專利名稱：分析dna修復(fù)的方法和測(cè)定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分析通過DNA修復(fù)酶修復(fù)DNA修飾和堿基錯(cuò)配以及無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的方法和測(cè)定試劑盒。因此，例如可以測(cè)定修復(fù)酶的修復(fù)能力，并由此測(cè)定從中回收用于本方法并含有修復(fù)酶的組合物的細(xì)胞或組織的修復(fù)能力。該修復(fù)能力例如與導(dǎo)致癌癥發(fā)展的過程有關(guān)，但是在各種形式的癌癥療法中也是重要的。
A．前言由于在細(xì)胞中與癌癥相關(guān)的基因(原癌基因和抑癌基因)的突變逐漸積累，因此癌癥發(fā)展分幾個(gè)階段。就突變的形成而言，例如存在于環(huán)境、食品、化妝品、藥品和車間中的致癌因子(紫外線、電離輻射、粉塵、重金屬和許多化學(xué)致癌物)起著很大作用，但是也可以內(nèi)源地形成(例如，亞硝胺、反應(yīng)性氮和氧化合物)。
盡管它們的物理和化學(xué)性質(zhì)不同，但是所有致癌物的作用原理相同。它們與DNA的單個(gè)組分反應(yīng)，并因此改變其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。
然而，在沒有致癌物的影響下也可以發(fā)生DNA組分的改變。通過熱水解DNA中的化學(xué)鍵可以獲得這些結(jié)構(gòu)變化。它們首先包括在堿基--胞嘧啶、腺嘌呤或鳥嘌呤中的氨基被羥基替換(脫氨基)，和(特別是)DNA的嘌呤堿基--鳥嘌呤和腺嘌呤與脫氧核糖部分之間的N-糖苷鍵的水解裂解(脫嘌呤)。
在DNA復(fù)制過程中，當(dāng)太少或太多的核苷酸和/或錯(cuò)誤核苷酸加入新合成的DNA鏈時(shí)可能發(fā)生堿基錯(cuò)配。后者發(fā)生時(shí)四個(gè)DNA堿基以其罕見的互變異構(gòu)形式存在。例如，胞嘧啶為罕見的互變異構(gòu)形式時(shí)，它與腺嘌呤形成堿基對(duì)，而不與鳥嘌呤形成堿基對(duì)，鳥嘌呤為罕見的互變異構(gòu)形式時(shí)，它與胸腺嘧啶形成堿基對(duì)，而不與胞嘧啶形成堿基對(duì)，等等。如果這些或其它可能的堿基錯(cuò)配不及時(shí)修復(fù)的話，在另一輪復(fù)制之后，在基因組DNA中獲得轉(zhuǎn)換突變(例如C-G變?yōu)門-A，或者T-A變?yōu)镃-G)。然后這些轉(zhuǎn)換突變總是傳遞給子細(xì)胞。結(jié)構(gòu)修飾可以產(chǎn)生各種可能的突變(轉(zhuǎn)換、顛換、缺失、插入等)。在基因組中獲得的突變類型和分布型經(jīng)常具有致癌物的特征，它引起獲得的結(jié)構(gòu)修飾。在與癌癥相關(guān)的基因(原癌基因、抑癌基因)中連續(xù)積累突變將最終導(dǎo)致細(xì)胞的惡性表型的表達(dá)。
然而，破壞DNA的試劑的影響可以直接導(dǎo)致相關(guān)細(xì)胞死亡。這在例如通過放射療法或基因毒性化學(xué)治療劑治療腫瘤疾病中非常重要。
為了保護(hù)細(xì)胞，細(xì)胞具有許多有效的防御機(jī)制。這些機(jī)制一方面包括酶(例如谷胱甘肽合成酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶)和低分子量物質(zhì)(例如半胱氨酸、谷胱甘肽、黃素和維生素C、E)，另一方面包括特異性修復(fù)系統(tǒng)，該系統(tǒng)識(shí)別DNA修飾并從DNA中酶促除去這些修飾。然而，防御機(jī)制的有效性在不同個(gè)體之間以及相同個(gè)體內(nèi)的不同細(xì)胞類型之間差異很大。它們的效率決定了個(gè)體對(duì)致癌因子的腫瘤敏感性。本發(fā)明特別涉及測(cè)定修復(fù)系統(tǒng)的活性(即修復(fù)能力)以及這些活性測(cè)定的應(yīng)用。
B．現(xiàn)有技術(shù)為了測(cè)定人細(xì)胞或組織對(duì)各種致癌-DNA修飾的修復(fù)能力，有許多方法可以使用?，F(xiàn)將最常用的方法列于下。原則上，它們可以分成兩種不同類型的方法。
Ⅰ．一種方法基于在體內(nèi)用某種致癌物處理來(lái)自體內(nèi)的細(xì)胞。然后測(cè)定產(chǎn)生致癌物的DNA修飾從細(xì)胞的DNA中酶促除去的速率。為此，在致癌物處理剩余量的相應(yīng)DNA修飾之后的不同時(shí)間分析細(xì)胞的DNA。由此獲得的數(shù)據(jù)用于計(jì)算細(xì)胞的修復(fù)能力。
Ⅰ.Ⅰ．為了測(cè)定所限定的DNA修飾的量，將該DNA從相應(yīng)細(xì)胞樣品中分離并分析DNA修飾的含量。可以對(duì)這些DNA修飾在個(gè)體DNA樣品中的量進(jìn)行定量a)在根據(jù)免疫-狹線印跡法使用所限定的DNA修飾的抗體的完整DNA分子中(Nehls等人，1984b)。
b)個(gè)體脫氧核糖核苷酸中的DNA酶促水解·通過使用所限定的DNA修飾的抗體的競(jìng)爭(zhēng)性放射免疫測(cè)定法(Nehls等人，1984a)，·通過用HPLC設(shè)備分離脫氧核糖核苷酸混合物的電化學(xué)檢測(cè)器系統(tǒng)(Floyd等人，1986)，·通過氣相色譜法分離脫氧核糖核苷酸混合物的質(zhì)譜法(Dizdaroglu等人，1985)。
Ⅰ.Ⅱ．另一方面，已開發(fā)出可以直接在個(gè)體細(xì)胞中測(cè)定DNA修飾的方法。這些方法包括a)免疫細(xì)胞學(xué)測(cè)定法(Nehls等人，1997)，和b)Comet測(cè)定法(Ostling和Johnson,1984)。
Ⅱ．另一種類型的方法在于用含有所限定的DNA修飾(合成DNA分子)或者已用某些致癌物處理過的DNA分子培養(yǎng)細(xì)胞和組織的蛋白提取物。然后測(cè)定從所述DNA分子中除去相應(yīng)DNA修飾的速率。這可以用以下方法實(shí)現(xiàn)Ⅱ.Ⅰ．用“DNA切口測(cè)定法(Castaing等人，1993)。
該方法用于證實(shí)通過酶切除從DNA中剔除DNA修飾。通過最特異性作用的核酸內(nèi)切酶以一步或者通過識(shí)別和剔除某些修飾堿基的DNA糖基化酶以及從DNA中切除剩余無(wú)嘌呤和/或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的AP核酸內(nèi)切酶以兩步切除DNA修飾。在這兩種情況下，在DNA修飾的位點(diǎn)存在DNA切口，這些切口導(dǎo)致最初的DNA分子縮短。在該測(cè)定中，主要使用了一定長(zhǎng)度的合成、放射性標(biāo)記的DNA分子，該DNA分子在預(yù)定位置含有所限定的DNA修飾。通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離不同長(zhǎng)度的DNA分子進(jìn)行仍然完整的DNA分子和縮短的DNA分子的定量測(cè)定。
Ⅱ.Ⅱ．用濾膜結(jié)合試驗(yàn)(Nehls和Rajewsky,1990)。
該方法基于觀測(cè)DNA-抗體復(fù)合體可以固定在硝基纖維素濾膜上，而無(wú)蛋白質(zhì)的DNA不能保留。該方法的原理在于測(cè)定仍然能夠結(jié)合抗體的DNA分子的量。為此，將每個(gè)DNA分子(理想地)含有一個(gè)DNA修飾的DNA用蛋白提取物培養(yǎng)，在不同反應(yīng)時(shí)間之后與特異性結(jié)合抗體混合，并通過硝基纖維素濾膜過濾。由濾膜結(jié)合的DNA-抗體復(fù)合體的量減少的速率，可以測(cè)定細(xì)胞類型或組織對(duì)可以獲得抗體的所限定的DNA修飾的修復(fù)能力。
Ⅱ.Ⅲ．通過切除修復(fù)剔除大多數(shù)DNA修飾。一個(gè)例外是通過烷基化致癌物(例如，O6-烷基鳥嘌呤、O4-甲基胸腺嘧啶)產(chǎn)生的某些DNA修飾。這些烷基化產(chǎn)物可以通過使烷基從DNA堿基傳送至本身然后失活的酶(O6-烷基鳥嘌呤-DNA-烷基轉(zhuǎn)移酶；AT)修復(fù)。在細(xì)胞和組織中定量測(cè)定該修復(fù)酶的重要方法列于下。
a)濾膜結(jié)合試驗(yàn)(參見Ⅱ.Ⅱ.)。
b)常用試驗(yàn)的原理在于在加入細(xì)胞和組織提取物之前和之后的不同時(shí)間測(cè)定用[3H]-標(biāo)記的烷基化劑處理的DNA中放射性標(biāo)記的O6-烷基鳥嘌呤的量。烷基化DNA經(jīng)酸水解之后，通過色譜法(HPLC,SephadexG-10)將釋放的嘌呤分離，測(cè)定含有O6-烷基鳥嘌呤的級(jí)分中的放射性(Foote等人，1983)。
c)另一常用方法基于這樣的認(rèn)識(shí)烷基共價(jià)地轉(zhuǎn)移到AT的胞嘧啶殘基上。[3H]-烷基-DNA用蛋白提取物培養(yǎng)之后，通過測(cè)定提取物中蛋白組分的放射性來(lái)測(cè)定轉(zhuǎn)移到AT上的烷基量。或者，測(cè)定保留在DNA中的放射性的量，并通過水解蛋白質(zhì)測(cè)定形成的[3H]-烷基胞嘧啶分子的量(Pegg等人，1983；Waldstein等人，1982)。
Ⅲ．從WO 96/28571中得知一種測(cè)定DNA損傷的方法，其中通過將DNA吸附到聚陽(yáng)離子上將其固定在支持體上。在該方法中，使包含具有修復(fù)活性和標(biāo)記核苷酸的細(xì)胞提取物的組合物作用于具有損傷的吸附DNA上。然后證明修復(fù)時(shí)加入的標(biāo)記核苷酸。
Ⅳ．從現(xiàn)有技術(shù)中已知有共價(jià)偶聯(lián)生物分子于固體支持體上的方法，但是與分析DNA損傷的修復(fù)無(wú)關(guān)。
例如，從DE-A-4341524中已知一種使用方形酸衍生物將生物分子和親和配體固定于聚合支持體上的方法。DE-C-4499550描述了使用方形酸衍生物的偶聯(lián)反應(yīng)，并提到了使生物分子共價(jià)連接到基質(zhì)上的可能性。從DE-A-19624990中已知一種化學(xué)地控制修飾表面以及載有?；?或羥基的聚合物的方法。
特別是從現(xiàn)有技術(shù)中已知的測(cè)定修復(fù)能力的上述方法實(shí)施起來(lái)耗時(shí)、耗費(fèi)人力且成本高。在一些方法中還存在加工過程中樣品材料損失的問題。
本發(fā)明的目的是提供一種分析通過DNA修復(fù)酶修復(fù)DNA修飾、堿基錯(cuò)配以及無(wú)嘌呤和無(wú)嘧啶位點(diǎn)的方法。特別地，本方法實(shí)施時(shí)應(yīng)簡(jiǎn)單、效率高且不昂貴，并避免上述缺陷。
根據(jù)本發(fā)明，由于提供了一種包括以下步驟的修復(fù)DNA修飾和堿基錯(cuò)配以及無(wú)嘌呤和無(wú)嘧啶位點(diǎn)的分析方法，因此本目的得以實(shí)現(xiàn)(a)提供單鏈或雙鏈DNA分子，該DNA分子通過與反應(yīng)性方形酸衍生物反應(yīng)經(jīng)在該DNA的5’-端或3’-端或至少一個(gè)脫氧核糖殘基的2’-位置加入該DNA分子的伯或仲氨基共價(jià)偶聯(lián)到載有伯或仲氨基的固相基質(zhì)上，并具有修飾和/或堿基錯(cuò)配和/或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)；(b)使該DNA分子與含有DNA修復(fù)酶的組合物接觸；(c)測(cè)定DNA修飾和/或堿基錯(cuò)配和/或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的剔除。
本發(fā)明還提供了包含實(shí)施本發(fā)明方法所需組分的測(cè)定試劑盒。
從以下的說(shuō)明、實(shí)施方案以及所附的權(quán)利要求書可以得知本發(fā)明的優(yōu)選方面。
C．發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的原理在于使修復(fù)酶作用于DNA分子，該DNA分子共價(jià)地與固體支持體結(jié)合，并具有修飾和/或堿基錯(cuò)配和/或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)(損傷)，并觀測(cè)該修飾和/或堿基錯(cuò)配和/或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的剔除。通過反應(yīng)性方形酸衍生物進(jìn)行DNA分子與支持體的共價(jià)連接。定性或定量測(cè)定該修飾和/或堿基錯(cuò)配和/或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的剔除的便利方法是使用該修飾和/或堿基錯(cuò)配和/或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的特異性抗體或抗體片段(或者在無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的情況下也使用這些位點(diǎn)衍生物的特異性抗體或抗體片段)。測(cè)定這些特異性抗體的結(jié)合含量。當(dāng)通過切除進(jìn)行修復(fù)時(shí)，還可以通過觀測(cè)適當(dāng)加入的標(biāo)記的失去進(jìn)行定性或定量檢測(cè)；由此已將該標(biāo)記(或標(biāo)記結(jié)合區(qū))加入經(jīng)切除不再與載體相連的DNA片段中。可以測(cè)定釋放的標(biāo)記量和/或保持連接的標(biāo)記量。
通過本發(fā)明的方法，例如可以分析含有修復(fù)酶的組合物對(duì)預(yù)定DNA修飾或或堿基錯(cuò)配或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的修復(fù)能力。然而，另一方面，使用所限定的修復(fù)酶可以檢測(cè)DNA修飾或堿基錯(cuò)配或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)。而且，通過分析因試劑的影響(例如通過特異性作用的修復(fù)蛋白)引起的修飾以及其修復(fù)可以檢驗(yàn)試劑對(duì)DNA的影響。因此可以對(duì)試劑的DNA損傷潛能進(jìn)行陳述。最后，還可以分析反應(yīng)條件，特別是反應(yīng)物對(duì)修復(fù)過程的影響。
修復(fù)能力一般指明剔除DNA修飾或堿基錯(cuò)配或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)期間的活性。特別地，修復(fù)能力在本文中應(yīng)理解為對(duì)DNA修飾或堿基錯(cuò)配或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)在樣品中含量的減少的度量。在實(shí)施例中解釋了定量分析，并且這里顯示的數(shù)學(xué)關(guān)系通?？捎糜诟黝惙治龇椒?。
D．優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明除了別的以外，本發(fā)明還涉及一種可以快速且精確地測(cè)定細(xì)胞或組織酶促修復(fù)所限定的DNA結(jié)構(gòu)的修飾(也稱之為DNA修飾、DNA損傷或DNA加合物)和DNA錯(cuò)配的能力的方法。而且，當(dāng)使用所限定的DNA修復(fù)酶時(shí)，可以分析DNA結(jié)構(gòu)修飾和堿基錯(cuò)配的性質(zhì)。因此，本發(fā)明還提供了一種通過含有DNA修復(fù)酶的組合物(特別是溶液)測(cè)定DNA結(jié)構(gòu)修飾、堿基錯(cuò)配和無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的修復(fù)能力的方法，該方法還可用于檢測(cè)DNA結(jié)構(gòu)的修飾、堿基錯(cuò)配和無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)本身，包括下列步驟(a)單鏈或雙鏈DNA分子或DNA類似物，它們經(jīng)過修飾以便在DNA分子內(nèi)部在DNA5’-端或3’-端或在至少一個(gè)脫氧核糖殘基的2’-位置上載有伯或仲氨基，并且它們可以具有DNA結(jié)構(gòu)修飾和/或堿基錯(cuò)配和/或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)，經(jīng)過載有伯或仲氨基的固相基質(zhì)與方形酸酯反應(yīng)而共價(jià)偶聯(lián)到該基質(zhì)上；(b)使與固相基質(zhì)結(jié)合的該DNA分子與含有修復(fù)酶的溶液接觸；(c)借助溶液中存在的修復(fù)酶定性和/或定量測(cè)定可能的結(jié)構(gòu)修飾和/或堿基錯(cuò)配和/或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的修復(fù)。
在測(cè)定結(jié)構(gòu)修飾和/或堿基錯(cuò)配和/或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)時(shí)，使用能夠修復(fù)特異性結(jié)構(gòu)修飾和/或堿基錯(cuò)配和/或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的所限定的修復(fù)酶。
在相同個(gè)體內(nèi)的不同細(xì)胞類型中以及不同個(gè)體中的修復(fù)能力會(huì)有很大的變化。
因此，下面參數(shù)是很重要的·個(gè)體腫瘤易感性，·腫瘤患者對(duì)放射療法或基因毒性化學(xué)療法的敏感性，·腫瘤細(xì)胞對(duì)放射療法或基因毒性化學(xué)療法的耐性。
個(gè)體腫瘤易感性與個(gè)體細(xì)胞修復(fù)DNA修飾和/或堿基錯(cuò)配和/或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的能力有關(guān)。通過本發(fā)明方法，使從細(xì)胞或組織樣品中適當(dāng)獲得的組合物作用于具有修飾或堿基錯(cuò)配和/或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的DNA，并證明其剔除，可以測(cè)定個(gè)體的修復(fù)狀態(tài)及因此的腫瘤易感性。當(dāng)已知某種致癌物引起某類修飾和/或堿基錯(cuò)配和/或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)時(shí)，可以在這方面測(cè)定修復(fù)狀態(tài)，并由此可以建立該致癌物的腫瘤易感性。
就例如癌癥的放射療法而言，測(cè)定個(gè)體的放射敏感性非常重要，由于對(duì)腫瘤附近的健康的放射敏感性組織的損傷，甚至造成約2％的永久性損傷，因此約30％的該患者需要住院治療。另一方面，為了最佳地控制腫瘤，有時(shí)希望使用比常規(guī)高的放射劑量。為了測(cè)定本發(fā)明的放射敏感性，收集經(jīng)過放射療法的健康組織或適宜替代組織的樣品之后，為進(jìn)一步分析(懸浮液或提取物)通過收集制備組合物。接著，分析DNA損傷修復(fù)的動(dòng)力學(xué)。為此，使前述的組合物作用于在偶聯(lián)之前或之后已加入了一個(gè)或多個(gè)適宜的修飾和/或堿基錯(cuò)配和/或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的DNA分子。于是可以測(cè)定放射敏感性測(cè)定DNA修飾或堿基錯(cuò)配或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的量，特別是由活性氧類引起的修飾量，例如8-氧代鳥嘌呤的量隨著時(shí)間而減少并使其與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)相關(guān)。因此可以單獨(dú)地測(cè)定總的輻射劑量并測(cè)定在分級(jí)輻射情況下單一劑量隨時(shí)間的分布。根據(jù)一特定實(shí)施方案，為了獲得更精確測(cè)定的輻射劑量，還提供了將如上所述測(cè)定的數(shù)據(jù)(它代表了細(xì)胞對(duì)DNA損傷的修復(fù)能力)與描述細(xì)胞增殖的數(shù)據(jù)相結(jié)合。相應(yīng)地，為了估計(jì)治療所需的輻射劑量，可以測(cè)定腫瘤組織的輻射敏感性。
與測(cè)定腫瘤患者對(duì)輻射療法的敏感性類似，還可以測(cè)定基因毒性化學(xué)療法的敏感性。特別是測(cè)定對(duì)一個(gè)或多個(gè)適當(dāng)選擇的DNA修飾的修復(fù)能力。當(dāng)已知化學(xué)治療劑的作用模式時(shí)，可以在該機(jī)制的基礎(chǔ)上選擇DNA修飾。例如，就烷基化劑而言，可以分析相應(yīng)烷基化堿基的修復(fù)。相同的考慮適用于測(cè)定腫瘤細(xì)胞對(duì)某種試劑的耐性。
分析該修復(fù)的方法的基礎(chǔ)在于將經(jīng)過修飾的DNA分子或具有堿基錯(cuò)配或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的DNA分子共價(jià)連接到如濾膜、金、珠、微量滴定板或玻璃表面的固相上。適宜的支持體特別是晶片(DNA-晶片技術(shù))。將固定化的DNA用來(lái)自細(xì)胞或組織的蛋白提取物培養(yǎng)。測(cè)定通過提取物中所含的修復(fù)蛋白質(zhì)除去所限定的DNA加合物或堿基錯(cuò)配或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的速率。
作為偶聯(lián)劑，使用能夠與氨基反應(yīng)的反應(yīng)性方形酸衍生物。優(yōu)選使用方形酸二酯，特別是方形酸二烷基酯，例如特別是方形酸二乙酯，它可以分別使兩個(gè)伯或仲氨基彼此連接。出人意料地，本發(fā)明中所用的方形酸衍生物僅與脂族氨基反應(yīng)，而不與DNA堿基上的氮原子反應(yīng)。這是優(yōu)于其它偶聯(lián)劑的無(wú)法估計(jì)的優(yōu)點(diǎn)，其它偶聯(lián)劑與DNA的反應(yīng)基反應(yīng)并因此能導(dǎo)致不希望的損傷(例如二醛)。通過在DNA分子內(nèi)部的5’-端或3’-端或至少一個(gè)脫氧核糖殘基的2’-位置上引入伯或仲氨基，由此發(fā)現(xiàn)了一種將單和雙鏈低聚核苷酸區(qū)域?qū)Ｒ恍怨潭ɑ皆诒砻孑d有氨基的固相上的溫和、再現(xiàn)性高且便宜的方法。應(yīng)優(yōu)選將所述氨基引入5’-端。特別優(yōu)選加入伯氨基(NH2基)。在為雙鏈DNA分子的情況下，優(yōu)選一個(gè)鏈與支持體共價(jià)地連接，例如通過其5’-端。
作為固相基質(zhì)，可以使用本身已知的材料，例如由纖維素、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚酰胺、玻璃或金表面組成的那些。固相基質(zhì)可以本身已知的形式存在，例如以濾膜、微量滴定板、膜、柱、珠，例如磁性珠的形式存在。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)DNA分子包括具有任意天然或合成序列的單鏈和雙鏈分子。如果用于與修復(fù)酶相互作用的堿基數(shù)足夠的話，可以選擇DNA分子中的任意堿基數(shù)。在一些情況下，具有幾個(gè)堿基的低聚核苷酸就已足夠了。對(duì)一些修復(fù)酶而言，證明宜于使用具有三個(gè)完整纏繞且修飾或錯(cuò)配或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)排布于中間纏繞中的低聚核苷酸。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)可以改變序列的長(zhǎng)度和待修復(fù)的位點(diǎn)的排列。本領(lǐng)域技術(shù)人員同樣可以分析序列中的變化。證明使用不允許重折疊的序列是有益的。通過改變序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以分析環(huán)境對(duì)待修復(fù)的位點(diǎn)的修復(fù)的影響。
已提到過，為了偶聯(lián)到支持體上，已將氨基加入DNA分子中。此外，已加入可以被修復(fù)的修飾或堿基錯(cuò)配或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)。而且，術(shù)語(yǔ)DNA分子還包括DNA類似物。
作為DNA類似物，例如可以使用在磷酸酯-糖主鏈上經(jīng)過修飾的DNA分子。例子包括磷酸酯基團(tuán)已被磷酸硫酯(硫代磷酸酯)替代或者磷酸二酯鍵已被肽鍵替代的分子。DNA類似的分子應(yīng)被認(rèn)為其中一部分或全部脫氧核糖核苷酸已被核糖核苷酸替代。
根據(jù)本發(fā)明，使DNA修復(fù)酶與含有據(jù)認(rèn)為能通過這些酶修復(fù)的DNA修飾或堿基錯(cuò)配或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的DNA分子接觸。通過致癌因子(包括輻射)可以直接或間接引起DNA的所述改變。該DNA修飾尤其包括堿基修飾。典型地，這些為與反應(yīng)劑如致癌物的加合物。然而，本文中理解的DNA修飾不受某類DNA改變的限制。根據(jù)本發(fā)明，還尤其可以特異地分析合成DNA分子，特別是具有精確定義的修飾或堿基錯(cuò)配的低聚核苷酸。此外，通過作用于DNA的試劑也可以產(chǎn)生修飾。
DNA分子與固相的共價(jià)連接使得實(shí)驗(yàn)的所有實(shí)際步驟能快速且有效地在一個(gè)反應(yīng)容器中進(jìn)行。步驟，例如酶、核酸、抗體或生色底物的加入或除去、緩沖液的更換和洗滌操作等等，僅需要大量可自動(dòng)化的吸移操作，即沒有費(fèi)時(shí)和費(fèi)工的操作步驟，例如DNA的沉淀和反復(fù)離心以及DNA分子與其它組分的層析或電泳分離。此外，因?qū)悠凡牧系拇笈庸ぴ斐傻腄NA損失可以避免。
本發(fā)明的另一優(yōu)點(diǎn)在于固定的DNA分子在分子的精確定義點(diǎn)上共價(jià)連接到支持體上，而不是自由地存在于溶液中。因此DNA修飾、堿基錯(cuò)配和無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)可自由地利用修復(fù)酶。
由于使用不同的標(biāo)記底物，因此可以在相同反應(yīng)容器中第一次分析來(lái)自細(xì)胞或組織的蛋白提取物對(duì)不同DNA修飾和/或DNA錯(cuò)配和/或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的修復(fù)能力。這可以通過將經(jīng)過不同修飾的低聚核苷酸結(jié)合到反應(yīng)容器(或其它支持體)的表面上進(jìn)行，具有相同修飾的低聚核苷酸典型地各自包括相同標(biāo)記或用于標(biāo)記的相同結(jié)合基團(tuán)。
通過本方法，可以快速且精確地確定人的修復(fù)狀態(tài)，由此可以可靠地評(píng)價(jià)該人對(duì)環(huán)境或車間中的致癌因子的易感性。本方法還可用于快速評(píng)價(jià)腫瘤患者(例如，骨髓中血液形成系統(tǒng)的細(xì)胞、腸細(xì)胞和粘膜細(xì)胞)對(duì)放射療法或基因毒性細(xì)胞抑制劑的敏感性。最后，本方法能夠快速且精確地測(cè)定腫瘤細(xì)胞的修復(fù)能力，它在抵抗DNA-反應(yīng)性細(xì)胞抑制劑中起著重要作用。
本文所述的偶聯(lián)方法基本上適宜溫和且區(qū)域?qū)Ｒ恍缘貙⒌途酆塑账峁潭ɑ焦滔嗌稀?br> 本文所述方法的優(yōu)選實(shí)施方案包括·將經(jīng)選擇修飾的核酸固定化到固相上，和·使用方形酸二乙酯將經(jīng)過修飾的核酸分子共價(jià)結(jié)合到固相(例如濾膜、微量滴定板、膜、玻璃表面、金、珠和磁性珠)上。
作為共價(jià)地結(jié)合經(jīng)過修飾的核酸分子的偶聯(lián)劑，優(yōu)選推薦方形酸二酯。
出人意料地，活性方形酸衍生物，例如尤其是方形酸二酯，不與DNA中嘌呤和嘧啶堿基上的氨基反應(yīng)。然而，它們選擇性地與伯和仲脂族氨基反應(yīng)。與其它偶聯(lián)劑比較，其決定性優(yōu)點(diǎn)是通過該偶聯(lián)物質(zhì)不會(huì)引起DNA分子的不需要的損傷或交聯(lián)。
通過加入氨基，例如在5’-端，DNA分子可以區(qū)域?qū)Ｒ恍缘嘏c在其表面上同樣存在氨基的固相相連。
E．通過合成引入某種致癌物特異性堿基修飾生產(chǎn)具有定義的DNA加合物的DNA基質(zhì)以及生產(chǎn)具有某些堿基錯(cuò)配或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的DNA分子。
在本發(fā)明方法中，可以有利地使用具有固定的序列和定義的修飾或堿基錯(cuò)配或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的DNA分子。下面，通過實(shí)施例解釋各種方法，但是，它們并不打算限制本發(fā)明。所需合成技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員為已知并且可以從文獻(xiàn)中得到。
Ⅰ．通過常用方法合成所限定序列的單鏈低聚核苷酸，它a)在堿基序列的預(yù)定點(diǎn)具有某一堿基修飾(例如8-氧代鳥嘌呤、O6-烷基鳥嘌呤)，b)在DNA分子的5’-端含有NH2基團(tuán)，c)在3’-端含有OH基團(tuán)。
Ⅰ.Ⅰ．標(biāo)記DNA分子的3’-端使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)通過加入例如熒光標(biāo)記的三磷酸酯酶促延長(zhǎng)3’-端。當(dāng)不同修飾的低聚核苷酸與相同支持體結(jié)合時(shí)(同時(shí)分析蛋白提取物對(duì)不同DNA修飾的修復(fù)能力)，使用各種熒光染料，具有相同修飾的低聚核苷酸各自含有相同的熒光染料?；蛘?，可以加入另一標(biāo)記或者可以結(jié)合標(biāo)記的基團(tuán)。而且，可以容易地看出，該標(biāo)記不必須存在于3’-端，而只存在于經(jīng)切除而不再與支持體相連的位置。
Ⅰ.Ⅱ．雙鏈(ds-)低聚核苷酸的生產(chǎn)a)將經(jīng)過修飾的低聚核苷酸與互補(bǔ)低聚核苷酸融合。(優(yōu)選地，載有修飾的鏈因此與載體共價(jià)地連接。)b)為了通過蛋白提取物分析DNA錯(cuò)配的修復(fù)(錯(cuò)配修復(fù))，將未經(jīng)修飾或經(jīng)過修飾的低聚核苷酸與在堿基序列的某一位置或在DNA加合物位置的對(duì)面含有不同的天然核苷酸的互補(bǔ)低聚核苷酸融合。
Ⅰ.Ⅲ．通過化學(xué)上穩(wěn)定且可裂解的接頭在ds-低聚核苷酸的5’-端將其偶聯(lián)到固相上。一般說(shuō)來(lái)，在本發(fā)明中可以提供與固體支持體的表面相連且在遠(yuǎn)離表面的末端載有氨基的接頭(間隔區(qū))，經(jīng)由該氨基通過方形酸衍生物可以偶聯(lián)到DNA分子上。接頭同樣可以與該DNA分子相連，該接頭又轉(zhuǎn)過來(lái)載有便于方形酸偶聯(lián)的氨基。在該接頭內(nèi)部，可以提供可裂解的基團(tuán)，它通過用于進(jìn)一步分析的適宜試劑使DNA分子與固相基質(zhì)分離。
Ⅰ.Ⅳ．當(dāng)僅使用均勻修飾的ds-低聚核苷酸時(shí)，DNA分子例如可以經(jīng)過其5’NH2端首先與固相結(jié)合，接著使用以下物質(zhì)在3’-端進(jìn)行酶促標(biāo)記
a)經(jīng)過修飾的脫氧核苷酸(例如，生物素化dUTP)，例如熒光染料的可檢測(cè)的標(biāo)記與其高親和地結(jié)合(例如與鏈霉抗生物素偶聯(lián)的TRITC)，或者b)與熒光染料偶聯(lián)(或經(jīng)放射性標(biāo)記或以一些其它方式標(biāo)記)的脫氧核苷酸。
Ⅱ．通過用致癌因子(反應(yīng)性化學(xué)物質(zhì)如苯并芘二醇環(huán)氧化物、甲基或乙基亞硝基脲、紫外線、電離輻射、過氧化氫、亞甲藍(lán)與可見光結(jié)合)處理ds-低聚核苷酸或線性質(zhì)粒DNA生產(chǎn)具有特異性DNA修飾的DNA基質(zhì)。
Ⅱ.Ⅰ．如標(biāo)題Ⅰ中所述生產(chǎn)在分子的5’-端具有NH2基并在3’-端具有OH基的ds-低聚核苷酸。用致癌物處理這些分子。經(jīng)由該NH2基將這些分子結(jié)合到固相上(參見Ⅰ.Ⅳ.)并酶促標(biāo)記這些結(jié)合分子，例如用熒光染料。
Ⅱ.Ⅱ．或者，可以首先將這些ds-低聚核苷酸結(jié)合到固相上。之后僅進(jìn)行用反應(yīng)性致癌物處理并酶促標(biāo)記這些低聚核苷酸。
Ⅱ.Ⅲ．在質(zhì)粒DNA的5’-端加入NH2基a)通過使用引物的PCR法，其中一種引物在其5’-端載有NH2基。
b)通過限制性核酸內(nèi)切酶切割這些質(zhì)粒，以便獲得兩個(gè)新的較短的DNA分子，每個(gè)在兩個(gè)5’-端/DNA分子之一上只有一個(gè)NH2基。在質(zhì)粒分子的3’-端酶促加入例如生物素化dUTP。用致癌物處理之后，將DNA基質(zhì)結(jié)合到固相上。按照該實(shí)施方案，可以通過與生物素結(jié)合的鏈霉抗生物素染料共軛物進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)。
Ⅲ．生產(chǎn)具有無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的DNA分子例如可以合成加入了尿苷酸的DNA分子，該堿基僅酶促分離。還存在可除去修飾的堿基、留下無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的已知酶。
F．修復(fù)測(cè)定的實(shí)際實(shí)施當(dāng)進(jìn)行修復(fù)測(cè)定時(shí)，將假設(shè)含有修復(fù)酶的組合物與固定的DNA接觸。該組合物可以為細(xì)胞提取物或組織提取物。在這種情況下，本發(fā)明的方法能夠描述細(xì)胞或組織的修復(fù)活性。
可以兩種方式檢測(cè)通過酶促修復(fù)的某些DNA修飾或堿基錯(cuò)配或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的剔除Ⅰ．通過使用特異地結(jié)合到某些DNA修飾(例如8-氧代鳥嘌呤、O6-烷基鳥嘌呤、DNA的PAH-加合物、嘧啶二聚物等)上的單克隆或多克隆抗體。這些抗體在參考文獻(xiàn)中有記載。它們可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法生產(chǎn)。還可以使用具有適宜親和力的抗體片段。
·該方法基本上適宜檢測(cè)存在適宜抗體的每種DNA修飾。
·該步驟不需要標(biāo)記DNA分子。
·為了定量分析細(xì)胞提取物的修復(fù)能力，必需知道在反應(yīng)制劑中DNA加合物的數(shù)目；與單位DNA分子中的DNA加合物的數(shù)目無(wú)關(guān)。
為此，或者含有所限定的DNA修飾(所限定的DNA加合物)或者已用某種致癌物處理過的固定化DNA分子首先用待測(cè)定的細(xì)胞或組織提取物培養(yǎng)。接著，加入抗體，它特異地結(jié)合到該修飾上(一級(jí)抗體)；為了定量結(jié)合抗體的量，然后典型地加入二級(jí)抗體，該二級(jí)抗體或者用熒光染料(TRITC、FITC、熒光素等)標(biāo)記或者以例如放射性標(biāo)記的一些其它方式標(biāo)記，或者將一與適宜底物引起顏色反應(yīng)的酶(例如磷酸酶、過氧化氫酶)偶聯(lián)其上。在恒定條件下，抗體分子的結(jié)合與剩余DNA加合物的量成正比(Nehls和Rajewsky,1990)；即，染料的強(qiáng)度可以度量加合物的量。
類似地，使用適宜的抗體也可以分析堿基錯(cuò)配或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)。當(dāng)分析無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的修復(fù)時(shí)，還可以用適宜的化學(xué)試劑如甲氧胺、肼衍生物或取代的芳胺衍生這些位點(diǎn)，并使用這些衍生位點(diǎn)的抗體(或抗體片段)用于檢測(cè)目的。方便地，通過修復(fù)酶的作用進(jìn)行衍生。
Ⅱ．利用通過切除修復(fù)剔除DNA修飾和堿基錯(cuò)配時(shí)出現(xiàn)DNA切口的事實(shí)。
·本方法適宜檢測(cè)導(dǎo)致DNA切口的修復(fù)過程。按照該機(jī)理進(jìn)行大多數(shù)的已知修復(fù)過程。一個(gè)例外是通過AT修復(fù)例如O6-烷基鳥嘌呤(參見C.Ⅱ.Ⅲ.)。
·優(yōu)選將ds-低聚核苷酸用于本方法。
為了實(shí)施該方法，必須確信
a)僅一個(gè)DNA鏈(可能)含有定義的DNA加合物，b)該DNA已被固定化，和c)該DNA鏈已對(duì)DNA修飾進(jìn)行了標(biāo)記，以便一經(jīng)切除該標(biāo)記就不再與支持體相連。例如，當(dāng)該DNA鏈經(jīng)過其5’-端與支持體共價(jià)地連接時(shí)，可以在其3’-端提供一標(biāo)記。在這種情況下，對(duì)在修復(fù)期間已將DNA切開的點(diǎn)，該標(biāo)記通常應(yīng)被置于3’位?？赏ㄟ^切除除去的經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾的核苷酸也可以被標(biāo)記。在這種情況下，放射標(biāo)記特別有用。還可以加入一附加標(biāo)記，它在修復(fù)(切除)期間不帶來(lái)?yè)p失，并且通過它可以在方法的每一階段分析例如固定化DNA的量。為了分析DNA修飾、堿基錯(cuò)配或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的剔除，已如上所述，然而，這種可以附加提供的標(biāo)記不適用。
為了定量細(xì)胞提取物的修復(fù)效率，必需知道單位反應(yīng)制劑中DNA加合物的數(shù)目。
將固定化DNA分子用待分析的細(xì)胞或組織提取物培養(yǎng)。當(dāng)通過酶促切除除去DNA加合物時(shí)，共價(jià)結(jié)合的鏈分裂成兩個(gè)片段，其中帶有標(biāo)記的片段不再與固相共價(jià)地結(jié)合。通過在適宜的緩沖劑混合物中加熱這些DNA分子，將兩個(gè)DNA鏈之間的氫鍵溶解。因此未結(jié)合的片段與互補(bǔ)(未標(biāo)記的)反鏈分離并且可以通過例如吸掉它們?nèi)菀椎爻?。保留了DNA加合物的DNA分子仍然具有標(biāo)記，因此可以容易地定量。可以同樣的方式分析堿基錯(cuò)配以及無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)。
G．附圖簡(jiǎn)述附圖中，

圖1顯示了通過細(xì)胞提取物從ds-低聚核苷酸除去8-氧代鳥嘌呤的動(dòng)力學(xué)；圖2顯示了通過細(xì)胞提取物修復(fù)O6-乙基鳥嘌呤的動(dòng)力學(xué)。
H．應(yīng)用實(shí)施例經(jīng)過修飾的低聚脫氧核苷酸的制備制備三個(gè)不同的低聚脫氧核苷酸，每個(gè)由34個(gè)核苷酸組成，并在5’-端含有NH2基。除了第16位之外，這三個(gè)低聚核苷酸的堿基序列相同且讀取如下5’-GGC TTC ATC GTT ATT X ATG ACC TGG TGG ATA CCG-3’其中在16位的X可以是8-氧代鳥嘌呤或O6-乙基鳥嘌呤或鳥嘌呤。作為16位的堿基，因此第一個(gè)低聚核苷酸含有氧化產(chǎn)物8-氧代鳥嘌呤，第二個(gè)低聚核苷酸含有烷基化產(chǎn)物O6-乙基鳥嘌呤，第三個(gè)低聚核苷酸含有天然堿基鳥嘌呤。第三個(gè)低聚核苷酸用作對(duì)照。此外，合成其互補(bǔ)DNA反鏈，它僅由四個(gè)天然堿基組成，并在經(jīng)過修飾的低聚核苷酸的3’-端伸出2個(gè)堿基。在X的對(duì)面是C。這使得能夠在經(jīng)過修飾的低聚核苷酸或?qū)φ盏途酆塑账岬?’-端酶促加入生物素化dUTP或熒光標(biāo)記的核苷酸。
這些低聚核苷酸是用磷酰胺酸法全自動(dòng)地制備的。通常，經(jīng)固相上的3’-端(CPG)進(jìn)行合成。與支持體材料分離并裂解保護(hù)基(0.25M 2-巰基乙醇的濃縮氨，55℃,20小時(shí))之后，這些低聚核苷酸通過凝膠過濾從氨中釋放，之后通過制備性聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC提純。在另一提純步驟之后，將這些低聚核苷酸凍干并在-20℃下貯藏。
雙鏈(ds)底物的制備將溶于雙蒸水的低聚核苷酸(100pmolDNA分子/ml)與1.2倍量的互補(bǔ)DNA鏈(120pmol/ml)混合。這些樣品在水浴中于90℃下加熱5分鐘；在將水浴冷卻到室溫的幾小時(shí)過程中將這些單鏈分子融合獲得雙鏈(ds)低聚核苷酸。
活性微量滴定板的制備在這些測(cè)定中使用微量滴定板(MP)，板孔為平底并在其表面含有NH2基(10nmolNH2基/孔)。向MP的每個(gè)孔中吸移25微升在甲醇(＞99％)中的方形酸二乙酯(0.1mM)和三乙胺(0.01mM)的溶液。將這些MP覆蓋并在室溫下培養(yǎng)10分鐘。將溶液除去之后，將這些孔用甲醇沖洗并干燥。
ds-低聚核苷酸共價(jià)結(jié)合到活性MP上為了將ds-低聚核苷酸偶聯(lián)到活性MP孔的表面上，向每個(gè)孔中吸移pH為9.5的10微升于50mM硼酸鈉水溶液中的DNA溶液(50pmol8-氧代鳥嘌呤-ds-低聚核苷酸/ml,2.5pmolO6-乙基鳥嘌呤-ds-低聚核苷酸/ml)，將該MP覆蓋。在室溫下20分鐘之后，移走DNA溶液并用雙蒸水沖洗這些孔。
方形酸中剩余的反應(yīng)基用30微升乙醇胺水溶液(100mM,pH8.5)滅活。10分鐘之后，將MP孔用雙蒸水沖洗并干燥。
實(shí)施例A從ds-低聚核苷酸中除去8-氧代鳥嘌呤修復(fù)類型通過切除修復(fù)(酶促法)從DNA中除去大多數(shù)DNA修飾、復(fù)制后的堿基錯(cuò)配和無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)。按照相同機(jī)理修復(fù)DNA氧化產(chǎn)物8-氧代鳥嘌呤(8-OxoGua)。在人體內(nèi)存在至少兩個(gè)不同的從DNA中剔除該堿基修飾的修復(fù)系統(tǒng)。在小鼠中，僅檢測(cè)出這兩個(gè)修復(fù)系統(tǒng)中的一個(gè)。
不依賴該8-OxoGua-切除機(jī)制，在DNA中中間地形成具有核苷酸大小的間隙。
實(shí)際實(shí)施該測(cè)定在該測(cè)定中使用MP，在其平底孔中固定化在16位含有氧化產(chǎn)物8-OxoGua并在35和36位含有生物素化尿嘧啶的ds-低聚核苷酸(30×10-15moldsDNA-分子/孔)。
用細(xì)胞系P3-X63-Ag的小鼠骨髓瘤細(xì)胞制備待分析的細(xì)胞提取物。為此，將這些細(xì)胞在冰冷PBS中沖洗2次，再以5×107個(gè)細(xì)胞/ml的濃度懸浮于緩沖劑混合物A(50mM Tris-HCl、pH7.6、1mM EDTA、1mM DTT、100mM KCl、0.1％BSA)中。將這些細(xì)胞經(jīng)聲波破碎，并經(jīng)離心除去固體成分(100,000g,4℃,10分鐘)。將清澈的上清液分成幾份貯藏在-80℃下。
向MP的10個(gè)孔中吸移25μl含有緩沖劑混合物A和6×105個(gè)小鼠骨髓瘤細(xì)胞的蛋白提取物的溶液(樣品區(qū))。
向4個(gè)區(qū)域吸移25μl相同緩沖劑，但沒有蛋白提取物(對(duì)照區(qū))。將該MP在37℃下培養(yǎng)。
5、30、60、90和120分鐘之后，在每個(gè)點(diǎn)及時(shí)在兩個(gè)孔中各加入1μl蛋白酶K(1mg/μl)，使反應(yīng)停止。在120分鐘之后同樣向?qū)φ諈^(qū)的孔中加入1μl蛋白酶K。將這些MP加熱到90℃持續(xù)5分鐘，接著在冰水混合物中快速冷卻。將這些溶液從孔中移出，孔用30μl緩沖劑B(50mM Tris-HCl,pH7.6,1mM EDTA,0.1％BSA)沖洗液3次。
加入25μl含鏈霉抗生物素-Cy3共軛物(2.5μg/ml；從Sigma公司獲得)的緩沖劑B溶液之后，將該MP在37℃下培養(yǎng)45分鐘。移出溶液之后，用緩沖劑B將這些MP的孔沖洗3次，最后加入25μl相同緩沖劑。
通過包括熒光顯微鏡、CCD照相機(jī)和計(jì)算機(jī)輔助的分析程序的圖像分析儀定量測(cè)定各個(gè)孔中熒光染料的強(qiáng)度?；蛘撸褂渺`敏的UV-ELISA讀數(shù)設(shè)備測(cè)定熒光強(qiáng)度。
按照下式計(jì)算樣品R=M(1-P/K0)其中R為以fmol(1015mol)表示的修復(fù)的8-氧代鳥嘌呤分子的量，M為每個(gè)MP孔中8-氧代鳥嘌呤分子的總量，K0為對(duì)照區(qū)的孔中的熒光強(qiáng)度，和P為樣品區(qū)的孔中的熒光強(qiáng)度。
圖1表示通過所限定的細(xì)胞提取物(6×105個(gè)小鼠骨髓瘤細(xì)胞系的細(xì)胞的提取物)修復(fù)的8-氧代鳥嘌呤隨培養(yǎng)時(shí)間的變化曲線。由曲線開始的斜率可以計(jì)算在標(biāo)準(zhǔn)條件(8-氧代鳥嘌呤的總量，30fmol；6×105個(gè)細(xì)胞的提取物)下每小時(shí)從低聚核苷酸中最多除去多少8-氧代鳥嘌呤分子。在本例中，每小時(shí)除去13.7fmol。
實(shí)施例Bds-低聚核苷酸中O6-乙基鳥嘌呤的脫烷基化修復(fù)類型由O6-烷基鳥嘌呤-DNA-烷基轉(zhuǎn)移酶(AT)以一步修復(fù)通過烷基化致癌物形成的O6-乙基鳥嘌呤(O6-EtGua)。AT將烷基從鳥嘌呤的O6-位置轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)活性中心中的半胱氨酸上。轉(zhuǎn)移該烷基之后，AT失活。這樣，每個(gè)AT分子總是僅能修復(fù)一個(gè)O6-EtGua分子。因此，以雙分子反應(yīng)進(jìn)行修復(fù)。
通過O6-乙基脫氧鳥苷的抗體分析該修復(fù)。可以使用單克隆或多克隆抗體。例如，如下產(chǎn)生單克隆抗體首先，如R.Muller和M.F.Rajewsky(Z.Naturforsch.,33c,897-901,1978)所述進(jìn)行O6-乙基核糖鳥苷的合成和烷基化產(chǎn)物與KLH(匙孔血藍(lán)蛋白)的偶聯(lián)。為了產(chǎn)生抗體，在3個(gè)月內(nèi)5次將抗原BALB/c經(jīng)腹膜注射到小鼠中。將經(jīng)過免疫的小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(P3-X63-Ag8)融合。將由此獲得的雜交瘤散布在含有BALB/c小鼠的腹膜巨噬細(xì)胞的微量滴定板上。將產(chǎn)生O6-乙基脫氧鳥苷的抗體的雜交瘤細(xì)胞再克隆并培養(yǎng)。用兩步提純(硫酸銨沉淀，50％飽和液，以及用DE-52柱材料的離子交換層析)將這些抗體與其它蛋白質(zhì)分離。將提純的抗體濃縮并將它們分成幾份貯藏在-80℃下。
實(shí)際實(shí)施該測(cè)定在該測(cè)定中使用MP，其孔中固定化在16位含有O6-EtGua的ds-低聚核苷酸(1.2×10-15mol dsDNA分子/孔)。其3’-端未補(bǔ)平。在一部分孔中，固定化僅在16位含有鳥嘌呤的ds-低聚核苷酸(對(duì)照區(qū)2)。
通過在培養(yǎng)基(DMEM，補(bǔ)充有10％胎牛血清)中用胰蛋白酶EDTA處理一次并在冰冷PBS中處理2次，洗滌L929小鼠成纖維細(xì)胞制備待分析的細(xì)胞提取物。然后將這些細(xì)胞以6×107個(gè)細(xì)胞/ml的濃度再懸浮于萃取緩沖液(500mM NaCl、50mM Tris-HCl、pH7.8、1mM二硫蘇糖醇、1mM EDTA和5％甘油)中，并通過聲波破碎。通過離心(10,000g,4℃,10分鐘)除去不溶性成分，將清澈的上清液分成幾份貯藏在-80℃下。
向MP的14個(gè)孔中吸移50μl含有反應(yīng)緩沖劑(50mMHEPES,pH7.8,1mMDTT,1mM EDTA,5％甘油和0.05％Triton X-100)和3μg來(lái)自L929小鼠成纖維細(xì)胞的蛋白提取物的溶液(樣品區(qū))。
向4個(gè)孔中吸移25μl反應(yīng)緩沖劑，但沒有蛋白提取物(對(duì)照區(qū)1)。向含有用于測(cè)定抗體的非特異性結(jié)合的未經(jīng)修飾的ds-低聚核苷酸的對(duì)照區(qū)2的4個(gè)孔中吸移反應(yīng)緩沖劑和蛋白提取物。
5、10、15、20、30、45、60分鐘之后，在每個(gè)點(diǎn)及時(shí)在兩個(gè)孔中各加入1μl蛋白酶K(1mg/μl)，使反應(yīng)停止。在60分鐘之后同樣向?qū)φ諈^(qū)1和2的孔中加入1μl蛋白酶K。
在37℃下另外15分鐘之后，從孔中移出溶液，這些孔用30μl緩沖劑C(100mM NaCl,10mM Tris-HCl,pH7.5,1mM EDTA和0.1％BSA)沖洗3次。
然后，向每個(gè)孔中吸移15μl含有2μg抗-(O6-EtGua)抗體的緩沖劑C溶液。室溫下45分鐘之后，將這些抗體溶液移出。接著，用緩沖劑C將這些孔沖洗3次，以除去未結(jié)合的抗體分子。
為了檢測(cè)特異性結(jié)合的抗體分子，向這些孔中加入20μl在緩沖劑C中的TRITC標(biāo)記的抗-(IgG)F(ab)2片段(5μg/ml)。室溫下45分鐘之后，將該抗體溶液移出。用25μl緩沖劑C沖洗3次除去未結(jié)合的抗體。接著，向這些孔中吸移25μl緩沖劑C。如前述確定各個(gè)孔中的熒光強(qiáng)度。
按照下式計(jì)算各個(gè)樣品值R=M(1-(P-K2)/(K1-K2))其中R為以fmol(10-15mol)表示的修復(fù)的O6-EtGua分子的量，M為以fmol表示的每個(gè)孔中O6-EtGua分子的總量，K1為沒有蛋白提取物的孔中的總熒光強(qiáng)度，K2為抗體的非特異性結(jié)合的熒光強(qiáng)度，P為樣品區(qū)的孔中的熒光強(qiáng)度。
在圖2中，表示了通過所限定的細(xì)胞提取物(3μg來(lái)自L929小鼠成纖維細(xì)胞的蛋白提取物)修復(fù)的O6-EtGua作為時(shí)間的函數(shù)曲線。由于以雙分子反應(yīng)(二級(jí)反應(yīng))進(jìn)行O6-EtGua的修復(fù)，因此可以根據(jù)下式計(jì)算測(cè)定制品中AT分子(AT)的濃度和修復(fù)反應(yīng)的速率常數(shù)KK×t=1/(A0-B0)ln(B0(A0-P)/A0(B0-P))其中術(shù)語(yǔ)A0、B0和P相應(yīng)于O6-EtGua分子的最初濃度(A0)、AT分子的最初濃度(B0)以及在修復(fù)反應(yīng)的時(shí)間t時(shí)脫烷基O6-EtGua分子的濃度(P)。為了計(jì)算AT和K，開發(fā)了一計(jì)算機(jī)程序。因此，細(xì)胞提取物含有0.7fmolAT分子，并且K為4×107l/mol×sec。
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權(quán)利要求
1．一種分析通過DNA修復(fù)酶修復(fù)DNA修飾和堿基錯(cuò)配以及無(wú)嘌呤和無(wú)嘧啶位點(diǎn)的方法，包括下列步驟(a)提供單鏈或雙鏈DNA分子，該DNA分子通過與反應(yīng)性方形酸衍生物反應(yīng)經(jīng)在該DNA的5’-端或3’-端或至少一個(gè)脫氧核糖殘基的2’-位置加入該DNA分子的伯或仲氨基共價(jià)偶聯(lián)到載有伯或仲氨基的固相基質(zhì)上，并具有修飾和/或堿基錯(cuò)配和/或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)；(b)使該DNA分子與含有DNA修復(fù)酶的組合物接觸；(c)測(cè)定DNA修飾和/或堿基錯(cuò)配和/或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的剔除。
2．如權(quán)利要求1所述的方法，其中反應(yīng)性方形酸衍生物為方形酸二酯，尤其是方形酸二乙酯。
3．如前面任意權(quán)利要求所述的方法，其中通過該修飾和/或堿基錯(cuò)配和/或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的抗體或相應(yīng)抗體片段測(cè)定DNA修飾和/或堿基錯(cuò)配和/或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)從偶聯(lián)到固相基質(zhì)上的DNA分子中的剔除。
4．如前面任意權(quán)利要求所述的方法，其中通過切除修復(fù)測(cè)定DNA修飾和/或堿基錯(cuò)配和/或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)從偶聯(lián)到固相基質(zhì)上的DNA分子中的剔除，其中檢測(cè)失去的DNA片段，該修飾和/或堿基錯(cuò)配和/或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)一經(jīng)切除就不再與固相基質(zhì)相連。
5．如權(quán)利要求4所述的方法，其中通過切除修復(fù)失去的DNA片段含有諸如發(fā)色分子、熒光分子、放射性原子或基團(tuán)結(jié)合標(biāo)記的標(biāo)記。
6．如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述標(biāo)記或基團(tuán)結(jié)合標(biāo)記是通過將DNA分子偶聯(lián)到固相基質(zhì)上加入的。
7．如權(quán)利要求4-6任意所述的方法，其中具有不同修飾或堿基錯(cuò)配或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的DNA分子各自帶有不同標(biāo)記或基團(tuán)結(jié)合標(biāo)記，以便同時(shí)分析不同DNA修飾或堿基錯(cuò)配或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的修復(fù)。
8．如前面任意權(quán)利要求所述的方法，其中在允許修飾劑作用于偶聯(lián)到固相基質(zhì)上的DNA分子的情況下將修飾加入DNA分子。
9．如前面任意權(quán)利要求所述的方法，其中測(cè)定含有修復(fù)酶的組合物對(duì)一個(gè)或多個(gè)DNA修飾或堿基錯(cuò)配或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)的修復(fù)能力。
10．如權(quán)利要求9所述的方法，其中從細(xì)胞或組織樣品中回收含有修復(fù)酶的組合物，并使用該修復(fù)能力確定個(gè)體的腫瘤易感性、個(gè)體的輻射敏感性或個(gè)體的對(duì)基因素性化學(xué)治療的敏感性或腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射或化學(xué)治療劑的抗性。
11．用于實(shí)施前面任意權(quán)利要求所述方法的測(cè)定試劑盒，包括(a)載有伯或仲氨基的固相基質(zhì)；(b)DNA分子，其具有在該DNA的5’-端或3’-端或至少一個(gè)脫氧核糖殘基的2’-位置加入該DNA分子的伯或仲氨基；(c)可能的DNA修飾或堿基錯(cuò)配或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)衍生物的抗體或抗體片段；(d)反應(yīng)性方形酸衍生物。
12．用于實(shí)施前面任意權(quán)利要求所述方法的測(cè)定試劑盒，包括(a)單鏈或雙鏈DNA分子，這些DNA分子通過與反應(yīng)性方形酸衍生物反應(yīng)經(jīng)在該DNA的5’-端或3’-端或至少一個(gè)脫氧核糖殘基的2’-位置加入該DNA分子的伯或仲氨基共價(jià)偶聯(lián)到載有伯或仲氨基的固相基質(zhì)上，并且這些DNA分子可以具有修飾和/或堿基錯(cuò)配和/或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)，可以載有標(biāo)記或基團(tuán)結(jié)合標(biāo)記；(b)選擇性的抗體或抗體片段，它們特異性地針對(duì)DNA修飾或堿基錯(cuò)配或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)或無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分析通過DNA修復(fù)酶修復(fù)DNA修飾和如無(wú)嘌呤位點(diǎn)和無(wú)嘧啶位點(diǎn)的堿基錯(cuò)配的方法和測(cè)定試劑盒。按照所述方法,使通過與反應(yīng)性方形酸反應(yīng)共價(jià)偶聯(lián)到固相基質(zhì)上的DNA分子與含有DNA修復(fù)酶的組合物接觸。該測(cè)定試劑盒含有所述分析需要的這些組分。
文檔編號(hào)C07K16/44GK1325456SQ99812931
公開日2001年12月5日 申請(qǐng)日期1999年11月2日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月3日
發(fā)明者彼得·內(nèi)爾斯, 卡爾－海因茨·格魯森坎普 申請(qǐng)人:彼得·內(nèi)爾斯