(xì)胞，在倒立顯微鏡和熒光顯微鏡下隨著時間推移觀察變化。
其結(jié)果是，與H1299細(xì)胞的情況相同，確認(rèn)了表示病毒以時間依賴性增殖的GFP綠色熒光(圖8)。
2.通過定量的實時PCR進(jìn)行的Telomelysin-GFP增殖的驗證與H1299細(xì)胞的情況相同，使10MOI Telomelysin-GFP感染SW620人大腸癌細(xì)胞，自2小時后，26、50、74、98小時后回收細(xì)胞，提取DNA、通過實時PCR定量地分析病毒增殖。實時PCR的條件(反應(yīng)液組成、個循環(huán)、時間等)與H1299細(xì)胞的情況相同。
其結(jié)果是，Telomelysin-GFP在26小時后已經(jīng)增殖成100萬倍，然后大致呈曲線平穩(wěn)段直至98時間后(圖9)。
實施例61.通過Telomelysin-GFP感染正常人肺成纖維細(xì)胞(NHLF)而產(chǎn)生的形態(tài)學(xué)的變化在體外使1MOI和10MOI Telomelysin-GFP感染培養(yǎng)中的正常人肺成纖維細(xì)胞(NHLF)，在倒立顯微鏡下觀察直至120小時。
其結(jié)果是，沒有發(fā)現(xiàn)形態(tài)學(xué)的變化，未誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(圖10)。
2.通過Telomelysin-GFP感染正常人肺成纖維細(xì)胞(NHLF)產(chǎn)生的GFP熒光表達(dá)如果在熒光顯微鏡下觀察圖10的倒立顯微鏡像，在若干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)GFP熒光表達(dá)，但是如果考慮細(xì)胞密度，與癌細(xì)胞相比，極稀。因此，認(rèn)為Telomelysin-GFP在正常細(xì)胞中幾乎不增殖·復(fù)制(圖11)。
3.通過定量的實時PCR進(jìn)行的Telomelysin-GFP增殖的驗證如上所述，使10MOI Telomelysin-GFP感染H1299人肺癌細(xì)胞、SW620人大腸癌細(xì)胞、正常人肺成纖維細(xì)胞(NHLF)，隨時間推移回收細(xì)胞，提取DNA、通過實時PCR定量地分析病毒增殖。
其結(jié)果是，癌細(xì)胞中，Telomelysin-GFP在24時間后增殖成約100萬倍，在72時間后發(fā)出顯著的GFP熒光，與之相對，NHLF中，在72時間后停止于1000倍程度的增殖，幾乎無法檢測到GFP熒光(圖12)。
實施例7通過熒光成像對Telomelysin-GFP的腫瘤內(nèi)增殖·復(fù)制的檢測1.在移植于裸鼠的H1299人肺癌腫瘤內(nèi)給藥107PFU的Telomelysin-GFP，用CCD照相機隨時間推移觀察GFP熒光表達(dá)。
其結(jié)果是，在24小時內(nèi)確認(rèn)了由Telomelysin-GFP增殖產(chǎn)生的GFP熒光表達(dá)，3天后、5天后，其范圍和亮度增強(圖13)。
2.在移植于裸鼠的H1299人肺癌腫瘤內(nèi)給藥107PFU的Telomelysin-GFP，1周后和3周后摘出皮下腫瘤。用CCD照相機觀察到腫瘤全體和切面的GFP熒光表達(dá)。
其結(jié)果是，即使在摘出腫瘤表面上的熒光表達(dá)微弱時，也可以確認(rèn)在切面上大范圍的Telomelysin-GFP的增殖，在3周后的組織中大部分腫瘤整體中確認(rèn)了熒光(圖14)。
3.與上述相同的是，將HT29人大腸癌細(xì)胞移植至作為原位模型的裸鼠的直腸壁內(nèi)，在形成肉眼的腫瘤時給藥107PFU的Telomelysin-GFP。用CCD照相機在1周后確認(rèn)了由Telomelysin-GFP增殖產(chǎn)生的GFP熒光表達(dá)，其熒光表達(dá)維持至3周后(圖15)。
實施例81.在使用裸鼠和HT29人大腸癌細(xì)胞的原位直腸癌模型中的組織學(xué)的分析將HT29人大腸癌細(xì)胞移植至裸鼠的直腸壁內(nèi)，在形成肉眼的腫瘤時摘出腫瘤，用蘇木精和伊紅(HE)染色分析。
其結(jié)果是，在直腸周圍形成腫瘤，而且也在直腸壁內(nèi)的淋巴管內(nèi)確認(rèn)了腫瘤細(xì)胞塊(圖16)。
2.在使用裸鼠和HT29人大腸癌細(xì)胞的同所性直腸癌模型中的剖腹所見將HT29人大腸癌細(xì)胞移植至直腸壁內(nèi)后，在形成肉眼的腫瘤時開腹，發(fā)現(xiàn)了3條大動脈周圍的淋巴結(jié)(LN)的腫脹(圖17)。
3.通過熒光成像對HT29直腸腫瘤和主動脈旁淋巴結(jié)中Telomelysin-GFP的腫瘤內(nèi)增殖·復(fù)制進(jìn)行的檢測用CCD照相機進(jìn)行熒光成像，在被移植的HT29直腸腫瘤和3個中的1個主動脈旁淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)了GFP熒光表達(dá)(圖18)。
4.通過熒光成像對主動脈旁淋巴結(jié)中的Telomelysin-GFP的腫瘤內(nèi)增殖·復(fù)制進(jìn)行的檢測通過CCD照相機進(jìn)行熒光成像，只在3個主動脈旁淋巴結(jié)中的1個中發(fā)現(xiàn)了GFP熒光表達(dá)(圖19)。
5.通過熒光成像對主動脈旁淋巴結(jié)中的Telomelysin-GFP的腫瘤內(nèi)增殖·復(fù)制進(jìn)行的檢測對主動脈旁淋巴結(jié)進(jìn)行了組織學(xué)分析，其結(jié)果是，通過用CCD照相機進(jìn)行的熒光成像，只在1個GFP熒光表達(dá)陽性的對象中檢測到了轉(zhuǎn)移腫瘤組織，只在轉(zhuǎn)移陽性淋巴結(jié)中確認(rèn)了Telomelysin-GFP的增殖(圖20)。
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工業(yè)上利用的可能性根據(jù)本發(fā)明，可以提供一種癌細(xì)胞檢測用試劑或癌診斷用試劑和細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑。本發(fā)明的試劑可以在生物體內(nèi)以極高敏感度檢測癌細(xì)胞，因此對于所有導(dǎo)航手術(shù)等有用。
序列表自由文本SEQ ID NO.5引物SEQ ID NO.6引物SEQ ID NO.7引物
SEQ ID NO.8引物SEQ ID NO.9引物SEQ ID NO.10引物序列表<110>Oncolys BioPharma Inc.
<120>含有Telomelysin/GFP基因的重組病毒<130>PCT05-0070<150>JP2004-285383<151>2004-09-29<160>24<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>455<212>DNA<213>智人(homo sapiens)<400>1tggcccctcc ctcgggttac cccacagcct aggccgattc gacctctctc cgctggggcc 60ctcgctggcg tccctgcacc ctgggagcgc gagcggcgcg cgggcgggga agcgcggccc 120agacccccgg gtccgcccgg agcagctgcg ctgtcggggc caggccgggc tcccagtgga 180ttcgcgggca cagacgccca ggaccgcgct ccccacgtgg cggagggact ggggacccgg 240gcacccgtcc tgccccttca ccttccagct ccgcctcctc cgcgcggacc ccgccccgtc 300ccgacccctc ccgggtcccc ggcccagccc cctccgggcc ctcccagccc ctccccttcc 360tttccgcggc cccgccctct cctcgcggcg cgagtttcag gcagcgctgc gtcctgctgc 420gcacgtggga agccctggcc ccggccaccc ccgcg 455<210>2<211>899<212>DNA<213>腺病毒(adenovirus)
<400>2acaccgggac tgaaaatgag acatattatc tgccacggag gtgttattac cgaagaaatg 60gccgccagtc ttttggacca gctgatcgaa gaggtactgg ctgataatct tccacctcct 120agccattttg aaccacctac ccttcacgaa ctgtatgatt tagacgtgac ggcccccgaa 180gatcccaacg aggaggcggt ttcgcagatt tttcccgact ctgtaatgtt ggcggtgcag 240gaagggattg acttactcac ttttccgccg gcgcccggtt ctccggagcc gcctcacctt 300tcccggcagc ccgagcagcc ggagcagaga gccttgggtc cggtttctat gccaaacctt 360gtaccggagg tgatcgatct tacctgccac gaggctggct ttccacccag tgacgacgag 420gatgaagagg gtgaggagtt tgtgttagat tatgtggagc accccgggca cggttgcagg 480tcttgtcatt atcaccggag gaatacgggg gacccagata ttatgtgttc gctttgctat 540atgaggacct gtggcatgtt tgtctacagt cctgtgtctg aacctgagcc tgagcccgag 600ccagaaccgg agcctgcaag acctacccgc cgtcctaaaa tggcgcctgc tatcctgaga 660cgcccgacat cacctgtgtc tagagaatgc aatagtagta cggatagctg tgactccggt 720ccttctaaca cacctcctga gatacacccg gtggtcccgc tgtgccccat taaaccagtt 780gccgtgagag ttggtgggcg tcgccaggct gtggaatgta tcgaggactt gcttaacgag 840cctgggcaac ctttggactt gagctgtaaa cgccccaggc cataaggtgt aaacctgtg 899<210>3<211>1823<212>DNA<213>腺病毒<400>3ctgacctcat ggaggcttgg gagtgtttgg aagatttttc tgctgtgcgt aacttgctgg 60aacagagctc taacagtacc tcttggtttt ggaggtttct gtggggctca tcccaggcaa 120agttagtctg cagaattaag gaggattaca agtgggaatt tgaagagctt ttgaaatcct 180
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權(quán)利要求
1.一種癌細(xì)胞檢測用試劑，其含有一種重組病毒，在該病毒基因組的E1區(qū)域中整合了按如下順序含有人端粒末端轉(zhuǎn)移酶的啟動子、E1A基因、IRES序列和E1B基因的復(fù)制盒，并且在該病毒基因組的E3區(qū)域中整合了含有編碼標(biāo)記蛋白質(zhì)的基因以及可以調(diào)控該基因的表達(dá)的啟動子的標(biāo)記盒。
2.一種癌診斷用試劑，其含有一種重組病毒，在該病毒基因組的E1區(qū)域中整合了按如下順序含有人端粒末端轉(zhuǎn)移酶的啟動子、E1A基因、IRES序列和E1B基因的復(fù)制盒，并且在該病毒基因組的E3區(qū)域中整合了含有編碼標(biāo)記蛋白質(zhì)的基因以及可以調(diào)控該基因的表達(dá)的啟動子的標(biāo)記盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑，其用于體內(nèi)檢測、診斷或?qū)Ш绞中g(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑，人端粒末端轉(zhuǎn)移酶的啟動子是hTERT啟動子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑，標(biāo)記蛋白質(zhì)是GFP。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑，可以調(diào)控該編碼標(biāo)記蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)的啟動子是巨細(xì)胞病毒啟動子或hTERT啟動子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑，其中，所述的病毒是腺病毒。
8.一種細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑，其含有一種重組病毒，該病毒基因組的E1區(qū)域中整合了按如下順序含有人端粒末端轉(zhuǎn)移酶的啟動子、E1A基因、IRES序列和E1B基因的復(fù)制盒，并且病毒基因組的E3區(qū)域中整合了含有編碼標(biāo)記蛋白質(zhì)的基因以及可以調(diào)控該基因的表達(dá)的啟動子的標(biāo)記盒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的誘導(dǎo)劑，其中，所述的人端粒末端轉(zhuǎn)移酶的啟動子是hTERT啟動子。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的誘導(dǎo)劑，其中，所述的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)選自免疫相關(guān)蛋白質(zhì)、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白質(zhì)和端粒末端轉(zhuǎn)移酶相關(guān)蛋白質(zhì)中的至少一種。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的誘導(dǎo)劑，其中，所述的免疫相關(guān)蛋白質(zhì)是PA28。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的誘導(dǎo)劑，其中，所述的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白質(zhì)是TRAIL。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的誘導(dǎo)劑，端粒末端轉(zhuǎn)移酶相關(guān)蛋白質(zhì)是AU5。
14.根據(jù)權(quán)利要求8所述的誘導(dǎo)劑，可以調(diào)控細(xì)胞死亡誘導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)的啟動子是巨細(xì)胞病毒啟動子或hTERT啟動子。
15.根據(jù)權(quán)利要求8所述的誘導(dǎo)劑，其中，所述的病毒是腺病毒。
16.根據(jù)權(quán)利要求8所述的誘導(dǎo)劑，其中，所述的細(xì)胞是癌細(xì)胞。
17.一種癌細(xì)胞的檢測方法，其特征在于使權(quán)利要求1和3～6任一項所述的試劑感染癌細(xì)胞，檢測由所述癌細(xì)胞發(fā)出的熒光。
18.一種癌細(xì)胞的檢測方法，其特征在于使權(quán)利要求2～6任一項所述的試劑感染癌細(xì)胞，檢測由所述癌細(xì)胞發(fā)出的熒光。
19.一種誘導(dǎo)靶細(xì)胞的細(xì)胞死亡的方法，其特征在于使權(quán)利要求8～16任一項所述的誘導(dǎo)劑感染靶細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供一種癌細(xì)胞檢測用或癌診斷用試劑。具體而言，涉及一種癌細(xì)胞檢測用試劑，其含有一種重組病毒，其中所述病毒基因組的E1區(qū)域中整合了按如下順序含有人端粒末端轉(zhuǎn)移酶的啟動子、E1A基因、IRES序列和E1B基因的復(fù)制盒，并且病毒基因組的E3區(qū)域中整合了含有編碼標(biāo)記蛋白質(zhì)的基因以及可以調(diào)控該基因的表達(dá)的啟動子的標(biāo)記盒。
文檔編號A61K48/00GK101035906SQ200580032788
公開日2007年9月12日 申請日期2005年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月29日
發(fā)明者藤原俊義, 田中紀(jì)章, 京哲, 水口裕之, 早川堯夫 申請人:癌康理生物制藥株式會社