專利名稱：癌基因alc1在肝癌治療中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學特別是基因治療領(lǐng)域，尤其是ALCl基因的抑制劑在抑制 肝癌和預防肝癌發(fā)生中的應用。
背景技術(shù)：
肝細胞性肝癌是常見預后較差的腫瘤之一。一號染色體長臂擴增是原發(fā)性肝癌中 最常見的遺傳學改變，通過比較基因組雜交的方法在58 78%的肝癌病人證實這一改變 的存在H。當擴增區(qū)域被縮小到lq213’5，就提示這段區(qū)域里存在在肝癌致病過程中起到重 要作用的致癌基因。除此而外，一號染色體長臂的擴增在其他許多種類的實體瘤中也較為 常見，例如膀胱癌6、乳腺癌7、鼻咽癌8以及食道癌9。因此，要明確實體瘤特別是肝細胞性 肝癌的分子機理，對導致lq21區(qū)域擴增的致癌基因的研究就顯得十分必要。利用顯微切割DNA對染色體區(qū)域特異性的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行雜交篩選是一種快速有 效的從擴增子分離出擴增基因的方法“1’11。近來，ALCl (GenBank登錄號AF537213)即是用 這種方法發(fā)現(xiàn)的基因?；驕y序分析得出ALCl屬于類SNF2家族。然而，這種ALCl的具體 作用是本領(lǐng)域未知的。因此，本領(lǐng)域迫切的需要了解肝細胞肝癌的機理，和診斷肝細胞肝癌的有效工具， 以及抑制肝細胞癌的有效治療和預防手段。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種新的治療和抑制肝癌的方法和藥物。在本發(fā)明的第一個方面，提供了 ALCl基因的抑制劑用于制備治療或預防癌癥的 藥物的用途。在一個優(yōu)選例中，癌癥是肝癌。在一個更優(yōu)選的實施例中，肝癌是肝細胞肝癌。在另一個優(yōu)選實施方式中，ALCl基因的抑制劑是干擾RNA、反義核酸。在本發(fā)明的第二個方面，提供了 ALCl基因的反義核酸探針的用途，用于制備診斷 癌癥的試劑盒。在一個優(yōu)選例中，癌癥是肝癌。在一個更優(yōu)選的實施例中，肝癌是肝細胞肝 癌。


圖Ia顯示了熒光原位雜交檢測60例肝細胞癌中Iq不同區(qū)域的擴增頻率。各區(qū) 域擴增頻率顯示為柱形圖。圖Ib顯示了 ALCl基因的功能域。圖Ic顯示了 ALCl蛋白在細 胞中的定位。圖Id顯示了通過熒光原位雜交方法檢測到了 lq21的擴增信號。圖2a顯示了熒光原位雜交對HCC組織芯片中ALCl擴增的檢測。圖2b和圖2c 分別顯示了癌旁組織和原發(fā)性肝細胞肝癌病理中的免疫組織化學檢測。圖2d顯示了通過 Northern印跡法對24例原發(fā)性肝細胞肝癌標本的RNA水平的檢測結(jié)果。圖2e顯示了通過 Northern印跡法對8種肝細胞肝癌細胞株的RNA水平的檢測結(jié)果。 圖3a顯示了 Northern法檢測ALCl轉(zhuǎn)染的L02和QYC-7703細胞中ALCl基因的表達，使用空載體轉(zhuǎn)染的細胞作為對照。圖3b顯示了利用軟瓊脂實驗對ALCl轉(zhuǎn)染或空載體 轉(zhuǎn)染的L02及QYC-7703細胞的克隆形成速度進行檢測，集落形成的百分數(shù)(**p < 0. 05)。 圖3c顯示了 ALCl轉(zhuǎn)染的L02(左)及QYC-7703細胞(右)注射裸鼠，出現(xiàn)的典型腫瘤的 形成。圖3d顯示了流式細胞儀檢測結(jié)果，證實ALCl的高表達導致QGY-7703細胞與空載體 轉(zhuǎn)染的細胞相比能夠促進G1/S周期遷移。圖4a顯示了 ALCl干擾分子對其表達的抑制作用的RT-PCR檢測結(jié)果。圖4b顯示 了集落形成實驗的結(jié)果，RNA干擾后的H2M細胞軟瓊脂中的克隆形成實驗被顯著減少(**p <0.05)。圖4c顯示了流式細胞分析結(jié)果。 圖5a顯示了 Northern印跡分析4只第一代ALCl轉(zhuǎn)基因老鼠的ALCl表達水平。 圖5b顯示了 21號和38號Southern印跡法檢測到的包含入ALCl基因的BamHI酶切片段。 圖5c顯示了轉(zhuǎn)基因老鼠1號中形成的唾液腺腺泡瘤的免疫組織化學分析。圖5d顯示了 2 號轉(zhuǎn)基因老鼠中形成的肝臟腫瘤照片和免疫組化分析的結(jié)果。圖5e顯示了老鼠身上發(fā)現(xiàn) 的可見的肝臟脂肪瘤(左)。通過組織化學研究，證實為肝細胞性肝癌(右)。圖5f顯示 了酒精毒性實驗后典型的發(fā)育不良的免疫組織化學分析的結(jié)果。圖6a顯示了 RT-PCR檢測的轉(zhuǎn)基因小鼠MEF細胞中ALC表達水平。圖6b顯示了 流式細胞計數(shù)分析顯不的ALCl轉(zhuǎn)基因和野生型MEF的DNA含量。圖6c顯不了 Western印 跡分析的結(jié)果，顯示與空載體轉(zhuǎn)染的QYC-7703細胞相比，ALCl轉(zhuǎn)染細胞的p53及p21水平 下調(diào)，而細胞周期蛋白E與cdk2上調(diào)。β -肌動蛋白作為參照。
具體實施例方式通過顯微切割DNA對染色體區(qū)特異性的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行雜交篩選，發(fā)明人在先前的 研究中從肝癌中擴增出的ALCl (GeneBank登錄號.AF537213)?；驕y序分析得出ALCl屬 于類SNF2家族。我們發(fā)現(xiàn)ALCl在50%原發(fā)性肝細胞肝癌中異常高表達。ALCl的致癌作 用通過腫瘤形成實驗和ALCl轉(zhuǎn)基因老鼠實驗中得到證實。同時，ALCl的致癌分子機理與 促進Ρ53的泛素化降解有關(guān)。本發(fā)明所指的“ALC1”癌基因包括其完整的DNA編碼序列，其RNA序列，其突變體， 以及其功能上活性的片段。需理解的是，當編碼相同的氨基酸時，密碼子中的核苷酸的取代 是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而產(chǎn)生的保守的氨基酸取代時，核苷酸的變換 也是可被接受的。在得到了 ALCl的核酸片段的情況下，可根據(jù)核苷酸序列來設計特異性探針。核苷 酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴 增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市 售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有 關(guān)序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按 正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通 過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和 細胞中。本發(fā)明中，ALCl多核苷酸序列可插入到重組表達載體中?？傊灰茉谒拗黧w 內(nèi)復制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、 啟動子、標記基因和翻譯控制元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含ALCl的DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻 譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。 所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。轉(zhuǎn)化載體還 包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的 宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋 白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適 當?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質(zhì)。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高 等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬的細菌細胞；真菌細胞 如酵母；植物細胞；昆蟲細胞；動物細胞等。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿上細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當宿主為原 核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的 方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方 法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用 的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下 進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學誘導) 誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如 果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這 些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用 蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、 吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。在獲得了核酸序列后，可根據(jù)核酸序列設計特異性核酸探針。設計探針的方法是 本領(lǐng)域常規(guī)的，可見Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述。檢測生物樣品中是否存在DKK_1蛋白或核酸的示范性 方法包括獲得測試受試者的生物樣品，使該生物樣品接觸能與DKK-ImRNA或基因組DNA雜 交的標記的核酸探針。該核酸探針可以是，例如人的核酸或及一部分，如長至少15、30、50、 100個核苷酸并能在嚴謹條件下與DKK-ImRNA或基因組DNA充分雜交的核酸探針。用于本發(fā)明診斷試驗的其它探針如本文所述。核酸探針與擴增的標記序列接觸。該探針優(yōu)選連接到一種發(fā)色團，但可被放射標記。在另一個實施例中，探針連接到一種結(jié)合伴侶上，如抗體或生物素，或另一種攜帶可檢 測結(jié)構(gòu)域的結(jié)合伴侶上。在傳統(tǒng)的方法中，檢測可通過Southern印跡以及與標記的探針雜交來進行。 Southern印跡所涉及的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(參見Sambrook等，1989)。常規(guī) 的檢測還有生物芯片、熒光顯影技術(shù)、細胞流式計數(shù)等。本發(fā)明也包括試劑盒，以進行這里描述的任何方法。在一個非限制的實例中，所述 試劑盒將以適當?shù)娜萜餍问桨@些試劑中的一種或多種。所述試劑盒也可包含用于RNA 分離、擴增細胞中RNA的純化的試劑、標記等。試劑盒的組分可以以水介質(zhì)的形式或以凍干的形式來包裝。試劑盒中適當?shù)娜萜?通常至少包括一種小瓶、試管、長頸瓶、寶特瓶、針筒或其它容器，其中可放置一種組分，并 且優(yōu)選地，可進行適當?shù)氐确?。在試劑盒中存在多于一種的組分時，試劑盒中通常也將包含 第二、第三或其它附加的容器，其中分離地放置附加的組分。然而，不同組合的組分可被包 含在一個小瓶中。本發(fā)明的試劑盒通常也將包括一種用于容納反應物的容器，密封以用于 商業(yè)銷售。這種容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī) 條件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例IALCl基因的識別肝癌樣本來源于中山大學腫瘤防治中心。人肝細胞株L02和肝癌細胞株BEL7402， QASG7701, QGY-7703, PLC8024, CRL8064, IfepG2 來源于中國醫(yī)科院病毒所；H2M 和 H4M 為 中山大學腫瘤防治中心關(guān)新元教授課題組建立保存。其中QSG-7701，QGY-7703, PLC8024, CRL8064s是乙肝病毒陽性細胞株，而L02，BEL7402, H印G2，H2M，H4M是乙肝病毒陰性細胞株。為了明確Iq擴增的具體區(qū)域，通過熒光原位雜交對60例原發(fā)性肝細胞肝癌標本 的Iq區(qū)域中十個不同的擴增區(qū)進行檢測。結(jié)果顯示lq21是最常見的擴增區(qū)域，在60%的 肝細胞肝癌中得到證實(圖la)。為了分離lq21擴增區(qū)域的目的基因，從一例lq21區(qū)域擴 增的原發(fā)性肝癌病例cDNA文庫(中山大學腫瘤防治中心)中，利用lq21的顯微切割DNA 來篩選區(qū)域特異性的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。使用這種方法，分離出一個待定的致癌基因ALC1。ALCl基 因的全長2，980bp，蛋白產(chǎn)物包含897aa。ALCl蛋白產(chǎn)物包含保守的SNF2_N功能域，解旋酶 超家族功能域以及Macro功能域(圖lb)。我們將ALCl的開放閱讀框克隆到真核表達載體 中，ALCl與載體上的綠色熒光蛋白形成融合蛋白，我們觀察到ALCl蛋白定位在細胞核(圖 Ic)。圖Id顯示通過熒光原位雜交方法檢測到了 lq21的擴增信號。實施例2肝細胞肝癌中ALCl基因的擴增及過表達利用熒光原位雜交對320例肝細胞肝癌(中山大學腫瘤防治中心)的組織芯片進 行ALCl擴增情況的檢測。將上文實施例1中(正常人染色體)切下的5個拷貝的lq21用UNl引物(5’ CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG 3’ )進行PCR擴增，如實施例1中所述用綠色熒光蛋白篩選 雜交。將5yg PCR產(chǎn)物固定于尼龍膜(B. D. USA)上，用含有l(wèi)q21擴增的肝癌樣本來源的 cDNA雜交，嚴格洗膜后，特異性結(jié)合的cDNA被洗脫，PCR回復，測序分析。用包含有ALCl基 因的BAC克隆(RPl 1-337C18，BACPAC來源中心(BPRC)，USA)被用于間期FISH實驗。標記 BAC DNA，然后用FISH方法與分裂中期核雜交。50. 6%的原發(fā)性肝細胞肝癌存在ALCl高表達(圖2a)。
對組織芯片進行免疫組織化學檢測。組織芯片由320個經(jīng)甲醛固定、蠟塊包埋的 肝癌組織制作而成。5微米連續(xù)切片。免疫組化研究采用經(jīng)典的鏈霉素-生物素_過氧化 物酶方法完成。組織芯片經(jīng)脫蠟處理后，采用抗ALCl多克隆抗體(博士德生物科技公司， 武漢，中國)1 100稀釋后進行抗體孵育4°C過夜。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)ALCl基因的蛋白水平在腫瘤組織中相對于相應的癌旁組織 明顯增高，52. 4%的肝癌標本顯示出ALCl蛋白水平的高表達(圖2b和2c)。此外，利用 Northern印跡法對24例原發(fā)性肝細胞肝癌標本及8種肝細胞肝癌細胞株的ALCl基因的 RNA水平進行檢測，ALCl基因高表達在13/24(54. 2% )肝細胞肝癌標本及7/8肝細胞肝癌 的細胞株中得到證實(圖2e)。實施例3ALC1的致癌作用為了研究ALCl基因的致癌作用，ALCl基因的全長cDNA被克隆到pCDNA3. 1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA)的真核表達載體中，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至人正常肝細胞株L02以及肝 癌細胞株QYC-7703。轉(zhuǎn)染細胞的ALCl表達水平通過Northern印跡法檢測(圖3a)。ALCl的 致癌活性通過軟瓊脂實驗及裸鼠瘤形成實驗來進行研究。軟瓊脂集落形成實驗步驟如下 用0.4%的低熔點瓊脂糖(Sigma-Aldrich，USA)重懸1 X IO4個細胞，接種于已鋪有0. 6% 低熔點瓊脂糖的六孔板中，在第21天時計數(shù)那些至少4倍大于單細胞的集落數(shù)。實驗重復 三次。裸鼠成瘤試驗采用4-6周齡裸鼠，接種4X IO6個細胞。實驗組轉(zhuǎn)染細胞接種于小鼠 的背部右側(cè)，空白對照組轉(zhuǎn)染細胞接種于同一只小鼠的背部左側(cè)。觀察、測量腫瘤生長情況 一個月。如圖3b顯示ALCl基因轉(zhuǎn)染的L02及QYC-7703細胞相比空載體轉(zhuǎn)染的細胞能夠在 軟瓊脂中形成克隆。利用裸鼠進行的腫瘤形成實驗證實ALCl基因能夠顯著地增加實驗動 物腫瘤發(fā)生的敏感性。用ALCl或空載體轉(zhuǎn)染的L02細胞分別注射6只裸鼠，注射ALCl轉(zhuǎn) 染細胞株組有4只裸鼠形成腫瘤，而空載體轉(zhuǎn)染組無裸鼠形成腫瘤(圖3c)。同時，用ALCl 或空載體轉(zhuǎn)染的QYC-7703細胞分別注射12只裸鼠，注射ALCl轉(zhuǎn)染細胞株組有12只裸鼠形 成腫瘤，而空載體轉(zhuǎn)染組有4只裸鼠形成腫瘤。此外，ALCl轉(zhuǎn)染的QYC-7703細胞形成的腫 瘤大小(平均為464平方毫米)顯著地大于空載體轉(zhuǎn)染組(平均為88立方毫米，T-test, ρ < 0. 001)。 實施例4ALC1高表達促進G1/S遷移為了研究ALCl基因在肝細胞肝癌發(fā)生發(fā)展中的分子機制，我們研究ALCl基因在 細胞周期中作用。通過無血清培養(yǎng)3天將細胞同步化在Gl期，加入血清刺激ALCl或空載 體轉(zhuǎn)染的QYC-7703細胞進入G1/S周期遷移。用含10 % 胎牛血清的 DMEM(Dulbecco，s 改良 Eagle，s 培養(yǎng)基，Invitrogen, Carlsbad, CA)培養(yǎng)ALCl轉(zhuǎn)染和空載體轉(zhuǎn)染的QGY-7703細胞。當細胞生長到70%時撤去血清，72小時后，重新加入10%胎牛血清培養(yǎng)12小時。70%乙醇固定細胞，碘化丙錠染色， 流式細胞儀分析細胞DNA含量。實驗重復三次。 結(jié)果顯示ALCl基因有利于細胞DNA合成以及促進G1/S周期遷移(圖3d)。細胞 培養(yǎng)在完全培養(yǎng)液以及無血清培養(yǎng)的條件下時，ALCl基因或空載體轉(zhuǎn)染細胞中處于Gl和S 期的細胞百分比類似，而當細胞在無血清培養(yǎng)后再加入血清刺激12小時后，ALCl基因轉(zhuǎn)染 的細胞中處于S期的細胞百分比(38. 7% )顯著高于空載體轉(zhuǎn)染細胞組(26. 9% )。
實施例5RNA干擾技術(shù)沉默ALCl基因的表達
肝細胞肝癌細胞株H2M具有較高的ALCl表達水平，因此將其應用于RNA干擾實 驗。使用 siRNA (Ambion，Inc.，Austin, TX)轉(zhuǎn)染 H2M 細胞，轉(zhuǎn)染試劑使用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，按照實際說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48小時，抽提細胞的RNA，運用逆轉(zhuǎn) 錄PCR方法檢測基因沉默效果。實驗重復三次。3個針對ALCl基因的RNA干擾分子被應用于沉默ALCl的表達，ALCl_sil及 ALCl-si2被證實能夠有效地沉默ALCl基因的表達(圖4a)。軟瓊脂實驗顯示因為ALCl表 達的沉默，克隆形成能力明顯降低(Student' s T-test, ρ < 0· 05)(圖4b)。此外，利用流 式細胞儀測定DNA含量表明ALCl-sil能夠抑制細胞周期G1/S遷移(圖4c)。實施例6ALC1轉(zhuǎn)基因老鼠模型為了進一步研究ALCl基因的在體內(nèi)的功能，ALCl廣泛表達的轉(zhuǎn)基因老鼠模型被 建立起來。4只第一代的轉(zhuǎn)基因老鼠，包含3只雄性(3，26和28系)，1只雌性(21系)。通 過PCR的方法確定它們的基因表型并且用Northern印跡法確定ALCl的表達水平。21和38 系轉(zhuǎn)基因老鼠可以將轉(zhuǎn)入基因成功地傳于后代，因此將它們用于進一步的功能研究中(圖 5a)。利用Southern印跡法檢測到2段不同的包含轉(zhuǎn)入ALCl基因的BamHI酶切片段(21 系6kb和38系8kb)，說明ALCl基因成功地整合到21和38系老鼠基因組不同的位置上 (圖5b)。利用RT-PCR檢測到轉(zhuǎn)基因老鼠的肝、腦、心臟、肺、子宮以及前列腺都有ALCl基 因表達，而腎臟和睪丸無表達。ALCl轉(zhuǎn)基因和野生型老鼠不能通過體重和大小來區(qū)分。實施例7ALC1轉(zhuǎn)基因老鼠的自發(fā)腫瘤形成在12只ALCl轉(zhuǎn)基因老鼠(來源于實施例6，其品系為DBAXC57BL/6)中，通過超 過22周的觀察，有4只被觀察到有自發(fā)腫瘤形成，而15只野生型老鼠都沒有腫瘤形成。1 號老鼠同時發(fā)現(xiàn)兩個自發(fā)腫瘤灶，一個處于頸部，另一個位于子宮。免疫組化研究顯示它們 分別屬于唾液腺腺泡瘤(圖5c)以及子宮纖維瘤。2號老鼠，發(fā)現(xiàn)有一處肝臟腫瘤和2處腹 部皮下腫瘤。免疫組化顯示它們分別是肝細胞性肝癌(圖5d)以及腹部脂肪瘤。3號及4 號老鼠分別被發(fā)現(xiàn)一處癌灶，分別是肝細胞肝癌灶及面部的唾液腺腺瘤灶。實施例8酒精毒性實驗促進肝臟腫瘤的易感性為了研究酒精毒性是否能夠促進ALCl轉(zhuǎn)基因老鼠的肝臟腫瘤易感性，野生型及 ALCl轉(zhuǎn)基因老鼠(小鼠共2組6只野生型小鼠(組1)，6只轉(zhuǎn)基因小鼠(組2))經(jīng)過12 周的酒精毒性飼養(yǎng)，我們通過肝臟病理學改變以及肝臟表面的光滑程度來比較兩組之間的 差別。ALCl轉(zhuǎn)基因組，在不同的兩只老鼠身上發(fā)現(xiàn)可見的肝臟脂肪瘤以及肝細胞性肝癌的 病灶(圖5e)。嚴重的發(fā)育不良損傷發(fā)現(xiàn)于另外的3只老鼠。圖5f顯示了其中一只的典型 發(fā)育不良損傷。野生型組，無可見的腫瘤及發(fā)育不良損傷。這些發(fā)現(xiàn)提示肝細胞中ALCl的 過度表達會促進老鼠腫瘤形成的易感性。
實施例9ALC1過表達促進轉(zhuǎn)基因老鼠的細胞周期遷移小鼠胚胎成纖維細胞株(MEF)分離于同一代的ALCl轉(zhuǎn)基因老鼠以及野生型老鼠 處于13. 5天的胚胎組織。兩種野生型的MEFs和兩種ALCl高表達的MEFs通過RT-PCR的方 法檢測ALCl表達水平(圖6a)。流式細胞儀分析DNA含量的實驗證實ALCl能夠增加MEF 細胞的DNA合成以及G1/S細胞周期遷移(圖6b)。實施例10ALC1促進泛素化的p53降解 通過酵母雙雜交系統(tǒng)，ALCl被發(fā)現(xiàn)可以和NTKL蛋白結(jié)合。而過去的研究通過酵 母雙雜交、免疫共沉淀、共定位研究等揭示NTKL和NTKLBP1也互相結(jié)合。此外，NTKLBP1被 發(fā)現(xiàn)與hPirh2蛋白結(jié)合，而hPirh2是p53泛素化降解的負調(diào)控基因15。為了揭示ALCl促 進G1/S遷移的機理，我們通過比較ALCl及空載體轉(zhuǎn)染的細胞p53的表達，結(jié)果顯示p53在 蛋白水平上的表達降低(圖6c)。因此，我們研究p53途徑上的其他指標，如P2ripl、cdk2、 細胞周期蛋白E。結(jié)果顯示在ALCl轉(zhuǎn)染的細胞中ρ2Γ ρ1被下調(diào)，而cdk2、細胞周期蛋白E 表達上調(diào)(圖6c)。參考文獻l.Marchio, A.，等，通過比較基因庫雜交檢測到肝細胞癌中的再發(fā)性染色體異常 (Recurrent chromosomal abnormalities in hepatocellular carcinoma detected by comparative genomic hybridization).基因染色體癌 18，59-65 (1997) ·2.KuSm0，N.，等，肝細胞癌中通過比較性基因組雜交檢測到的遺傳失常 其與臨床病理學特征的關(guān)系(Genetic aberrations detected by comparative genomic hybridization in hepatocellular carcinomas their relationship to clinicopathological features.)肝臟學 29，1858-1862 (1999).3. Wong, N.，等，用比較性基因組雜交分析評估肝細胞癌中的遺傳改變與疾病階 段、腫瘤大小和硬化之間的關(guān)系(Assessment of genetic changes in hepatocellular carcinoma by comparative genomic hybridization analysis !relationship to disease stage，tumor size, and cirrhosis).美國病理學雜志 154，37-43 (1999) ·4.Gimn，Χ. Y.，等，通過比較基因組雜交檢測到的肝細胞癌中的再發(fā)性染色體改 變(Recurrent chromosome alterations in hepatocellular carcinoma detected by comparative genomic hybridization).基因染色體癌 29，110—116 (2000).5. Qin, L. X.，等，人肝細胞癌中染色體8p缺失與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系(The association of chromosome 8p deletion and tumor metastasis in human hepatocellular carcinoma).癌癥研究雜志 59，5662-5665 (1999).6. Simon, R.，等，乳突狀淺表膀胱癌中與侵襲有關(guān)的染色體失常(Chromosomal aberrations associated with invasion in papillary superficial bladder cancer.) 病理學雜志 185,345-351(1998).7.Tirkkonen，Μ.，等，通過CGH的原發(fā)性乳腺癌分子細胞遺傳學(Molecular cytogenetics of primary breast cancer by CGH) ·基因染色體癌 21，177—184 (1998).8. Fang, Y.，等，通過比較基因組雜交分析原發(fā)性鼻咽癌中的遺傳改變(Analysis of genetic alterations in primary nasopharyngeal carcinoma by comparative genomic hybridization.)基因染色體癌 30，254-260 (2001) ·
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權(quán)利要求
ALCl基因的抑制劑的用途，其特征在于，用于制備治療或預防癌癥的藥物。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述癌癥是肝癌。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述肝癌是肝細胞肝癌。
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述ALCl基因的抑制劑是干擾RNA、反義核酸。
5.ALCl基因的反義核酸探針的用途，其特征在于，用于制備診斷癌癥的試劑盒。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述癌癥是肝癌。
7.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述肝癌是肝細胞肝癌。
全文摘要
公開了ALCl基因抑制劑在制備治療和預防癌癥的藥物中的用途，以及該基因的反義核酸探針在用于制備診斷癌癥的試劑盒中的用途。
文檔編號A61K48/00GK101837131SQ20091004796
公開日2010年9月22日 申請日期2009年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月20日
發(fā)明者關(guān)新元, 李焱, 胡亮, 馬寧芳 申請人:中山大學腫瘤防治中心