專利名稱：具有改變的免疫原性反應(yīng)的蛋白質(zhì)及制備和使用該蛋白質(zhì)的方法
背景技術(shù)：
用于工業(yè)、制藥和商業(yè)應(yīng)用的蛋白質(zhì)越來越流行了。暴露于蛋白質(zhì)的個(gè)體變得對該蛋白質(zhì)致敏，因此隨后的暴露可導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)。例如，一些蛋白酶在某些個(gè)體中可導(dǎo)致過敏性反應(yīng)。結(jié)果，盡管蛋白酶有在工業(yè)中的有用性，如在洗衣店洗滌劑、化妝品、紡織品處理等中，以及在提供改進(jìn)的蛋白酶的領(lǐng)域中進(jìn)行了詳盡的研究，其中該蛋白酶在去垢性條件下具有如更有效的去污能力；但是蛋白酶在工業(yè)中的使用是有問題的。
已經(jīng)做了許多工作來減輕這些問題。在探索用于減少蛋白酶使用的潛在免疫原性的策略中，已有通過控制并使灰塵顆粒或含有空中的蛋白酶的氣溶膠的在工作場所的濃度最小化而減少潛在接觸的改進(jìn)的生產(chǎn)方法、減少從蛋白酶產(chǎn)物中產(chǎn)生的灰塵顆?；驓馊苣z的實(shí)際量的改進(jìn)的顆粒形成方法以及用于減少終產(chǎn)物中潛在的變應(yīng)原性污染水平的改進(jìn)的回收方法。然而，減少蛋白酶的變應(yīng)原性的努力本身是相對不成功的?？蛇x擇地，已進(jìn)行了努力以屏蔽被過敏個(gè)體中免疫球蛋白E(IgE)識別的蛋白酶的抗原決定部位(PCT Publication No.WO 92/10755)，或者通過將多聚體或肽/蛋白質(zhì)附著到有問題的蛋白酶上而擴(kuò)大或改變抗原決定簇的特性。
當(dāng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)以過度或不適當(dāng)?shù)姆绞桨l(fā)生時(shí)，則將經(jīng)歷該反應(yīng)的個(gè)體稱為過敏的。過敏性反應(yīng)是正常有益的免疫反應(yīng)不適當(dāng)?shù)刈饔玫慕Y(jié)果，并有時(shí)可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和組織損害。它們可由許多抗原引起；且過敏性反應(yīng)的原因?qū)⒁騻€(gè)體而異。過敏性在第一次與抗原接觸時(shí)一般不顯示，但通常在隨后的接觸中出現(xiàn)。一種形式的過敏性是在IgE反應(yīng)針對良性的環(huán)境抗原如花粉、塵螨(dust-mites)或動物皮屑時(shí)發(fā)生的。結(jié)果導(dǎo)致的IgE-致敏肥大細(xì)胞對藥學(xué)介質(zhì)的釋放產(chǎn)生了具有如哮喘或鼻炎癥狀的急性炎癥反應(yīng)。
但是包含修飾IgE位點(diǎn)的策略在防止最初的致敏反應(yīng)的發(fā)生時(shí)通常不是成功的。因此，這種策略盡管可能抵消或減少隨后過敏性反應(yīng)的嚴(yán)重性，但不減少實(shí)際致敏的人或數(shù)目。例如，當(dāng)已知一個(gè)人對某個(gè)抗原過敏時(shí)，處理這種狀況的通常方式是盡可能完全地使過敏的人與抗原分離。事實(shí)上，任何其他的反應(yīng)過程對于過敏個(gè)體的健康都可能是有害的。因而，盡管減少一個(gè)特定的蛋白質(zhì)對于過敏個(gè)體的危害是重要的，但對于工業(yè)目的更有價(jià)值的將為減少或消除蛋白質(zhì)使過敏反應(yīng)首先起始的能力。
T-淋巴細(xì)胞(T-細(xì)胞)是在誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中及在實(shí)行免疫學(xué)效應(yīng)物功能中的關(guān)鍵參與者。對于傳染性介質(zhì)和腫瘤的特異性免疫已知是依賴于這些細(xì)胞的，且據(jù)信這些細(xì)胞有助于傷害的治愈。另一方面，控制這些反應(yīng)的失敗可導(dǎo)致自身攻擊。通常，抗原是以抗原呈遞細(xì)胞的形式呈遞到T-細(xì)胞的，該抗原呈遞細(xì)胞通過多種細(xì)胞表面機(jī)制，以適合于由T-細(xì)胞的抗原識別的方式捕獲并展示抗原或部分抗原。在由T-細(xì)胞表面的受體(T-細(xì)胞受體)識別特定的抗原決定部位之后，T-細(xì)胞開始一系列的復(fù)雜作用，包括增殖，這導(dǎo)致抗體由B-細(xì)胞的生產(chǎn)。盡管T-細(xì)胞和B-細(xì)胞都是由存在于給定的蛋白質(zhì)或肽上的抗原決定部位激活的，但是由這些單核細(xì)胞識別的實(shí)際抗原決定部位通常不是相同的。事實(shí)上，激活T-細(xì)胞以起始免疫學(xué)多樣性的抗原決定部位經(jīng)常與隨后在免疫學(xué)反應(yīng)過程中由B-細(xì)胞識別的抗原決定部位是不同的。因而，對于過敏性而言，盡管T-細(xì)胞和抗原之間特定的抗原相互作用在使對抗原暴露的免疫反應(yīng)起始中是關(guān)鍵的成分，但該相互作用的細(xì)節(jié)即識別的抗原決定部位通常與由IgE抗體介導(dǎo)的完全(full blown)變態(tài)反應(yīng)的隨后發(fā)展是不相關(guān)的。
PCT Publication No.WO 96/40791公開了用聚環(huán)氧烷作為起始材料來生產(chǎn)具有減少的變應(yīng)原性的聚環(huán)氧烷-蛋白酶綴合物的方法。
PCT Publication No.WO 97/30148公開了具有減少的變應(yīng)原性的多肽綴合物，該綴合物包含一種具有兩個(gè)或多個(gè)共價(jià)偶聯(lián)的多肽分子的多聚體載體分子。
PCT Publication No.WO 96/17929公開了生產(chǎn)具有減少的變應(yīng)原性的多肽的方法，該方法包含使1～30個(gè)聚分子(polymolecule)與親代多肽綴合的步驟。
PCT Publication No.WO 92/10755公開了生產(chǎn)在動物中引起減少的免疫原性反應(yīng)的蛋白質(zhì)變體的方法。在該申請中，將目標(biāo)蛋白質(zhì)、其一系列蛋白酶及變體用于對大鼠的免疫接種。然后將來自大鼠的血清用于測量已經(jīng)生產(chǎn)的和存在于免疫接種的血清中的多克隆抗體對目標(biāo)蛋白質(zhì)及其變體的反應(yīng)性。從這些結(jié)果中看，有可能確定制劑中的抗體是否與蛋白質(zhì)及其變體具有相對更多或更少的反應(yīng)，因而允許對蛋白質(zhì)中何種變化可能抵消或減少Ig結(jié)合能力的研究。通過對大鼠的這些檢驗(yàn)，得出結(jié)論為枯草桿菌蛋白酶309的殘基中相應(yīng)于127、128、129、130、131、151、136、151、152、153、154、161、162、163、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、186、193、194、195、196、197、247、251、261的任何一個(gè)的改變將導(dǎo)致免疫學(xué)潛力的改變。
PCT Publication No.WO 94/10191公開了包含親代單體蛋白質(zhì)的寡聚形式的低變應(yīng)原蛋白質(zhì)，其中該寡聚體基本保持了其活性。
PCT Publication No.WO 99/49056公開了許多在限定的抗原決定部位區(qū)域具有氨基酸替代的枯草桿菌蛋白酶變體。然而，由于公開的變體的大的數(shù)目，本領(lǐng)域的技術(shù)人員面臨著關(guān)于鑒定具有降低的免疫原性作用的最適蛋白酶產(chǎn)物的問題，該最適蛋白酶用于個(gè)人護(hù)理或其他人體應(yīng)用。
PCT Publication No.WO 01/07578公開了許多在限定的抗原決定部位區(qū)域具有氨基酸替代的枯草桿菌蛋白酶變體。然而，由于公開的變體的大的數(shù)目，本領(lǐng)域的技術(shù)人員面臨著關(guān)于鑒定具有降低的免疫原性作用的最適蛋白酶產(chǎn)物的問題，該最適蛋白酶用于個(gè)人護(hù)理或其他人體應(yīng)用。
盡管一些研究已提供了減少某些蛋白質(zhì)的變應(yīng)原性和鑒定在某些個(gè)體中導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)的抗原決定部位的方法，但用于鑒定這些抗原決定部位的測定通常包含對在先前暴露于抗原的血清中IgE和IgG抗體的測量。然而一旦Ig反應(yīng)起始，致敏作用已經(jīng)出現(xiàn)。因此，需要鑒定產(chǎn)生增強(qiáng)的免疫學(xué)反應(yīng)的蛋白質(zhì)，同時(shí)需要生產(chǎn)可產(chǎn)生減少的免疫學(xué)反應(yīng)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明滿足了這些和其他的需要。
發(fā)明概述此處提供的方法和組合物在形成低變應(yīng)原性組合物中是有用的。如在此處所用的，“低變應(yīng)原性”指組合物比本發(fā)明的蛋白質(zhì)前體的相同組合物產(chǎn)生了更低的免疫原性反應(yīng)。如在此處所用的，“超變應(yīng)原性”指組合物比本發(fā)明的蛋白質(zhì)前體的相同組合物產(chǎn)生了更高的免疫原性反應(yīng)。
可將本發(fā)明的組合物應(yīng)用于如清潔組合物、肽水解產(chǎn)物、化妝品制劑、皮膚、頭發(fā)和口腔護(hù)理制劑、藥物如血凝塊去除產(chǎn)品、研究產(chǎn)品如酶和治療劑包括疫苗。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，在這里選擇并提供了目標(biāo)蛋白酶。該目標(biāo)蛋白酶優(yōu)選地是一種具有T-細(xì)胞抗原決定部位的，并然后如下所述進(jìn)行改變。然而，目標(biāo)蛋白酶也可基于天然存在的性質(zhì)進(jìn)行選擇而不進(jìn)行改變。
在本發(fā)明的一個(gè)方面中，此處提供的是包含T-細(xì)胞抗原決定部位的目標(biāo)蛋白酶的變體。該變體與目標(biāo)蛋白酶區(qū)別在于具有改變的T-細(xì)胞抗原決定部位，從而該變體和該目標(biāo)蛋白酶在人中產(chǎn)生不同的(如增加的、減少的或消除的)免疫原性反應(yīng)。
蛋白酶可為任何目標(biāo)蛋白酶。在一個(gè)方面，該蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，目標(biāo)蛋白酶和這些目標(biāo)蛋白酶的變體各自包含至少一些相同的活性。例如，如果提供了蛋白酶的變體，該變體將產(chǎn)生改變的免疫原性反應(yīng)，但將保持可探測的且優(yōu)選地可比較的蛋白酶活性和穩(wěn)定性。
其中提供了目標(biāo)蛋白酶的變體，T-細(xì)胞抗原決定部位可以以許多途徑進(jìn)行改變，該途徑包括氨基酸替代、缺失、加入及其組合。優(yōu)選地，T-細(xì)胞抗原決定部位是通過進(jìn)行氨基酸替代而改變的。在此處的一個(gè)實(shí)施方案中，對相應(yīng)于目標(biāo)蛋白酶同系物的氨基酸進(jìn)行氨基酸替代，其中該同系物在相應(yīng)的位置不包含與目標(biāo)蛋白酶相同的T-細(xì)胞抗原決定部位。在一個(gè)方面中，包含至少一個(gè)T-細(xì)胞抗原決定部位的目標(biāo)蛋白酶的末端部分是用目標(biāo)蛋白酶同系物的相應(yīng)末端部分替代的，其中該替代產(chǎn)生了該不同的免疫原性反應(yīng)。
在此處提供的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了編碼產(chǎn)生想要的免疫原性反應(yīng)的蛋白酶的核酸。此外，本發(fā)明包括包含在此處提供的核酸的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。一旦鑒定了本發(fā)明的蛋白酶及其變體，則可在此處鑒定并提供與蛋白酶及變體基本同源的或那些與其可進(jìn)行雜交的序列。同源性進(jìn)一步在下面進(jìn)行定義，且可指相似性或一致性，而一致性是優(yōu)選的。優(yōu)選地，同源序列為氨基酸序列或編碼肽的核酸，該肽具有在此處提供的蛋白酶和變體的活性。
在本發(fā)明的另外一個(gè)方面中提供了具有改變的免疫原性反應(yīng)的蛋白酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)蛋白酶或變體包含由如下方法確定的抗原決定部位，該方法包含(a)從單個(gè)血液來源獲得樹突細(xì)胞溶液和未實(shí)驗(yàn)過的CD4+和/或CD8+T-細(xì)胞溶液；(b)促進(jìn)該樹突細(xì)胞溶液中的分化；(c)使該蛋白質(zhì)與該分化的樹突細(xì)胞溶液和該未實(shí)驗(yàn)過的CD4+和/或CD8+T-細(xì)胞溶液組合；和(d)測量在該步驟(c)中T-細(xì)胞的增殖。
本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)那些通常已知為枯草桿菌蛋白酶的絲氨酸蛋白酶(包括枯草桿菌蛋白酶BPN’)在相應(yīng)于BPN’的氨基酸位置70-84具有顯著的抗原決定部位，即第一個(gè)抗原決定部位區(qū)域，以及在109-123為第二個(gè)抗原決定部位區(qū)域。本發(fā)明者在此處對這種枯草桿菌蛋白酶進(jìn)行了基因重設(shè)計(jì)以進(jìn)行改變?nèi)鐪p輕歸結(jié)于這些抗原決定部位區(qū)域的免疫學(xué)性質(zhì)。在這樣做時(shí)，本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)引起降低的免疫學(xué)反應(yīng)而仍然維持其作為有效的蛋白酶的活性的枯草桿菌蛋白酶。此外，本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)引起這種降低的免疫學(xué)反應(yīng)的并是熱和pH穩(wěn)定的枯草桿菌蛋白酶。因此，本蛋白酶適用于幾個(gè)類型的組合物，該組合物包括但不局限于用于藥物、洗衣店、皿、硬表面、皮膚護(hù)理、頭發(fā)護(hù)理、美容護(hù)理、口腔護(hù)理和隱形眼鏡的組合物。
本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)那些通常已知為枯草桿菌蛋白酶的絲氨酸蛋白酶(包括枯草桿菌蛋白酶BPN’)在相應(yīng)于BPN’的氨基酸位置70-84具有顯著的抗原決定部位，即第一個(gè)抗原決定部位區(qū)域，以及在109-123為第二個(gè)抗原決定部位區(qū)域。本發(fā)明者在此處對這種枯草桿菌蛋白酶進(jìn)行了基因的重設(shè)計(jì)以進(jìn)行改變?nèi)鐪p輕歸結(jié)于這些抗原決定部位區(qū)域的免疫原性性質(zhì)。在這樣做時(shí)，本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)引起降低的免疫原性反應(yīng)而仍然維持其作為有效的蛋白酶的活性的枯草桿菌蛋白酶。此外，本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)引起這種降低的免疫原性反應(yīng)的并是熱和pH穩(wěn)定的枯草桿菌蛋白酶。因此，本蛋白酶適用于幾種類型的組合物，該組合物包括但不局限于用于藥物、洗衣店、皿、硬表面、皮膚護(hù)理、頭發(fā)護(hù)理、美容護(hù)理、口腔護(hù)理和隱形眼鏡的組合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)了目標(biāo)蛋白酶的變體，其中該變體與目標(biāo)蛋白酶區(qū)別在于具有改變的T-細(xì)胞抗原決定部位，從而該變體和目標(biāo)蛋白酶在人中產(chǎn)生不同的免疫原性反應(yīng)。目標(biāo)T-細(xì)胞抗原決定部位包括選自相應(yīng)于解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)枯草桿菌蛋白酶的76、79和122的殘基位置的氨基酸殘基替代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)T-細(xì)胞包括選自76和122的氨基酸位置。在另一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)T-細(xì)胞包括位于位置122的替代和位置76和79之一或兩者的氨基酸殘基位置替代。在一個(gè)實(shí)施方案中，由變體產(chǎn)生的免疫原性反應(yīng)比由目標(biāo)蛋白酶產(chǎn)生的免疫原性反應(yīng)低。在另一個(gè)實(shí)施方案中，由變體產(chǎn)生的免疫原性反應(yīng)比由目標(biāo)蛋白酶產(chǎn)生的免疫原性反應(yīng)高。也可包括在位置3、31、40、41、111、147、218、206和/或217中的一個(gè)或多個(gè)的額外替代。也可包括在位置216、181、101、215、216、217、247、46、154、128、182、107、250、254、258、50、47、48、182、183、185、248和/或262中的一個(gè)或多個(gè)的額外替代。也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了包括上述殘基的多種排列的特定替代組。也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了包括上述殘基的多種排列的特定替代組。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)一種減少蛋白酶的免疫原性反應(yīng)的方法，該方法包含獲得前體蛋白酶；及獲得該前體蛋白酶的變體，該變體具有至少一個(gè)前體蛋白酶的T-細(xì)胞抗原決定部位，其中該變體顯示與前體蛋白酶的免疫原性反應(yīng)不同的改變的免疫原性反應(yīng)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)編碼在此處申請專利的變體蛋白酶的核酸、表達(dá)載體、用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、清潔組合物、口腔清潔組合物、藥物組合物和皮膚護(hù)理組合物(包括化妝可接受的載體、皮膚護(hù)理活性物、濕潤劑、潤膚劑、乳化劑、多聚增稠劑(polymeric thickening agent)和硅油)。
本發(fā)明的其他方面將通過下面的描述而被技術(shù)人員理解。
附圖簡述

圖1A、B1、B2和B3圖解說明解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(BPN’)的DNA(SEQ IDNO 1)和氨基酸(SEQ IDNO 2)序列及該基因的部分限制性切割圖。
圖2圖解了來自解淀粉芽孢桿菌(SEQ IDNO 3)和遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)(野生型)(SEQ IDNO 4)的枯草桿菌蛋白酶中的保守氨基酸殘基。
圖3A和3B圖解了來自解淀粉芽孢桿菌(BPN’)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)(SEQ IDNO 5)和遲緩芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶類型的蛋白酶的氨基酸序列比對。符號*表示與枯草桿菌蛋白酶BPN’相比特定的氨基酸殘基的缺失。
圖4a圖解了前體蛋白酶P1的氨基酸序列。
圖4b圖解了與變體LAP2(BPN’-Y217L/I79A/I122A)、LAP3(BPN’-Y217L/N76D/I122A)和LAP4(BPN’-Y217L/N76D/I79A/I122A)相比，對枯草桿菌蛋白酶P1(BPN’-Y217L)的體外反應(yīng)。
圖4b圖解了對于70-84 BPN’肽和多種變體的反應(yīng)百分?jǐn)?shù)(n＝20)。
圖5圖解了P1(BPN’-Y217L)109-123殘基位點(diǎn)效應(yīng)器的刺激指數(shù)(SI)。
圖6圖解了在從殘基109到123的抗原決定部位中具有不同的丙氨酸替代的13個(gè)肽序列，該替代用于確定人被試者對被試者肽的改變的免疫原性反應(yīng)。
圖7圖解了當(dāng)暴露于圖6的合成的丙氨酸肽時(shí)5個(gè)人被試者的刺激指數(shù)(SI)。
圖7a圖解了當(dāng)暴露于圖6的肽序列時(shí)幾個(gè)人被試者的SI。
圖7b圖解了雌性HLA-DR3/DQ2 P1在明礬中的反應(yīng)。
圖7c圖解了雄性HLA-DR3/DQ2 P1在明礬中的反應(yīng)。
圖8圖解了5mg/ml二甲基酪蛋白底物溶液在pH 5.5時(shí)的水解，其由不同濃度的枯草桿菌蛋白酶變體水解，并通過底物吸收中的變化所顯示(P1-◇-；-□-LAP2；-△-LAP3和-x-LAP4)。
圖9圖解了5mg/ml二甲基酪蛋白底物溶液在pH 6.5時(shí)的水解，其由不同濃度的枯草桿菌蛋白酶變體水解，并通過底物吸收中的變化所顯示(P1-◇-；-□-LAP2；-△-LAP3和-x-LAP4)。
圖10圖解了5mg/ml二甲基酪蛋白底物溶液在pH 7.5時(shí)的水解，其由不同濃度的枯草桿菌蛋白酶變體水解，并通過底物吸收中的變化所顯示(P1-◇-；-□-LAP2；-△-LAP3和-x-LAP4)。
圖11通過底物吸收中的變化圖解了5mg/ml二甲基酪蛋白底物溶液在pH 8.5時(shí)被不同濃度的枯草桿菌蛋白酶變體水解(P1-◇-；-□-LAP2；-△-LAP3和-x-LAP4)。
圖12通過底物吸收中的變化圖解了5mg/ml牛膠原蛋白底物溶液被不同枯草桿菌蛋白酶變體在各種pH(5.5-8.5)水解(P1-◇-；-□-LAP2；-△-LAP3和-x-LAP4)。
圖13通過底物吸收中的變化圖解了5mg/ml牛彈性蛋白底物溶液被不同枯草桿菌蛋白酶變體在各種pH(5.5-8.5)水解(P1-◇-；-□-LAP2；-△-LAP3和-x-LAP4)。
圖14通過底物吸收中的變化圖解了5mg/ml牛角蛋白底物溶液被不同枯草桿菌蛋白酶變體在各種pH(5.5-8.5)水解(P1-◇-；-□-LAP2；-△-LAP3和-x-LAP4)。
圖15圖解了在溫度范圍42-56℃的酶半衰期的變化，其作為多種蛋白酶變體在50mM PIPES(pH 6.5)中穩(wěn)定性的測量指標(biāo)(P1-◇-；-□-LAP2；-△-LAP3和-x-LAP4)。
圖16圖解了在溫度范圍42-56℃的酶半衰期的變化，其作為多種蛋白酶變體在50mM TES(pH 7.5)中穩(wěn)定性的測量指標(biāo)(P1-◇-；-□-LAP2；-△-LAP3和-x-LAP4)。
發(fā)明詳述在本發(fā)明的一個(gè)方面，目的是獲得與前體蛋白酶或目標(biāo)蛋白酶相比具有改變的免疫原性反應(yīng)和變應(yīng)原潛力的變體蛋白酶，這是因?yàn)闇p少這種潛力使得能夠更安全地使用酶。盡管目前的發(fā)明對于改變免疫原性反應(yīng)潛力是有用的，但在此處詳細(xì)說明的突變可以與本領(lǐng)域公知的突變結(jié)合以實(shí)現(xiàn)與前體相比改變的熱穩(wěn)定性和/或改變的底物特異性、修飾的活性、增加的特定活性、改變的堿穩(wěn)定性或改變的B-細(xì)胞抗原決定部位。
根據(jù)本發(fā)明，提供了具有改變的免疫原性反應(yīng)的蛋白酶變體，該變體包含T-細(xì)胞抗原決定部位，其中目標(biāo)肽的變體與前體肽或目標(biāo)肽區(qū)別在于具有改變的T-細(xì)胞抗原決定部位，從而目標(biāo)變體肽在人中產(chǎn)生了不同的免疫原性反應(yīng)。本發(fā)明者預(yù)期改變的免疫原性反應(yīng)包括改變的變應(yīng)原性，這包括增加的或降低的免疫原性反應(yīng)。T-細(xì)胞抗原決定部位可包括選自那些鑒定的抗原決定部位中的殘基的氨基酸替代。包括這種減少的免疫原性反應(yīng)替代的本發(fā)明的變體蛋白酶特征在于與前體蛋白酶、不產(chǎn)生免疫原性反應(yīng)的點(diǎn)突變變體或雜交蛋白酶變體的可比較的活性。
本發(fā)明也包括改變?nèi)缭黾踊蚪档偷鞍酌傅拿庖咴苑磻?yīng)的方法，該方法包含獲得前體蛋白酶；及修飾前體蛋白酶以獲得該前體蛋白酶的變體或衍生物，該變體具有前體蛋白酶的至少一個(gè)改變的T-細(xì)胞抗原決定部位。此外，該變體特征在于顯示與前體蛋白酶的免疫原性反應(yīng)不同的改變的免疫原性反應(yīng)。如在本申請其他地方描述的，在枯草桿菌蛋白酶中有至少兩個(gè)T-細(xì)胞抗原決定部位，即相應(yīng)于解淀粉芽孢桿菌的殘基70-84的第一個(gè)和相應(yīng)于解淀粉芽孢桿菌的殘基109～123的第二個(gè)抗原決定部位。該方法可進(jìn)一步包括確定增加或降低這種免疫原性反應(yīng)的殘基。這些殘基可通過在本發(fā)明其他地方描述的肽篩選技術(shù)來確定。在一個(gè)實(shí)施方案中，變體蛋白酶包含在一組相應(yīng)于解淀粉芽孢桿菌氨基酸位置76、79和122的位置的氨基酸替代，該替代位于至少一個(gè)該抗原決定部位中。結(jié)果所得的變體顯示與前體蛋白酶相比改變的免疫原性反應(yīng)。
應(yīng)理解的是術(shù)語蛋白質(zhì)、多肽和肽有時(shí)在此處是互換使用的。其中肽是蛋白質(zhì)的一部分，技術(shù)人員可通過該術(shù)語使用的環(huán)境而理解這一點(diǎn)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，具有改變的免疫原性反應(yīng)(如增加的免疫原性或降低的免疫原性反應(yīng))的肽源自目標(biāo)蛋白酶。該目標(biāo)蛋白酶可為野生型的、突變的變體、綴合的變體、在目標(biāo)抗原決定部位中具有氨基酸缺失、替代或插入的雜交變體，該目標(biāo)蛋白酶可導(dǎo)致個(gè)體中或個(gè)體取樣中的致敏。該抗原決定部位可通過如下鑒定抗原決定部位和非抗原決定部位的測定來鑒定使分化的樹突細(xì)胞與未實(shí)驗(yàn)過的人CD4+和/或CD8+T-細(xì)胞及與目標(biāo)肽組合。更特定地，可提供減少的免疫原性反應(yīng)的目標(biāo)蛋白酶，其中T-細(xì)胞抗原決定部位的識別包含步驟(a)從單個(gè)血液來源獲得樹突細(xì)胞溶液和未實(shí)驗(yàn)過的CD4+和/或CD8+T-細(xì)胞溶液；(b)促進(jìn)該樹突細(xì)胞溶液中的分化；(c)使目標(biāo)肽與該分化的樹突細(xì)胞溶液和該未實(shí)驗(yàn)過的CD4+和/或CD8+T-細(xì)胞組合；和(d)測量在該步驟(c)中T-細(xì)胞的增殖。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，制備了一系列相應(yīng)于所有或部分目標(biāo)蛋白酶的肽寡聚體。例如，生產(chǎn)了覆蓋蛋白質(zhì)的有關(guān)部分或全部的肽文庫。在一個(gè)實(shí)施方案中，生產(chǎn)肽的方式是在肽文庫中引入重疊，例如生產(chǎn)相應(yīng)于被試者蛋白質(zhì)的氨基酸序列1-10的第一個(gè)肽、相應(yīng)于被試者蛋白質(zhì)的氨基酸序列4-14的第二個(gè)肽、相應(yīng)于被試者蛋白質(zhì)的氨基酸序列7-17的第三個(gè)肽、相應(yīng)于被試者蛋白質(zhì)的氨基酸序列10-20的第四個(gè)肽等，直到形成了相應(yīng)于整個(gè)分子的代表肽為止。通過在此處提供的測定中單獨(dú)分析每一個(gè)肽，可能的是精確地鑒定由T-細(xì)胞識別的抗原決定部位的位置。在上面的例子中，一個(gè)特定的肽比其鄰近肽更強(qiáng)的反應(yīng)將促進(jìn)將抗原決定部位錨定區(qū)域鑒定到3個(gè)氨基酸。在確定了這些抗原決定部位的位置之后，可能的是改變每一個(gè)抗原決定部位中的氨基酸直到肽產(chǎn)生了與最初的蛋白質(zhì)不同的T-細(xì)胞反應(yīng)。此外，可在此處對具有想要的低的T-細(xì)胞抗原決定部位潛能的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，該蛋白質(zhì)可以以其天然存在的形式使用。
如在此處所用的“抗原呈遞細(xì)胞”指免疫系統(tǒng)的一種細(xì)胞，該細(xì)胞在其表面呈遞可由T-細(xì)胞表面的受體識別的抗原?？乖蔬f細(xì)胞的例子為樹突細(xì)胞、交錯(cuò)突細(xì)胞、活化的B-細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。
如在此處所用的“T-細(xì)胞增殖”指在有抗原或無抗原時(shí)T-細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞的溫育過程中生產(chǎn)的T-細(xì)胞的數(shù)目。
如在此處所用的“基礎(chǔ)(baseline)T-細(xì)胞增殖”指在不存在肽或蛋白質(zhì)抗原時(shí)并且暴露于抗原呈遞細(xì)胞時(shí)，個(gè)體中通?？梢姷腡-細(xì)胞增殖。對于此處的目的，基礎(chǔ)T-細(xì)胞增殖水平如同在不存在抗原時(shí)響應(yīng)于抗原呈遞細(xì)胞的T-細(xì)胞增殖一樣，是在對每個(gè)個(gè)體的每個(gè)樣品的基礎(chǔ)上進(jìn)行確定的。
“T-細(xì)胞抗原決定部位”指在對包含該抗原的肽的免疫學(xué)反應(yīng)的起始時(shí)由T-細(xì)胞受體識別的肽或蛋白質(zhì)的性質(zhì)。通常認(rèn)為T-細(xì)胞抗原決定部位由T-細(xì)胞的識別是經(jīng)由下面機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，其中T-細(xì)胞識別結(jié)合到在抗原呈遞細(xì)胞表面表達(dá)的類型I或類型II主要組織相容性(MHC)分子的抗原的肽片段(參見如Moeller，G.ed.，“MHC-限制的反應(yīng)活化的抗原需求(Antigenic Requirements forActivation of MHC-restricted Responses)”，ImmunologicalReview，Vol.98，p.187(Copenhagen；Munksgaard)(1987)。
如在此處所用的“樣品”包含未實(shí)驗(yàn)過的單核細(xì)胞，即沒有對正被討論的抗原致敏的。
如在此處所用的“同系物”指具有與目標(biāo)蛋白質(zhì)相似的催化作用、結(jié)構(gòu)和/或用途的蛋白質(zhì)或酶。對于本發(fā)明的目的，同系物和目標(biāo)蛋白質(zhì)不必是進(jìn)化上相關(guān)的，如來自不同物種的相同功能的蛋白質(zhì)。想要的是找到具有與目標(biāo)蛋白質(zhì)相似的三級和/或一級結(jié)構(gòu)的同系物，這是因?yàn)閷⒛繕?biāo)蛋白質(zhì)中的抗原決定部位用來自同系物的相似區(qū)段替代將減少變化的破壞性。因而，緊密同源的酶將提供抗原決定部位替代的最想要的來源。可選擇地，如果可能，有利的是尋找給定蛋白質(zhì)的人同系物。例如，用來自枯草桿菌蛋白酶的人同系物(即人枯草桿菌蛋白酶)的序列對細(xì)菌枯草桿菌蛋白酶中特定的抗原決定部位的替代應(yīng)該導(dǎo)致細(xì)菌蛋白質(zhì)中減少的免疫原性反應(yīng)。
“相似的”序列可通過確保替代的氨基酸顯示與位于或鄰近抗原決定部位的目標(biāo)蛋白質(zhì)中的氨基酸相似的功能、三級結(jié)構(gòu)和/或保守殘基。因而，在抗原決定部位區(qū)域含有如α-螺旋或β-折疊結(jié)構(gòu)時(shí)，替代的氨基酸應(yīng)該維持特定的結(jié)構(gòu)。
然后可將確定或鑒定的抗原決定部位修飾以進(jìn)行改變，如增加或減少目標(biāo)蛋白質(zhì)的免疫學(xué)潛力。在一個(gè)實(shí)施方案中，要修飾的抗原決定部位產(chǎn)生了比樣品中基礎(chǔ)T-細(xì)胞增殖的3倍高的T-細(xì)胞增殖水平。當(dāng)修飾時(shí)，抗原決定部位產(chǎn)生的比基礎(chǔ)增殖的3倍低，優(yōu)選地比基礎(chǔ)增殖的2倍低，及最優(yōu)選地低于或基本等于樣品中的基礎(chǔ)增殖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，要修飾的抗原決定部位產(chǎn)生了比樣品中基礎(chǔ)T-細(xì)胞增殖的3倍低的T-細(xì)胞增殖水平。當(dāng)修飾時(shí)，抗原決定部位產(chǎn)生的比基礎(chǔ)增殖的3倍高，優(yōu)選地比基礎(chǔ)增殖的2倍高，及最優(yōu)選地高于或基本等于樣品中的基礎(chǔ)增殖。
抗原決定部位可通過多種途徑進(jìn)行修飾，例如(a)抗原決定部位的氨基酸序列可用來自目標(biāo)蛋白質(zhì)的人同系物的相似序列進(jìn)行替代；(b)抗原決定部位的氨基酸序列可用來自目標(biāo)蛋白質(zhì)的非人的同系物的相似序列進(jìn)行替代，該相似序列由于T-細(xì)胞抗原決定部位的識別產(chǎn)生了比目標(biāo)蛋白質(zhì)的低的免疫原性反應(yīng)，如變應(yīng)原性；(c)抗原決定部位的氨基酸序列可用基本模擬抗原決定部位的主要三級結(jié)構(gòu)特征的序列替代，但該序列由于T-細(xì)胞抗原決定部位的識別產(chǎn)生了比目標(biāo)蛋白質(zhì)的低的免疫原性反應(yīng)，如變應(yīng)原性；或(d)用任何由于T-細(xì)胞抗原決定部位的識別產(chǎn)生了比目標(biāo)蛋白質(zhì)的低的免疫原性反應(yīng)(如變應(yīng)原性)的序列替代。
應(yīng)理解的是技術(shù)人員易于認(rèn)識到抗原決定部位可依賴于想要的結(jié)果而通過其他途徑進(jìn)行修飾。例如，如果改變對自身抗原的自身免疫是想要的，預(yù)期的是抗原決定部位的氨基酸序列可用降低或?qū)е卵装Y或其他免疫反應(yīng)改變的氨基酸進(jìn)行替代。
本發(fā)明涉及所有想要對其免疫原性進(jìn)行調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員易于認(rèn)識到本發(fā)明的蛋白質(zhì)和肽不必是天然的蛋白質(zhì)和肽。事實(shí)上，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，涉及了具有改變的免疫原性反應(yīng)的改組的基因。對于基因改組及這種基因表達(dá)的描述，參見Stemmer，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 9110747(1994)；Patten等人，Current Opinion in Biotechnol.8724(1997)；Kuehner & Arnold，Trends Biotechnol.15523(1997)；Moore等人，J.Mol.Biol.272336(1997)；Zhao等人，NatureBiotechnol.16258(1998)；Giver等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 9512809(1998)；Harayama，Trends Biotechnol.1676(1998)；Lin等人，Biotechnol.，Prog.15467(1999)；和Sun，J.Comput.Biol.677(1999)?？蓪⒌鞍踪|(zhì)進(jìn)行改變以調(diào)節(jié)對該蛋白質(zhì)的免疫原性反應(yīng)。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶是分離的或純化的。純化或分離指通過將蛋白酶從與其天然聯(lián)合的一些或所有天然存在的成分分離而使蛋白酶從其天然狀態(tài)發(fā)生改變。這可通過本領(lǐng)域公認(rèn)的分離技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，如離子交換層析、親和層析、疏水分離、透析、蛋白酶處理、硫酸銨沉淀或其他蛋白質(zhì)鹽沉淀、離心、大小排阻層析、過濾、微量過濾、凝膠電泳或梯度分離以去除整個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞殘?jiān)?、雜質(zhì)、外源蛋白質(zhì)或最終組合物中不想要的酶。然后進(jìn)一步可能的是向含有蛋白酶的組合物中添加具有額外益處的成分，例如激活劑、抗抑制劑、想要的離子、控制pH的化合物或其他酶如纖維素酶。
除上述蛋白質(zhì)和肽之外，本發(fā)明包括蛋白質(zhì)或提供了展示改變的免疫原性反應(yīng)如增加的或減少的免疫原性反應(yīng)的變體蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)如蛋白酶在當(dāng)它們引起的T-細(xì)胞反應(yīng)比由親代(前體)蛋白質(zhì)引起的強(qiáng)時(shí)展示增加的免疫原性反應(yīng)。該較高的反應(yīng)的凈結(jié)果是對抗變體蛋白質(zhì)的抗體的增加。蛋白質(zhì)在當(dāng)它們引起的T-細(xì)胞反應(yīng)比由親代蛋白質(zhì)引起的弱時(shí)展示減少的免疫原性反應(yīng)。該較低的反應(yīng)的凈結(jié)果是對抗變體蛋白質(zhì)的抗體的缺乏。
用于確定變體蛋白質(zhì)減少的免疫原性反應(yīng)的示范性測定包括但不局限于體內(nèi)測定(HLA-DR3/DQ2小鼠T細(xì)胞反應(yīng))和體外測定(人外周血單核細(xì)胞(PBMC)對蛋白酶1(P1是BPN’-Y217L蛋白酶)及其變體)。用于確定減少的免疫原性反應(yīng)的體內(nèi)測定包括但不局限于轉(zhuǎn)基因小鼠的使用，例如大鼠(Taurog等人，Immunol.Rev.，169209-223(1999))、兔子或豬。用于在體內(nèi)檢驗(yàn)修飾的目標(biāo)蛋白質(zhì)及變體并確定減少的免疫原性反應(yīng)的優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因小鼠模型為HLA-DR3/DQ2小鼠模型。該小鼠模型表達(dá)一般的人群體中常見的單倍型。它在次級免疫器官中的B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上表達(dá)HLA-DR3。它可以以與人T細(xì)胞相似的方式上調(diào)活化的T細(xì)胞上HLA-DR的表達(dá)。它以比HLA-DR低的水平表達(dá)HLA-DQ2，再次與人中HLA分子的表達(dá)模式一致。通過細(xì)胞表面結(jié)合分析顯示目標(biāo)蛋白酶抗原決定部位結(jié)合HLA-DQ2。
本發(fā)明者知道該小鼠模型和在文獻(xiàn)中描述的HLA轉(zhuǎn)基因小鼠模型之間的差別。由本發(fā)明者使用的HLA小鼠以與在人中看到的相似的方式表達(dá)HLA-DR和-DQ，即HLA-DQ的表達(dá)是相當(dāng)?shù)偷?，且不能由LPS-介導(dǎo)的B細(xì)胞的活化來上調(diào)。這與選擇來表達(dá)高水平的單個(gè)HLA轉(zhuǎn)基因的其他轉(zhuǎn)基因動物完全相反。已使該小鼠與鼠的I-Ab-缺陷小鼠進(jìn)行雜交，該缺陷小鼠消除了相應(yīng)于人DQ的內(nèi)源I-Aab異源二聚體的表達(dá)，參見Grusby等人，Proc.Natl Acad.Sci.，903913-3917(1993)。這些小鼠仍然表達(dá)小鼠MHC類型III-Eβ鏈。該分子可與HLA-DRα鏈配對以形成混合二聚體，該混合二聚體可能以高水平表達(dá)于抗原呈遞細(xì)胞上。其他的HLA轉(zhuǎn)基因小鼠已有報(bào)道并可以以相似的方式用于估計(jì)對那些類型II單倍型的潛在免疫反應(yīng)，例如參見Herman等人，J.Immunol.1636275-6282；Sonderstrup等人，Immunological Reviews 172335-343(1999)；Taneja和David，Immunological Reviews 16967-79(1999)。
除了進(jìn)行改變(如增加或減少)動物(如人)中天然存在的氨基酸序列的免疫原性反應(yīng)之外，本發(fā)明包含減少突變的蛋白質(zhì)的免疫原性反應(yīng)，該突變的蛋白質(zhì)如已進(jìn)行改變以使蛋白質(zhì)的功能活性發(fā)生改變的蛋白質(zhì)或蛋白酶。在許多情況下，蛋白質(zhì)突變?nèi)缭黾踊钚?、增加熱穩(wěn)定性、增加堿穩(wěn)定性和/或氧化活性導(dǎo)致突變的蛋白質(zhì)中新的T-細(xì)胞抗原決定部位的整合。本發(fā)明確定了新的T-細(xì)胞抗原決定部位的存在并確定了會改變突變的蛋白質(zhì)的免疫原性反應(yīng)的替代氨基酸。
盡管本發(fā)明包含上述蛋白質(zhì)及許多其他的，但為了簡單，下面將描述本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案，該實(shí)施方案包含蛋白酶的修飾。蛋白酶是通常切割蛋白質(zhì)或肽的肽鍵的羰基水解酶。如在此處所用的，“蛋白酶“指天然存在的蛋白酶或重組蛋白酶。天然存在的蛋白酶包括如a-氨酰肽水解酶、肽基氨基酸水解酶、?；被饷?、絲氨酸羧肽酶、金屬羧肽酶、巰基蛋白酶、羧基蛋白酶和金屬蛋白酶。包括絲氨酸、金屬、巰基和酸性蛋白酶及內(nèi)切和外切蛋白酶。
枯草桿菌蛋白酶是通常切割蛋白質(zhì)或肽的肽鍵的細(xì)菌或真菌蛋白酶。如在此處所用的，“枯草桿菌蛋白酶”指天然存在的枯草桿菌蛋白酶或重組的枯草桿菌蛋白酶。已知一系列天然存在的枯草桿菌蛋白酶是通常由多種微生物物種生產(chǎn)并分泌的。該系列的成員的氨基酸序列不完全是同源的。然而，該系列中的枯草桿菌蛋白酶顯示相同或相似類型的蛋白水解活性。該類絲氨酸蛋白酶具有限定催化三聯(lián)體的共同氨基酸序列，該序列將它們與絲氨酸的胰凝乳蛋白酶相關(guān)的類型區(qū)別開來。枯草桿菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶相關(guān)的絲氨酸蛋白酶均具有包含天冬氨酸、組氨酸和絲氨酸的催化三聯(lián)體。在枯草桿菌蛋白酶相關(guān)的蛋白酶中，這些氨基酸的相對順序從氨基到羧基末端為天冬氨酸-組氨酸-絲氨酸。然而在胰凝乳蛋白酶相關(guān)的蛋白酶中，相對順序?yàn)榻M氨酸-天冬氨酸-絲氨酸。因而，枯草桿菌蛋白酶此處指具有枯草桿菌蛋白酶相關(guān)的蛋白酶的催化三聯(lián)體的絲氨酸蛋白酶。例子包括但不局限于在此處圖3中鑒定的枯草桿菌蛋白酶。通常且對于本發(fā)明的目的，蛋白酶中氨基酸的編號方式相應(yīng)于在圖1中提供的成熟解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶序列的號碼。
“重組體”、“重組枯草桿菌蛋白酶”或“重組蛋白酶”指枯草桿菌蛋白酶或蛋白酶，其中對編碼枯草桿菌蛋白酶或蛋白酶的DNA序列進(jìn)行了修飾以產(chǎn)生變體(或突變的)DNA序列，該序列編碼天然存在的氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代、缺失或插入。產(chǎn)生這些修飾的適當(dāng)方法并可與那些在此處公開的組合的方法包括那些公開于美國專利4,760,025(US RE 34,606)、美國專利5,204,015和美國專利5,185,258中的。
“非人的枯草桿菌蛋白酶”和編碼它的DNA可從許多原核和真核生物中獲得。原核生物的適當(dāng)例子包括革蘭氏陰性生物如大腸桿菌(E.coli)或假單胞菌屬(Pseudomonas)和革蘭氏陽性細(xì)菌如微球菌屬(Micrococcus)或芽孢桿菌屬(Bacillus)。從其中可獲得枯草桿菌蛋白酶及其基因的真核生物的例子包括酵母如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、真菌如曲霉屬物種(Aspergillussp.)。
“人枯草桿菌蛋白酶”指具有枯草桿菌蛋白酶類型的催化活性的人來源的蛋白質(zhì)，如源自人的蛋白酶的kexin家族。此外，在此處提供的蛋白質(zhì)的衍生物或同系物與目標(biāo)蛋白酶具有至少50％的、至少65％的和優(yōu)選地至少80％的、更優(yōu)選地至少90％的，及有時(shí)多達(dá)95％、97％或甚至99％的同源性，其中該衍生物或同系物包括那些來自非人的來源如小鼠或兔子的，它們保留了肽的基本活性如水解肽鍵的能力并展示如在本發(fā)明其他地方描述的改變的免疫原性反應(yīng)等。該同系物的基本活性包括在人中產(chǎn)生不同的免疫原性反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)蛋白酶在圖4a中顯示。
此處所用的氨基酸位置號碼指那些分配給在圖1中提供的成熟解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶序列的。然而，本發(fā)明不局限于該特定枯草桿菌蛋白酶的突變，而是延伸到在“相當(dāng)于”解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中特別鑒定的殘基的位置含有氨基酸殘基的前體蛋白酶。例如，當(dāng)前體蛋白酶是遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶時(shí)，替代、缺失和/或插入可在相應(yīng)于那些上面所列的遲緩芽孢桿菌中的相當(dāng)?shù)陌被釟埢线M(jìn)行。
如果前體蛋白酶的殘基(氨基酸)與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的特定殘基或該殘基的部分是同源的(即在一級或三級結(jié)構(gòu)的位置中是相應(yīng)的)或相似的，那么該殘基相當(dāng)于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的殘基(即具有相同或相似的結(jié)合、反應(yīng)或化學(xué)相互作用的功能能力)。如在此處所用的“相應(yīng)的”通常指肽上的相似位置。
為了確立一級結(jié)構(gòu)的同源性，將前體蛋白酶的氨基酸序列直接與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的一級序列進(jìn)行比較，并具體而言地與其序列已知的枯草桿菌蛋白酶中已知不變的一套殘基進(jìn)行比較。例如，此處圖2表示在解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶和遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶之間保守的殘基。在將保守的殘基進(jìn)行比對之后，并為了維持比對而允許必要的插入和缺失(即避免通過任意的缺失和插入而消除保守的殘基)，限定了與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶一級序列中特定的氨基酸相當(dāng)?shù)臍埢?。保守的殘基的比對?yōu)選地應(yīng)保存100％的這種殘基。然而大于75％的或低至50％的保守殘基的比對也足以限定相當(dāng)?shù)臍埢?。催化三?lián)體Asp32/His64/Ser221的保守性應(yīng)該得到維持。
例如，將來自解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌(carlsbergensis)和遲緩芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶的氨基酸序列進(jìn)行比對以提供氨基酸序列間最大量的同源性。這些序列之間的比較顯示在每一序列中含有一些保守殘基。在BPN’和遲緩芽孢桿菌之間的保守殘基在圖2中進(jìn)行鑒定。
因而，這些保守的殘基可用于限定其他枯草桿菌蛋白酶中解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的相應(yīng)的相當(dāng)氨基酸殘基，如來自遲緩芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶(于1989年7月13日發(fā)表的PCTPublication No.WO 89/06279)、此處優(yōu)選的蛋白酶前體酶或稱為PB92的枯草桿菌蛋白酶(EP 0 328 299)，后者與優(yōu)選的遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶高度同源。將這些枯草桿菌蛋白酶的某些的氨基酸序列與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的序列在圖3A和3B中進(jìn)行比對以產(chǎn)生保守殘基的最大同源性。如可看到的，與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶相比在遲緩芽孢桿菌的序列中有一些缺失。因而，例如解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中Val165在其他枯草桿菌蛋白酶中的相當(dāng)氨基酸對于遲緩芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌為異亮氨酸。
因而，例如在位置+170的氨基酸在解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶中為賴氨酸(K)，而在灑維奈斯(Savinase)中為精氨酸(R)。然而，在本發(fā)明的蛋白酶變體的一個(gè)實(shí)施方案中，與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中+170相當(dāng)?shù)陌被崾怯锰於彼?D)替代的。本發(fā)明中所有氨基酸的縮寫和單字母密碼與PatentIn User Manual(GenBank，Mountain View，CA)1990，p.101一致。
同源序列也可用“序列比較算法”進(jìn)行確定。對于要比較的序列的最適比對可通過以下算法進(jìn)行，如Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部同源性算法、Needleman &Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)的同源性比對算法、Pearson & Lipman，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 852444(1988)的相似性搜索方法、這些算法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行(WisconsinGenetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)，或者肉眼觀察。
適合于確定序列相似性的算法的例子為BLAST算法，該算法描述于Altschul等人，J.Mol.Biol.215403-410(1990)。進(jìn)行BLAST分析的軟件通過國家生物技術(shù)信息中心(National Centerfor Biotechnology Information)(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公共地獲得。該算法包含通過鑒定查詢序列中長度W的短字串來首先鑒定高得分序列對(HSPs)，該短字串當(dāng)與數(shù)據(jù)庫中相同長度的字串進(jìn)行比對時(shí)匹配或者滿足一些正值的閾分?jǐn)?shù)T。這些最初的鄰近字串命中值(hit)充當(dāng)起始點(diǎn)以找到含有它們的更長的HSPs。將該字串命中值在兩個(gè)方向上延著進(jìn)行比較的兩個(gè)序列的每一個(gè)延伸，前提是累積的比對值增加。字串命中值的延伸在下面情況時(shí)停止累積比對分?jǐn)?shù)從最大值以量X降低；累積分?jǐn)?shù)達(dá)到0或更低；或者到達(dá)了任一個(gè)序列的末端。BLAST算法的參數(shù)W、T和X確定比對的靈敏度和速度。BLAST算法缺省使用的字長(W)為11、BLOSUM62得分矩陣(參見Henikoff & Henikoff，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 8910915(1989))比對(B)為50、期望(E)為10、M’5、N’-4和對兩條鏈的比較。
BLAST算法然后進(jìn)行了兩個(gè)序列間相似性的統(tǒng)計(jì)分析(參見如Karlin & Altschul，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 905873-5787(1993))。由BLAST算法提供的一種對相似性的測量是最小總和概率(smallest sum probability)(P(N))，這提供了兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列間可偶然發(fā)生匹配的概率的指示。例如，如果在對檢驗(yàn)的氨基酸序列與蛋白質(zhì)如蛋白酶氨基酸序列之間的比較的最小總和概率小于約0.1，更優(yōu)選地小于約0.01且最優(yōu)選地小于約0.001，那么則認(rèn)為該氨基酸序列與蛋白質(zhì)如蛋白酶相似。
“相當(dāng)?shù)臍埢币部赏ㄟ^確定前體蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)水平的同源性來定義，該前體蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)已由X-射線晶體學(xué)進(jìn)行確定。相當(dāng)?shù)臍埢x為那些前體蛋白質(zhì)(如蛋白酶和解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶)的特定的氨基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)主鏈原子的原子坐標(biāo)(N在N上、CA在CA上、C在C上和O在O上)在比對后在0.13nm內(nèi)且優(yōu)選地在0.1nm內(nèi)。比對是在對最好的模型進(jìn)行定向及定位以給出蛋白質(zhì)(如被討論的蛋白酶)與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的非氫蛋白質(zhì)原子的原子坐標(biāo)的最大重疊之后實(shí)現(xiàn)的。最好的模型是晶體學(xué)模型，該模型在可獲得的最高分辨率上給出了實(shí)驗(yàn)衍射數(shù)據(jù)的最低的R因子。
將與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的特定殘基功能上相似的相當(dāng)?shù)臍埢x為那些前體蛋白質(zhì)(如蛋白酶)的氨基酸，該蛋白質(zhì)可采用一種構(gòu)象，從而它們可以以限定的方式改變、修飾或有助于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、底物結(jié)合或催化，及有助于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的特定殘基。進(jìn)一步地，它們?yōu)槟切┣绑w蛋白質(zhì)的殘基，例如以這樣的程度占據(jù)相似位置的蛋白酶(已通過x-射線晶體學(xué)獲得了該蛋白酶的三級結(jié)構(gòu))，即盡管給定殘基的主鏈原子不滿足在占據(jù)同源位置基礎(chǔ)上的等值標(biāo)準(zhǔn)，殘基的至少兩個(gè)側(cè)鏈原子的原子坐標(biāo)位于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的相應(yīng)側(cè)鏈原子的0.13nm內(nèi)。解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)在EPO Publication No.0 251 446(相當(dāng)于美國專利5,182,204，將其公開內(nèi)容在此處引用作為參考)中提出，并可如上面所描述的用于確定三級結(jié)構(gòu)水平上的相當(dāng)殘基。
“衍生物”指通過以下方式源自前體蛋白質(zhì)(如天然蛋白質(zhì))的蛋白質(zhì)在C-和N-末端中的一個(gè)或兩者添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸、在氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)不同位點(diǎn)進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代、在蛋白質(zhì)末端的一個(gè)或兩者或者在氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸、或者在氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸。蛋白酶衍生物的制備優(yōu)選地是通過修飾編碼天然蛋白質(zhì)的DNA序列、將該DNA序列轉(zhuǎn)化入適當(dāng)?shù)乃拗骷笆剐揎椀腄NA序列表達(dá)以形成衍生物蛋白酶而實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明的衍生物包括與前體氨基酸序列(如野生型和天然狀態(tài)的蛋白酶)相比包含改變的氨基酸序列的肽，該肽保留了前體蛋白酶的特征性的蛋白酶特性，但在一些特定的方面具有改變的性質(zhì)。例如，蛋白酶衍生物可具有增加的pH最適值或增加的溫度或氧化穩(wěn)定性，但將保留其特征性的底物活性。相似地，根據(jù)本發(fā)明的衍生物包括鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域已以這樣一種方式進(jìn)行了添加、去除或修飾，從而顯著地消弱或增強(qiáng)其鈣結(jié)合活性。相似地，可將催化性蛋白水解結(jié)構(gòu)域進(jìn)行添加、去除或修飾以與蛋白酶一起進(jìn)行操作。預(yù)期根據(jù)本發(fā)明的衍生物可源自編碼蛋白酶衍生物的DNA片段，其中保留了表達(dá)的蛋白酶衍生物的功能活性。對前體DNA序列的這種修飾的適當(dāng)方法包括在此處公開的方法，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法(參見如EP 0 328299，WO89/06279和在此處參考的美國專利及申請)。一些為了替代、插入或缺失而鑒定的殘基是保守的，而其他的不是。
這種修飾優(yōu)選地是對編碼前體酶的氨基酸序列的“前體DNA序列”進(jìn)行的，但也可通過對前體蛋白質(zhì)進(jìn)行操作的。前體DNA序列的例子包括但不局限于BPN’和BPN’-Y217L。在殘基不是保守的情況下，一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代局限于產(chǎn)生變體的替代，其中該變體具有與天然發(fā)現(xiàn)的不相應(yīng)的氨基酸序列。在保守殘基的情況下，這種替代不應(yīng)導(dǎo)致天然存在的序列。衍生物進(jìn)一步包括改變蛋白酶特征的化學(xué)修飾。
因而在兩個(gè)核酸或多肽的情況下短語“基本相同的”一般指多核苷酸或多肽包含用上述程序(如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)和用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)與參考序列相比具有至少60％的序列一致性、優(yōu)選地為至少80％的、更優(yōu)選地為至少90％、仍然更優(yōu)選地為95％及有時(shí)高達(dá)97％的序列。兩個(gè)多肽基本相同的一個(gè)指示是第一個(gè)多肽與第二個(gè)多肽具有免疫學(xué)的交叉反應(yīng)。一般地，區(qū)別在于保守的氨基酸替代的多肽是免疫學(xué)交叉反應(yīng)的。因而，例如當(dāng)多肽與第二個(gè)多肽僅僅區(qū)別在于保守的替代時(shí)，那么這兩個(gè)多肽是基本相同的。兩個(gè)核酸序列基本相同的另一個(gè)指示是兩個(gè)分子在嚴(yán)格性條件下相互雜交(如在中等到高度嚴(yán)格性的范圍內(nèi))。
“雜交”包括核酸鏈與互補(bǔ)核酸鏈通過堿基配對而結(jié)合的任何過程。因而，嚴(yán)格地說，該術(shù)語指目標(biāo)序列的互補(bǔ)體結(jié)合檢驗(yàn)序列的能力，反之亦然。
“雜交條件”一般通過測量雜交的條件的“嚴(yán)格性”程度進(jìn)行分類。例如，嚴(yán)格性程度可基于核酸結(jié)合復(fù)合物或探針的熔解溫度(Tm)。例如，“最大嚴(yán)格性”一般發(fā)生于約Tm-5℃(比探針的Tm低5℃)；“高度嚴(yán)格性”為比Tm低約5-10℃；“中等嚴(yán)格性”為比探針的Tm低約10-20℃；且“低嚴(yán)格性”為比Tm低約20-25℃?？蛇x擇地或者另外地，雜交條件可基于雜交的鹽或離子強(qiáng)度條件和/或一種或多種嚴(yán)格性洗滌。例如，6×SSC＝非常低的嚴(yán)格性；3×SSC＝低到中等的嚴(yán)格性；1×SSC＝中等嚴(yán)格性；和0.5×SSC＝高度嚴(yán)格性。功能性地，可將最大嚴(yán)格性條件用于鑒定與雜交探針具有嚴(yán)格一致性或接近嚴(yán)格一致性的核酸序列；而將高的嚴(yán)格性條件用于鑒定與探針具有約80％或更多序列一致性的核酸序列。
具有改變的抗原決定部位的變體蛋白酶可用于獲得寡核苷酸序列，或者長度約為10-30個(gè)核苷酸的引物可從多核苷酸序列設(shè)計(jì)得來，例如那些在圖6中公開的，并將其用于PCR技術(shù)中以從基因組序列中分離天然存在的序列或變體。
“克隆”枯草芽孢桿菌基因組DNA片段以進(jìn)行測序的另一個(gè)一般的策略是使用反向PCR。對已知的區(qū)域進(jìn)行掃描以得到一套適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈钗稽c(diǎn)，并用一套從最外面的DNA序列確定的DNA引物來進(jìn)行反向PCR。將來自反向PCR的DNA片段直接用作測序反應(yīng)的模板。新導(dǎo)出的序列可用于設(shè)計(jì)新的寡核苷酸。將這些新寡核苷酸用于擴(kuò)增DNA片段，其以基因組DNA作為模板。DNA區(qū)域中兩個(gè)鏈的序列確定是通過在基因組PCR片段上應(yīng)用引物步移策略來完成的。引物步移中多個(gè)起始點(diǎn)的益處來自具有不同大小的新“克隆的”DNA片段的一系列反向PCR片段。從最外面的DNA序列起始了新一輪的反向PCR。整個(gè)的反向PCR策略是基于常規(guī)taq聚合酶的連續(xù)使用和在那些taq聚合酶未能擴(kuò)增DNA片段的情況下長范圍反向PCR的使用的。核酸測序是用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行的。核酸測序的一個(gè)方法包括根據(jù)生產(chǎn)商的說明書使用Perkin-Elmer Applied Biosystems 373 DNA測序儀(Perkin-Elmer，F(xiàn)oster City，California)。
源自基因組DNA的核酸序列在編碼區(qū)之外可含有調(diào)節(jié)區(qū)。不論什么來源，都應(yīng)該將分離的MP基因克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中以使該基因增殖。
在對來自基因組DNA的基因的分子克隆中，生成了DNA片段，一些該片段編碼想要的基因。該DNA可用多種限制酶在特定的位點(diǎn)進(jìn)行切割?？蛇x擇地，人們可在錳存在時(shí)用DNAse使DNA片段化，或者該DNA可如通過超聲處理以進(jìn)行物理剪切。然后可根據(jù)大小用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將線形DNA片段進(jìn)行分離，該標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括但不局限于瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳和柱層析。
一旦生成了DNA片段，對含有改變的抗原決定部位序列的特定DNA的鑒定可通過許多途徑來完成。例如，可將本發(fā)明枯草芽孢桿菌基因的改變的抗原決定部位的寡聚體或其特定的RNA或其片段(例如探針和引物)進(jìn)行分離和標(biāo)記，并然后用于雜交測定以探測具有改變的免疫原性反應(yīng)的抗原決定部位序列。(Benton，W.和Davis，R.，1977，Science196180；Grunstein，M和Hogness，D.，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.USA723961)。那些共享與探針相似的基本序列的DNA片段將在嚴(yán)格性條件下進(jìn)行雜交。
因此，本發(fā)明提供了探測改變的免疫原性多核苷酸同系物的方法，該方法包含使基因組或者cDNA來源的枯草芽孢桿菌抗原決定部位的核酸序列的部分或全部進(jìn)行雜交。
在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)中實(shí)現(xiàn)的擴(kuò)增方法描述于Dieffenbach，CW和GS Dveksler，(PCR Primer，a LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press，Plainview，NY，1995)。來自枯草芽孢桿菌MP的至少約10個(gè)核苷酸及多達(dá)約60個(gè)核苷酸的核酸序列(優(yōu)選地為約12～30個(gè)核苷酸且更優(yōu)選地為約20～25個(gè)核苷酸)可用作探針或PCR引物。
對于需要高選擇性的應(yīng)用，人們一般想要采用相對嚴(yán)格的條件來形成雜交體，如人們將選擇相對低的鹽和/或高的溫度條件。雜交條件(包括中等嚴(yán)格性和高度嚴(yán)格性)由Sambrook等人提供，此處引用該文獻(xiàn)作為參考。
本發(fā)明包含具有改變的免疫原性的蛋白酶，該蛋白酶與那些源自提到的特定的微生物品系的相當(dāng)。作為“相當(dāng)?shù)摹?，在這個(gè)情況下指該蛋白酶是由能夠與具有在圖1A-1C中任何一個(gè)所示的序列的多核苷酸在中等到高度嚴(yán)格性下雜交并仍然保留對T-細(xì)胞的改變的免疫原性反應(yīng)的多核苷酸編碼。相當(dāng)?shù)氖侵冈摰鞍酌概c抗原決定部位序列和具有這種抗原決定部位(如具有在本申請的其他地方描述的修飾的并且在圖4a中公開的氨基酸序列)的變體蛋白酶包含至少55％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的一致性。
“雜交蛋白酶”或“融合蛋白酶”為從至少兩個(gè)不同的或“親代”蛋白質(zhì)進(jìn)行加工得到的蛋白質(zhì)，它們優(yōu)選地相互為同系物。例如，優(yōu)選的雜交蛋白酶或融合蛋白質(zhì)可具有蛋白質(zhì)的N-末端和蛋白質(zhì)同系物的C-末端。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可將兩個(gè)末端組合以相應(yīng)于全長的活性蛋白質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，同系物共享基本的相似性，但不具有相同的T-細(xì)胞抗原決定部位。因此，例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，在C-末端具有一個(gè)或多個(gè)T-細(xì)胞抗原決定部位的目標(biāo)蛋白酶可具有用同系物的C-末端替代的C-末端，該同系物的C-末端具有較不有力的T-細(xì)胞抗原決定部位、較少的T-細(xì)胞抗原決定部位或在C-末端不具有T-細(xì)胞抗原決定部位。因而，技術(shù)人員理解通過能夠在同系物中鑒定T-細(xì)胞抗原決定部位，可形成多種產(chǎn)生不同免疫原性反應(yīng)的變體。此外，可理解的是可將內(nèi)部部分和多于一個(gè)的同系物用于產(chǎn)生本發(fā)明的變體。
本發(fā)明者考慮的雜交例子包括用確立的蛋白質(zhì)工程技術(shù)構(gòu)建的蛋白酶雜交體。該雜交體是這樣構(gòu)建的，即將蛋白質(zhì)的高變應(yīng)原的氨基酸序列用來自較低變應(yīng)原的同系物的相應(yīng)序列進(jìn)行替代。在這個(gè)例子中，蛋白酶的前122個(gè)氨基酸源自GG36，且剩余的氨基酸序列源自BPN’。
本發(fā)明的變體包括蛋白質(zhì)變體的成熟形式以及這種蛋白質(zhì)變體的前體(pro-)或前體原(prepro-)形式。前體原形式是優(yōu)選的構(gòu)建形式，這是因?yàn)樗龠M(jìn)了蛋白質(zhì)變體的表達(dá)、分泌和成熟。
“前序列”指結(jié)合到蛋白質(zhì)成熟形式的N-末端的氨基酸序列，當(dāng)該序列去除時(shí)導(dǎo)致蛋白質(zhì)“成熟”形式的出現(xiàn)。在自然中發(fā)現(xiàn)有許多蛋白水解酶作為翻譯的酶原產(chǎn)物存在，并在翻譯后不存在加工時(shí)以這種方式表達(dá)。產(chǎn)生蛋白質(zhì)變體如蛋白酶變體的優(yōu)選的前序列為解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的推定的前序列，盡管可用到其他的前序列。
“信號序列”或“前序列”指任何結(jié)合到蛋白質(zhì)的N-末端部分或原蛋白質(zhì)(proprotein)的N-末端部分的序列，該序列可參與蛋白質(zhì)的成熟或前體形式的分泌。信號序列的這個(gè)定義是功能性的，指包括所有那些由在天然條件下參與蛋白質(zhì)分泌的完成的蛋白質(zhì)基因的N-末端部分編碼的氨基酸序列。本發(fā)明利用這種序列以實(shí)現(xiàn)如在此處所定義的蛋白質(zhì)變體的分泌。一個(gè)可能的信號序列包含與來自遲緩芽孢桿菌(ATCC 21536)枯草桿菌蛋白酶的信號序列的剩余部分融合的來自枯草芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的信號序列的前7個(gè)氨基酸殘基。
蛋白質(zhì)變體的“前體原”形式由具有可操作地連接到蛋白質(zhì)的氨基末端的前序列的蛋白質(zhì)的成熟形式和可操作地連接到前序列的氨基末端的“前體”或“信號”序列組成。
“表達(dá)載體”指含有可操作地連接到適當(dāng)?shù)目刂菩蛄械腄NA序列的DNA構(gòu)建體，該控制序列能夠?qū)崿F(xiàn)該DNA在適當(dāng)?shù)乃拗髦械谋磉_(dá)。這種控制序列包括實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的啟動子、控制這種轉(zhuǎn)錄的可選擇的操縱基因序列、編碼適當(dāng)?shù)膍RNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。該載體可為質(zhì)粒、噬菌體顆?；蛑皇且粋€(gè)潛在的基因組插入物。一旦轉(zhuǎn)化入適當(dāng)?shù)乃拗髦?，該載體可獨(dú)立于宿主基因組復(fù)制并發(fā)揮功能，或者在一些情況下整合入基因組自身中。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”有時(shí)是互換使用的，這是因?yàn)橘|(zhì)粒是目前最常用的載體形式。然而，本發(fā)明想要包括其他形式的表達(dá)載體，該載體發(fā)揮相當(dāng)?shù)墓δ芮沂腔蛘咦優(yōu)楸绢I(lǐng)域公知的。
本發(fā)明中所用的“宿主細(xì)胞”一般是原核或真核宿主，優(yōu)選地已對這些宿主用在美國專利4,760,025(RE 34,606)中公開的方法進(jìn)行處理以使得其不能夠分泌酶活性的內(nèi)切蛋白酶。表達(dá)蛋白質(zhì)的優(yōu)選的宿主是芽孢桿菌屬品系BG2036，該品系缺失酶活性的中性蛋白質(zhì)和堿性蛋白酶(枯草桿菌蛋白酶)。品系BG2036的構(gòu)建詳細(xì)描述于美國專利5,264,366。表達(dá)蛋白質(zhì)的其他宿主細(xì)胞包括枯草芽孢桿菌I168(同樣描述于美國專利4,760,025(RE 34,606)和美國專利5,264,366，將其公開內(nèi)容在此處引用作為參考)，以及任何適當(dāng)?shù)难挎邨U菌屬品系如地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌等。
宿主細(xì)胞是用以重組DNA技術(shù)構(gòu)建的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的。這些技術(shù)可發(fā)現(xiàn)于任何分子生物學(xué)實(shí)踐指南中，如Sambrook等人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(2nded.)Vol.1-3，Cold Spring Harbor Publishing(1989)(“Sambrook”)；和Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人(eds.)，Current Protocols，a joint venture between GreenePublishing Associates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.，(1997補(bǔ)充本)(“Ausubel”)。這種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞能夠復(fù)制編碼蛋白質(zhì)變體的載體或表達(dá)想要的蛋白質(zhì)變體。在編碼蛋白質(zhì)變體的前體或前體原形式的載體的情況下，這種變體當(dāng)表達(dá)時(shí)一般從宿主細(xì)胞分泌到宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中。
術(shù)語“可操作地連接的”當(dāng)描述兩個(gè)DNA區(qū)域間的關(guān)系時(shí)簡單地指它們相互功能上相關(guān)。例如，前序列是可操作地連接到肽的，如果它發(fā)揮信號序列的功能，參與蛋白質(zhì)成熟形式的分泌，并且最可能的是信號序列的切割。啟動子如果其控制序列的轉(zhuǎn)錄則是可操作地連接到編碼序列的；核糖體結(jié)合位點(diǎn)如果其以允許翻譯的方式則是可操作地連接到編碼序列的。
編碼天然存在的前體蛋白質(zhì)的基因可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一般方法獲得。該方法一般包含合成標(biāo)記的具有目標(biāo)蛋白質(zhì)推定的序列編碼區(qū)的探針，從表達(dá)該蛋白質(zhì)的生物中制備基因組文庫，及通過與探針的雜交篩選目標(biāo)基因的文庫。然后對陽性雜交克隆進(jìn)行作圖和測序。
將蛋白質(zhì)基因連接到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)質(zhì)粒中。然后將克隆的蛋白質(zhì)基因用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞以表達(dá)該蛋白質(zhì)基因。該質(zhì)粒在它含有質(zhì)粒復(fù)制所必需的眾所周知的元件的意義上可在宿主中復(fù)制或該質(zhì)粒可設(shè)計(jì)為整合入宿主染色體。將提供必需的元件以進(jìn)行有效的基因表達(dá)，如可操作地連接到正被討論的基因上的啟動子(該啟動子如果被宿主識別即轉(zhuǎn)錄，則可作為基因自身的同源啟動子來提供)、外源的或由蛋白質(zhì)基因的內(nèi)源終止子區(qū)域提供的翻譯終止子(真核宿主細(xì)胞的多腺苷酸化區(qū)域)和想要的選擇基因如抗生素抗性基因，該基因使得能夠通過在含有抗生素的培養(yǎng)基生長而連續(xù)地對質(zhì)粒感染的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)維持。
在一個(gè)實(shí)施方案中，基因可為如來自遲緩芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌的天然基因?？蛇x擇地，可產(chǎn)生編碼天然存在的或突變的前體蛋白質(zhì)的合成基因。在這樣一種方法中，確定了前體蛋白質(zhì)的DNA和/或氨基酸序列。其后合成了多個(gè)重疊的合成單鏈DNA片段，該片段在雜交和連接時(shí)產(chǎn)生了編碼前體蛋白質(zhì)的合成DNA。合成基因構(gòu)建的一個(gè)例子是在美國專利5,204,015的實(shí)施例3中闡明的，此處將其公開內(nèi)容引用作為參考。
一旦已克隆了天然存在的或合成的前體蛋白質(zhì)基因，則在合成該天然存在的蛋白質(zhì)之外再進(jìn)行一些修飾以增強(qiáng)該基因的用途。這種修飾包括如在美國專利4,760,025(RE 34,606)和EPOPublication No.0 251 446中公開的重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)和在此處描述的蛋白質(zhì)變體的生產(chǎn)。
蛋白質(zhì)變體可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的多種不同的誘變技術(shù)來制備。這些技術(shù)可發(fā)現(xiàn)于任何分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室手冊中，如Sambrook等人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(2nded.)，Cold Spring Harbor或Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel等人，Green Publishing Associates Inc.andJohn Wiley & Sons。誘變試劑盒也可從許多商業(yè)分子生物學(xué)供應(yīng)商購得。在限定的氨基酸進(jìn)行特定的替代(定點(diǎn)的)、在基因的局部區(qū)域進(jìn)行特異性的或隨機(jī)的突變(區(qū)域特異性的)或者在整個(gè)基因上進(jìn)行隨機(jī)誘變(飽和誘變)的方法是可用的。用PCR對單鏈或雙鏈DNA的定點(diǎn)誘變、盒式誘變、基因合成、出錯(cuò)PCR和化學(xué)飽和誘變都是人們可用于生成想要的蛋白質(zhì)變體的技術(shù)。在產(chǎn)生了變體之后，可對它們篩選想要的性質(zhì)(改變的，如高的或增加的；或者低的或減少的免疫原性反應(yīng)，增加的熱或堿穩(wěn)定性等)。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，目的是得到具有與前體蛋白質(zhì)相比改變的免疫原性反應(yīng)潛力的變體蛋白質(zhì)。盡管目前的發(fā)明對于降低免疫原性反應(yīng)是有用的，但在此處詳細(xì)說明的突變可以與本領(lǐng)域公知的突變結(jié)合以導(dǎo)致與前體相比改變的熱穩(wěn)定性和/或改變的底物特異性、修飾的活性、改進(jìn)的特定活性或改變的堿穩(wěn)定性。
因此，本發(fā)明涉及改變T-細(xì)胞抗原決定部位能力以誘導(dǎo)T-細(xì)胞增殖，該抗原決定部位包括解淀粉芽孢桿菌的殘基位置109-123。此外，本發(fā)明涉及改變T-細(xì)胞抗原決定部位能力以誘導(dǎo)T-細(xì)胞增殖，該抗原決定部位包括解淀粉芽孢桿菌的殘基位置70-84。本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包含在位置79和122之一或兩者進(jìn)行修飾。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包含在位置76和122之一或兩者進(jìn)行修飾。另外一個(gè)實(shí)施方案包含在位置76、79和122的修飾。與目前在相應(yīng)于氨基酸殘基109-123和/或70-84的區(qū)域公開的突變結(jié)合，本發(fā)明進(jìn)一步涉及在位置76的突變(如替代)，可選擇地與選自相應(yīng)于3、31、40、41、111、147、218、206和/或217的位置的一個(gè)或多個(gè)替代結(jié)合。
本發(fā)明的實(shí)施方案涉及替代的殘基的組合，該殘基相應(yīng)于位置79-122-217、76-122-217和76-79-122-217，可選擇地與目標(biāo)蛋白酶中的一個(gè)或多個(gè)替代組合，該替代相當(dāng)于那些選自相應(yīng)于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的3、76、31、40、41、111、147、218、206和/或217的位置。其他的實(shí)施方案包括在該目標(biāo)蛋白酶中的一個(gè)或多個(gè)位置的進(jìn)一步的額外替代組合，該替代相當(dāng)于那些選自解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的216、181、101、215、216、217、46、154、128、182、101、104、107、250、254、258、50、47、48、182、183、185、248和262。除降低本發(fā)明的變體蛋白質(zhì)的變應(yīng)原性潛力之外，這種突變可用于調(diào)節(jié)酶的總體穩(wěn)定性和/或蛋白水解活性。
更具體而言地，特定的替代包括N76D、I79T、I79A、I122A和其保守替代。本發(fā)明的其他實(shí)施方案涉及替代的殘基的特定組合，該殘基相應(yīng)于位置I79A-I122A-Y217L、N76D-I122A-Y217L和N76D-I79A-I122A-Y217L，可選擇地連同下面替代的一個(gè)或多個(gè)一起S3T；N76D；I31L；P40Q；D41A；I111V；V147P，I；N218S；Q206L和/或L217M。可選擇地，包括在一個(gè)或多個(gè)位置上的進(jìn)一步替代，其相應(yīng)于下面位置A216K、D181G、S101V、G215A、A216E、Y217S、R247Y、R247S、R247Q、G46S、S101Q、S154G、G128S、S182T、S101R、Y104W、I107V、L250G、T254G、T254A、G258S、M50A、G47S、A48G、S182R、S183R、Q185A、S101R、S248G和Y262F。
由本發(fā)明者考慮的組合包括但不局限于BPN’-Y217L/I79A；BPN’-Y217L/I79A/I122A；BPN’-Y217L/N76D/I122A；BPN’-Y217L/N76D/I79A/I122A和BPN’-Y217L/N76D。由本發(fā)明者考慮的額外組合包括但不局限于N76D/I79A/I122A/N218S；N76D/I79A/I122A/Q206L；N76D/I79A/I122A/Q206L/N218S；I79A/I122A/Q206L；I79A/I122A/N218S；I79A/I122A/P40Q；I79A/I122A/D41A和I79A/I122A/H238Y。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些最后的組合是在BPN’-Y217L目標(biāo)蛋白酶中進(jìn)行的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)建了額外的組合P1-N76D/I79A/I122A/A216K；P1-N76D/I79A/I122A/D181G；P1-N76D/I79A/I122A/S101V；P1-N76D/I79A/I122A/G215A；P1-N76D/I79A/I122A/A216E；P1-N76D/I79A/I122A/L217S；P1-N76D/I79A/I122A/R247Y；P1-N76D/I79A/I122A/R247S；P1-N76D/I79A/I122A/R247Q；P1-N76D/I79A/I122A/G46S；P1-N76D/I79A/I122A/S101Q/S154G；P1-N76D/I79A/I122A/G128S；P1-N76D/I79A/I122A/S182T；P1-N76D/I79A/I122A/S101R；P1-N76D/I79A/I122A/Y104W/I107V；P1-N76D/I79A/I122A/L250G；P1-N76D/I79A/I122A/T254G；P1-N76D/I79A/I122A/T254A；P1-N76D/I79A/I122A/G258S；P1-N76D/I79A/I122A/M50A；P1-N76D/I79A/I122A/G47S；P1-N76D/I79A/I122A/A48G；P1-N76D/I79A/I122A/S182R；P1-N76D/I79A/I122A/S183R；P1-N76D/I79A/I122A/Q185A；P1-N76D/I79A/I122A/S101R/I107V；P1-N76D/I79A/I122A/S248G和P1-N76D/I79A/I122A/Y262F，P1為BPN’-Y217L。
本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案包括下面相應(yīng)于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的位置N76D-I122A-Y217L的替代殘基的特定組合。這些替代優(yōu)選地是在解淀粉芽孢桿菌(重組型或天然類型的)枯草桿菌蛋白酶中進(jìn)行的，盡管該替代可在任何芽孢桿菌屬蛋白質(zhì)中進(jìn)行。
基于用變體蛋白質(zhì)獲得的篩選結(jié)果，在解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中的上述突變對于這些酶的蛋白水解活性、性能和/或穩(wěn)定性和清潔或洗滌性能以及這些變體酶的其他應(yīng)用是重要的。
除上述的點(diǎn)突變之外，使兩個(gè)同源蛋白質(zhì)融合也可消除T-細(xì)胞抗原決定部位。如在下面例示的，T-細(xì)胞抗原決定部位殘基所在的蛋白質(zhì)區(qū)域可由不具有T-細(xì)胞抗原決定部位的同源蛋白質(zhì)的相同區(qū)域替代。在下面的范例中，融合蛋白質(zhì)是用遲緩芽孢桿菌的蛋白酶及其解淀粉芽孢桿菌同系物來生成的，從而結(jié)果所得的蛋白質(zhì)不具有存在于親代遲緩芽孢桿菌蛋白酶中的T-細(xì)胞抗原決定部位。從僅僅抗原決定部位到蛋白質(zhì)的大部分的任何長度都可融合到親代蛋白質(zhì)中，只要維持了想要的活性。然而，不必要維持初始水平的活性。由于蛋白質(zhì)降低的變應(yīng)原性，可能的是使用比親代蛋白質(zhì)多的雜交蛋白質(zhì)以達(dá)到相同的活性水平。
可對變體蛋白酶的活性進(jìn)行確定并將其與目標(biāo)蛋白酶通過檢查蛋白酶與多種商業(yè)底物的相互作用而進(jìn)行比較，該底物包括但不局限于酪蛋白、角蛋白、彈性蛋白、膠原蛋白。蛋白酶活性可通過那些本領(lǐng)域公知的分析進(jìn)行確定。確定蛋白酶活性的示范性測定包括但不局限于琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-對硝基酰苯胺(paranitroanilide)(SAAPFpNA)測定(Delmar，E.G.等人，Anal.Biochem.94(1979)316-320；Achtstetter，Arch.Biochem.Biophys207445-54(1981))；和2，4，6-三硝基苯磺酸鈉鹽(TNBS)測定。在SAAPFpNA測定中，蛋白酶在肽和對硝基酰苯胺之間切割鍵以得到肉眼可見的在405nm有吸收的黃色。在TNBS顏色反應(yīng)方法中，測量底物酶促水解為含有自由氨基基團(tuán)的多肽。這些氨基基團(tuán)與TNBS反應(yīng)以形成黃色復(fù)合物。因而反應(yīng)的顏色越深，則測量到越高的活性。黃色可通過本領(lǐng)域公知的多種分析儀或分光光度計(jì)進(jìn)行確定。
變體蛋白酶的其他特征可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行確定。示范性的特征包括但不局限于熱穩(wěn)定性、堿穩(wěn)定性和特定蛋白酶在多種底物或緩沖溶液或產(chǎn)物制劑中的穩(wěn)定性。
當(dāng)與在此處公開的酶穩(wěn)定性測定程序結(jié)合時(shí)，鑒定了由隨機(jī)誘變獲得的突變，該突變證明增加的或降低的堿或熱穩(wěn)定性而維持酶活性。
堿穩(wěn)定性是通過已知程序或在此處所描述的方法進(jìn)行測量的。堿穩(wěn)定性中的實(shí)質(zhì)變化是由當(dāng)與前體羰基水解酶比較時(shí)突變體的酶活性半衰期中至少約5％或更多的增加或降低(優(yōu)選地為增加)來證實(shí)的。在枯草桿菌蛋白酶的情況下，堿穩(wěn)定性可作為枯草桿菌蛋白酶在不同pH時(shí)的酶活性的函數(shù)來測量。
熱穩(wěn)定性是通過已知程序或在此處所描述的方法進(jìn)行測量的。熱穩(wěn)定性中的羰基變化是由與前體羰基水解酶相比當(dāng)暴露于相對高的溫度和中性pH時(shí)突變的催化活性半衰期中至少約5％或更多的增加或降低(優(yōu)選地為增加)來證實(shí)的。在枯草桿菌蛋白酶的情況下，熱穩(wěn)定性可通過在增高的溫度和多種pH時(shí)枯草桿菌蛋白酶的自身蛋白水解降解來測量。參見圖14和15。
本發(fā)明的許多蛋白質(zhì)變體在制備多種去污劑組合物中是有用的。許多公知的化合物是在包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)突變體的組合物中有用的適當(dāng)表面活性劑。這些包括非離子的、陰離子的、陽離子的、陰離子的或兩性離子的去污劑，如在Barry J.Anderson的US4,404,128和Jiri Flora等人的US 4,261,868中公開的。適當(dāng)?shù)娜ノ蹌┲苿┦窃诿绹鴮＠?,204,015的實(shí)施例7中描述的(在前面引用作為參考)。本領(lǐng)域熟悉不同的可用作清潔組合物的制劑。除一般的清潔組合物之外，易于理解的是本發(fā)明的蛋白質(zhì)變體可用于任何使用天然或野生型蛋白質(zhì)的目的。因而，這些變體可用于如塊狀或液體肥皂應(yīng)用、皿碟處理制劑、表面清潔應(yīng)用、隱形眼鏡清潔溶液或產(chǎn)品、肽水解、廢物處理、紡織品應(yīng)用，以及作為蛋白質(zhì)生產(chǎn)中的融合切割酶等。除降低的變應(yīng)原性之外，本發(fā)明的變體可包含在去污劑組合物中增強(qiáng)的性能(如與前體相比較的)。如在此處所用的，去污劑中增強(qiáng)的性能定義為對某些酶敏感的污染如草或血液的增加的清潔，這由標(biāo)準(zhǔn)洗滌循環(huán)后的通常估計(jì)所確定。
蛋白質(zhì)特別是本發(fā)明的蛋白酶可制備成公知的粉末狀或液體去污劑，該去污劑的濃度按重量在約0.01％～約5％的水平(優(yōu)選地在0.1％～0.5％)，且具有6.5～12.0的pH。這些去污劑清潔組合物也可包括其他的酶，如公知的蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂酶或內(nèi)切糖苷酶，以及助洗劑和穩(wěn)定劑。
蛋白質(zhì)特別是本發(fā)明的蛋白酶向常規(guī)清潔組合物中的加入不形成任何特別的使用限制。換句話說，任何適合于去污劑的溫度和pH也適合于本組合物，只要pH在上述的范圍內(nèi)，且溫度低于描述的蛋白質(zhì)的變性溫度。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可用于無去污劑的清潔組合物中，單獨(dú)使用或與助洗劑和穩(wěn)定劑組合使用。
本發(fā)明的一個(gè)方面是處理紡織品的組合物，該組合物包括本發(fā)明的變體蛋白質(zhì)。該組合物可用于處理如絲或羊毛，如在出版物如RD 216,034；EP 134,267；US 4,533,359和EP 344,259中描述的。
可根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法篩選該變體的蛋白水解活性。優(yōu)選的蛋白酶變體包括在相應(yīng)于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的76、79、122位置的多種替代。
本發(fā)明的蛋白酶當(dāng)與其前體比較時(shí)展示了修飾的免疫原性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)展示了減少的變應(yīng)原性。技術(shù)人員易于認(rèn)識到本發(fā)明的蛋白酶的使用將在很大程度上根據(jù)蛋白質(zhì)的免疫學(xué)性質(zhì)進(jìn)行確定。例如，展示減少的變應(yīng)原性的蛋白酶可用于清潔組合物中?！扒鍧嵔M合物”是可用于從底物中去除不想要的化合物的組合物，該底物如織品、皿碟、隱形眼鏡、其他固體底物、頭發(fā)(洗發(fā)精)、皮膚(肥皂和面霜)、牙齒(漱口水、牙膏)等。此處所描述的一種或多種蛋白酶變體的有效量可包括于組合物中，該組合物用于清潔多種需要去除蛋白質(zhì)污染的表面。這種清潔組合物包括清潔硬表面的去污劑組合物，形式不限(如液體和顆粒狀)；清潔織品的去污劑組合物，形式不限(如顆粒狀、液體和塊狀制劑)；皿碟洗滌組合物(形式不限)；口腔清潔組合物，形式不限(如牙粉、牙膏和漱口水制劑)和牙齒清潔組合物，形式不限(如液體、片劑)。如在此處所用的，“有效量”指達(dá)到在特定的清潔組合物中所必需的酶活性而必需的蛋白酶變體的量。這種有效量易于由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定，且基于許多因素，如所用的特定的酶變體、清潔應(yīng)用、清潔組合物的特定組成和需要液體還是干燥的(如顆粒狀、塊狀)組合物等。
此處所描述的一種或多種蛋白酶變體的有效量也可包括于應(yīng)用于角質(zhì)材料如指甲和頭發(fā)的組合物中，該組合物包括但不局限于那些用作發(fā)膠組合物、洗發(fā)精和/或頭發(fā)調(diào)理組合物的、為了頭發(fā)生長調(diào)節(jié)的目的應(yīng)用的組合物和為了治療皮脂溢、皮炎和/或頭皮屑的目的而應(yīng)用于頭發(fā)和頭皮的組合物。
此處所描述的一種或多種蛋白酶變體的有效量可包括于適合于對皮膚或頭發(fā)的局部應(yīng)用的組合物中。這些組合物可為面霜、洗劑、凝膠等形式，且可制成水組合物或可制成一種或多種油相在水連續(xù)相中的乳劑。
例如，皮膚護(hù)理組合物可包括如上所述包含T-細(xì)胞抗原決定部位的目標(biāo)蛋白酶變體，其中該變體與目標(biāo)蛋白酶區(qū)別在于具有改變的T-細(xì)胞抗原決定部位，從而該變體和該目標(biāo)蛋白酶在人中產(chǎn)生不同的免疫原性反應(yīng)。目標(biāo)蛋白酶的變體可包括選自相應(yīng)于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的76、79和122的殘基的氨基酸替代；濕潤劑；皮膚護(hù)理活性物；表面活性劑；潤膚劑；多聚增稠劑和硅氧烷。
皮膚護(hù)理活性物此處的組合物可包含按重量計(jì)為約0.1％～約20％、優(yōu)選地為約1％～約10％、更優(yōu)選地為約2％～約8％水平的皮膚護(hù)理活性物。此處所用的適當(dāng)?shù)钠つw護(hù)理活性物的非限制性例子包括維生素B3成分、泛酰醇、維生素E、維生素E乙酸鹽、視黃醇、丙酸視黃酯、棕櫚酸視黃酯、視黃酸、維生素C、可可堿、α-羥酸、法尼醇、植烷三醇(phytantriol)、水楊酸、palmityl peptapeptide-3及其混合物。
B3化合物如在此處所用的，“維生素B3化合物”指具有下面分子式的化合物 其中R是-CONH2(即煙酰胺)、-COOH(即煙酸)或-CH2OH(即nicotinyl alcohol)；其衍生物和任何前述物質(zhì)的鹽。前述的維生素B3化合物的示范性衍生物包括煙酸酯，該酯包括煙酸的非血管舒張的酯、nicotinyl氨基酸、羧酸的nicotinyl alcohol酯、煙酸N-氧化物和煙酰胺N-氧化物。
煙酸的適當(dāng)酯包括C1-C22醇、優(yōu)選地為C1-C16醇、更優(yōu)選地為C1-C6醇的煙酸酯。該醇為適當(dāng)?shù)闹辨溁蛑ф湣h(huán)狀或非環(huán)狀、飽和或不飽和的(包括芳香族的)及取代的或非取代的。該酯優(yōu)選地為非血管舒張的。如在此處所用的，“非血管舒張的”指在應(yīng)用到被試者的皮膚中之后通常不產(chǎn)生可見的臉紅反應(yīng)的酯(一般群體的大多數(shù)將不會經(jīng)歷可見的臉紅反應(yīng)，盡管這種化合物可導(dǎo)致非肉眼可見的血管舒張)。煙酸的非血管舒張酯包括生育酚煙酸酯(tocopherolnicotinate)和肌醇六煙酸酯(inositol hexanicotinate)；生育酚煙酸酯是優(yōu)選的。維生素B3化合物的更完整的描述在WO 98/22085中。優(yōu)選的維生素B3化合物是煙酰胺和生育酚煙酸酯。
類視黃醇另外適當(dāng)?shù)钠つw護(hù)理活性物是類視黃醇。如在此處所用的，“類視黃醇”包括維生素A或視黃醇樣化合物的所有具有皮膚中維生素A的生物學(xué)活性的天然和/或合成的同系物以及這些化合物的幾何異構(gòu)體和立體異構(gòu)體。當(dāng)類視黃醇包括于此處的組合物中時(shí)，該組合物一般包含約0.005％～約2％、更優(yōu)選地為0.01％～約2％的類視黃醇。視黃醇優(yōu)選地以約0.01％～約0.15％的量使用；視黃醇酯優(yōu)選地以約0.01％～約2％(如約1％)的量使用。
類視黃醇優(yōu)選地為視黃醇、視黃醇酯(如視黃醇的C2-C22烷基酯，包括棕櫚酸視黃酯、乙酸視黃酯、丙酸視黃酯)、視黃醛和/或視黃酸(包括全反式視黃酸和/或13-順式-視黃酸)，更優(yōu)選地為除視黃酸以外的類視黃醇。這些化合物是本領(lǐng)域中眾所周知的，且可從許多來源商業(yè)地購得，如Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)和Boehringer Mannheim(Indianapolis，IN)。優(yōu)選的類視黃醇是視黃醇、棕櫚酸視黃酯、乙酸視黃酯、丙酸視黃酯、視黃醛、視黃酸及其組合。更優(yōu)選的是視黃醇、丙酸視黃酯(retinoicpropionate)、視黃酸和棕櫚酸視黃酯。類視黃醇可作為基本純的材料或作為通過適當(dāng)?shù)奈锢砗?或化學(xué)分離方法從天然(如植物)來源獲得的提取物而包括在組合物中。
載體此處的組合物可包含安全和有效量的皮膚病學(xué)可接受的載體，該載體適用于對皮膚或頭發(fā)的局部應(yīng)用，在其中結(jié)合了基本材料和可選擇的其他材料以使得基本材料和可選擇的其他材料能夠以適當(dāng)?shù)臐舛人瓦f到皮膚或頭發(fā)。因而該載體可充當(dāng)該基本成分的稀釋劑、分散劑、溶劑等，這確保它們可以以適當(dāng)?shù)臐舛葢?yīng)用并均勻地分配到選擇的目標(biāo)上。
本發(fā)明中利用的載體的類型依賴于想要的組合物的產(chǎn)品形式類型。該載體可為固體的、半固體的或液體的。適當(dāng)?shù)妮d體為液體的或半固體的，如面霜、洗劑、凝膠、粘劑(sticks)、油膏、糊劑和摩絲(mousse)。優(yōu)選地該載體為洗劑、面霜或凝膠的形式，更優(yōu)選地為一種具有足夠的濃度或流動點(diǎn)以防止顆粒沉積的形式。該載體自身可為惰性的或它可具有其自身的皮膚病學(xué)益處。該載體可直接應(yīng)用于皮膚和/或頭發(fā)，或者它可通過編織的或非編織的搌布或布應(yīng)用。它也可為貼劑、面具或包裹的形式。也可將它成煙霧狀散開或噴霧到皮膚和/或頭發(fā)上。該載體也應(yīng)該為與此處描述的基本成分物理地或化學(xué)地相容的，且不應(yīng)該過度地消弱與本發(fā)明的組合物相關(guān)的穩(wěn)定性、功效或其他使用益處。
優(yōu)選的載體含有皮膚病學(xué)可接受的親水稀釋劑。適當(dāng)?shù)挠H水稀釋劑包括水、有機(jī)親水稀釋劑如C1-C4一元醇和低分子量二元醇和多元醇，這些醇包括丙二醇、聚乙二醇(如MW為200-600)、聚丙二醇(如MW為425-2025的)、甘油、丁二醇、1，2，4-丁三醇、山梨糖醇酯、1，2，6-hexametriol、乙醇、異丙醇、山梨糖醇酯、乙氧基酯、丙氧基酯及其組合。稀釋劑優(yōu)選地為液體。水是優(yōu)選的稀釋劑。組合物優(yōu)選地包含至少約20％的親水稀釋劑。
適當(dāng)?shù)妮d體也可包含含有親水相(尤其是水相)和疏水相(如脂類、油或油性材料)的乳劑。如本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，依賴于組合物的成分，親水相可分散到疏水相中或反之亦然，以分別形成親水或疏水的分散或連續(xù)相。在乳劑技術(shù)中，術(shù)語“分散相”是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的術(shù)語，指該相以懸浮于連續(xù)相或由連續(xù)相包圍的小顆粒或小滴存在。分散相也已知為內(nèi)部的或不連續(xù)的相。乳劑可為或包含(如在三相的或其它多相乳劑中)水包油乳劑或油包水乳劑如水在硅氧烷中的乳劑。水包油乳劑一般包含約1％～約60％的(優(yōu)選地為約1％～約30％的)分散疏水相和約1％～約99％的(優(yōu)選地為約40％～約90％的)連續(xù)親水相；油包水乳劑一般包含約1％～約98％的(優(yōu)選地為約40％～約90％的)分散親水相和約1％～約50％的(優(yōu)選地為約1％～約30％的)連續(xù)疏水相。
濕潤劑本發(fā)明的組合物可包含濕潤劑，該濕潤劑優(yōu)選地以約0.01％～約20％的水平存在，更優(yōu)選地為約0.1％～約15％且尤其在約0.5％～約10％。優(yōu)選的濕潤劑包括但不局限于下面的化合物，該化合物選自多元醇、尿素、D或DL泛酰醇、泛酸鈣、王漿、panthetine、pantotheine、泛酰乙基醚、潘氨酸、吡哆醇、泛酰乳糖維生素B復(fù)合物(pantoyl lactose vitamin B complex)、己烷-1，2，6-三醇、胍或其衍生物，及其混合物。
此處所用的適當(dāng)?shù)亩嘣及ň鄱己透鼉?yōu)選的亞烷基多元醇及其衍生物，這些醇包括丙二醇、雙丙甘醇、聚丙二醇、聚乙二醇及其衍生物、山梨糖醇、羥丙基山梨糖醇、赤蘚糖醇、蘇糖醇、五赤蘚糖醇(pentaerythritol)、木糖醇、葡萄糖醇、甘露醇、己二醇、丁二醇(如1，3-丁二醇)、己三醇(如1，2，6-己三醇)、三甲基醇丙烷(trimethylol propane)、新戊二醇、甘油、乙氧基甘油、丙烷-1，3-二醇、丙氧基甘油及其混合物。任何上述多元醇的烷氧基化衍生物也適用于此處的用途。本發(fā)明優(yōu)選的多元醇選自甘油、丁二醇、丙二醇、雙丙甘醇、聚乙二醇、己三醇、乙氧基甘油和丙氧基甘油及其混合物。
此處所用的濕潤劑是2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉(NaPCA)、胍；乙醇酸和乙醇酸鹽(如銨和四烷基銨)；乳酸和乳酸鹽(如銨和四烷基銨)；其多種形式的任何一種的蘆薈(aloe vera)(如蘆薈凝膠)；透明質(zhì)酸及其衍生物(如鹽衍生物如透明質(zhì)酸鈉)；乳酰胺單乙醇胺；乙酰胺單乙醇胺；尿素；泛酰醇及其衍生物；以及其混合物。
至少部分的濕潤劑(按重量至多為組合物的約5％)可以以與顆粒狀交聯(lián)的疏水丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯共聚物的混合物形式整合，其本身優(yōu)選地以約0.1％～10％的量存在，可將它加入到水的或分散相中。該共聚物對于在有助于提供有效的潮濕化益處時(shí)減少發(fā)光及控制油是特別有價(jià)值的，并進(jìn)一步詳細(xì)描述于WO96/03964，此處引用作為參考。
潤膚劑本發(fā)明的水包油乳劑的實(shí)施方案可包含約1％～約20％的皮膚病學(xué)可接受的潤膚劑，優(yōu)選地為約1.5％～約15％，更優(yōu)選地為約0.1％～約8％，更優(yōu)選地為約0.5％～約5％。潤膚劑可潤滑皮膚、增加皮膚的柔滑和柔軟、防止或減輕皮膚的干燥和/或保護(hù)皮膚。潤膚劑一般是水不可混合的、油質(zhì)或蠟質(zhì)材料，且具有高分子量的潤膚劑可賦予局部的組合物粘的性質(zhì)。已知有許多適當(dāng)?shù)臐櫮w劑并可在此處使用。Sagarin，Cosmetics，Science and Technology，2ndEdition，Vol.1，pp.32-43(1972)含有許多適用于潤膚劑的材料的例子。在申請WO 00/24372中討論的所有潤膚劑都應(yīng)該認(rèn)為適合于本發(fā)明的使用，盡管優(yōu)選的例子進(jìn)一步詳細(xì)地在下面論述i)具有約7～約40個(gè)碳原子的直鏈和支鏈烴，如十二烷、角鯊?fù)?、膽固醇、氫化的聚異丁烯、異十六烷、異二十烷、異六十八烷isohexapentacontahectane和C7-C40異鏈烷烴，該異鏈烷烴是C7-C40的支鏈烴。此處所用的適當(dāng)?shù)闹ф湡N選自isopentacontaoctactane、礦脂及其混合物。適用于此處的是以商品名Permethyl(RTM)銷售的支鏈脂族烴，且商業(yè)上購自PresperseInc.，P.O.Box 735，South Plainfield，N.J.07080，美國。
ii)C1-C30羧酸的、C12-15烷基苯甲酸的和C2-C30二羧酸的C1-C30醇酯，如異壬酸異壬酯、新戊酸異硬脂酸酯、辛酸異癸酯、異壬酸異癸酯、異壬酸三癸酯、辛酸豆蔻酯、壬酸辛酯、異壬酸辛酯、豆蔻酸豆蔻酯、新戊酸豆蔻酯、辛酸豆蔻酯、豆蔻酸異丙酯、丙酸豆蔻酯、硬脂酸異丙酯、異硬脂酸異丙酯、異硬脂酸甲酯、山崳酸山崳酯、馬來酸二辛酯、己二酸二異丙酯和二亞油酸二異丙酯及其混合物。
iii)糖和相關(guān)材料的C1-C30單-和多酯。這些酯源自糖或多元醇半分子和一種或多種羧酸半分子。依賴于成分酸和糖，這些酯在室溫可為液體或固體形式的。例子包括四油酸葡糖酯、油酸半乳糖四酯、四油酸山梨糖酯、四油酸蔗糖酯、五油酸蔗糖酯、六油酸蔗糖酯、七油酸蔗糖酯、八油酸蔗糖酯、山梨糖醇六酯(其中羧酸酯半分子為1∶2摩爾比例的棕櫚油酸和花生酸)，以及蔗糖的八酯(其中酯化的羧酸半分子為1∶3∶4摩爾比例的月桂酸、亞油酸和山崳酸)。其他材料包括蔗糖的棉籽油或豆油脂肪酸酯。這種材料的其他例子描述于WO 96/16636中，此處引用作為參考。特別優(yōu)選的材料已知為INCI名稱蔗糖聚棉籽油酸酯(sucrosepolycottonseedate)。
iv)植物油和氫化的植物油。植物油和氫化的植物油的例子包括紅花油、椰子油、棉籽油、鯡油、棕櫚籽油、棕櫚油、花生油、豆油、菜籽油、亞麻子油、米糠油、松油、芝麻油、向日葵籽油、來自上述來源的部分或完全氫化的油及其混合物。
v)可溶的或膠狀可溶的潮濕化劑。例子包括hylaronic acid和淀粉嫁接的聚丙烯酸鈉，如Sanwet(RTM)IM-1000、IM-1500和IM-2500，購自Celanese Superabsorbent Materials，Portsmith，VA，美國，并描述于USA-A-4,076,663。
此處所用的優(yōu)選地潤膚劑為異十六烷、isooctacontane、礦脂、異壬酸異壬酯、辛酸異癸酯、異壬酸異癸酯、異壬酸三癸酯、辛酸豆蔻酯、異壬酸辛酯、豆蔻酸豆蔻酯、異硬脂酸甲酯、異硬脂酸異丙酯、C12-15烷基苯甲酸酯及其混合物。此處所用的特別優(yōu)選地潤膚劑為異十六烷、異壬酸異壬酯、異硬脂酸甲酯、異硬脂酸異丙酯、礦脂或其混合物。
乳化劑/表面活性劑此處的組合物可含有乳化劑和/或表面活性劑，它們一般有助于使分散相在連續(xù)的水相中分散和懸浮。如果產(chǎn)物想要用于皮膚清潔時(shí)，表面活性劑也是有用的。為方便，在下文中將乳化劑稱為術(shù)語“表面活性劑”，因而“表面活性劑”將用于指用作乳化劑或其他表面活性劑目的(如皮膚清潔)的表面活性試劑。已知的或常規(guī)的表面活性劑可用于組合物中，前提是選擇的試劑是與組合物的基本成分物理或化學(xué)相容的，并提供想要的特征。適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┌ǚ枪柩跬檠苌牟牧霞捌浠旌衔?。所有描述于申請WO 00/24372中的表面活性劑都應(yīng)該認(rèn)為適用于本發(fā)明中。
本發(fā)明的組合物可包含約0.05％～約15％的表面活性劑或表面活性劑混合物。表面活性劑或表面活性劑混合物的選擇將依賴于組合物的pH和存在的其他成分。
在此處所用的非離子型表面活性劑中的是那些可廣泛地定義為長鏈醇如C8-30醇與糖或淀粉聚合物即糖苷的縮合產(chǎn)物。其他有用的非離子型表面活性劑包括烯化氧與脂肪酸的縮合產(chǎn)物(即脂肪酸的烯化氧酯)。這些材料具有一般分子式RCO(X)nOH，其中R為C10-30烷基基團(tuán)，X為-OCH2CH2-(即源自乙二醇或氧乙烯的)或-OCH2CHCH3-(即源自丙二醇或氧丙烯的)，且n為約6～約200的整數(shù)。其他非離子型表面活性劑是氧化乙烯與2摩爾脂肪酸的縮合產(chǎn)物(即脂肪酸的氧化乙烯二酯)。這些材料具有一般分子式RCO(X)nOOCR，其中R為C10-30烷基基團(tuán)，X為-OCH2CH2-(即源自乙二醇或氧乙烯的)或-OCH2CHCH3-(即源自丙二醇或氧丙烯的)，且n為約6～約100的整數(shù)。此處所用的乳化劑最優(yōu)選地為基于山梨聚糖脂肪酸酯和蔗糖脂肪酸酯混合物的脂肪酸酯混合物，尤其是硬脂酸山梨糖醇酯和sucrosecocoate的混合物。這以商品名Arlatone 2121商業(yè)上可購自ICI。再進(jìn)一步適當(dāng)?shù)睦影╟etearyl alcohol、cetearyl glucoside的混合物，如那些以商品名Montanov 68可購自Seppic的和可購自Henkel的Emulgade PL68/50。
此處所用的親水表面活性劑可選擇地或額外地包括多種陽離子的、陰離子的、兩性離子的和兩性的表面活性劑的任何一種，如本領(lǐng)域中公知的。參見如McCutcheon’s，Detergents andEmulsifiers，North American Edition(1986)，由AlluredPublishing Corporation出版；于1991年4月30日授予Ciotti等人的美國專利No.5,011,681；于1983年12月20日授予Dixon等人的美國專利No.4,421,769；于1973年8月28日授予Dickert等人的美國專利No.3,755,560。多種陰離子表面活性劑在此處也是有用的。參見如于1975年12月30日授予Laughlin等人的美國專利No.3,929,678。
多種陰離子表面活性劑在此處也是有用的。參見如于1975年12月30日授予Laughlin等人的美國專利No.3,929,678。示范性陰離子表面活性劑包括alkoyl isethionates(如C12-C30)、烷基和烷基醚硫酸酯及其鹽、烷基和烷基醚磷酸酯及其鹽、烷基甲基牛磺酸酯(如C12-C30)、和脂肪酸的肥皂(如堿金屬鹽如鈉或鉀鹽)。
兩性的和兩性離子的表面活性劑在此處也是有用的。可用于本發(fā)明的組合物的兩性的和兩性離子的表面活性劑的例子是那些廣泛描述為脂族仲胺和叔胺的衍生物，其中脂族基團(tuán)可為直鏈或支鏈的，且其中一種脂族成分含有約8～約22個(gè)碳原子(優(yōu)選地為C8-C18)，且一種含有陰離子水溶基團(tuán)如羧基、磺酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽或磷酸酯。例子為烷基亞氨基乙酸酯和亞氨基二鏈烷酸酯和氨基鏈烷酸酯、咪唑啉鎓鹽和銨衍生物。其他適當(dāng)?shù)膬尚缘暮蛢尚噪x子的表面活性劑為那些選自甜菜堿、磺基甜菜堿、羥基磺基甜菜堿和分支的和未分支的烷酰基肌氨酸酯及其混合物。
本發(fā)明的一些乳劑可包括含有硅氧烷的乳化劑或表面活性劑。多種硅氧烷乳化劑在此處是有用的。這些硅氧烷乳化劑一般是有機(jī)修飾的有機(jī)多分子硅醚，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其也稱為硅氧烷表面活性劑。有用的硅氧烷乳化劑包括聚二甲基硅氧烷共聚醇。這些材料是聚二甲基硅氧烷，已對該聚二甲基硅氧烷進(jìn)行修飾以包括聚醚側(cè)鏈如聚環(huán)氧乙烷鏈、聚環(huán)氧丙烷鏈、這些鏈的混合物，以及含有源自氧化乙烯和氧化丙烯兩者的半分子的聚醚鏈。其他的例子包括烷基修飾的聚二甲基硅氧烷共聚醇，即含有C2-C30側(cè)鏈的化合物。其他有用的聚二甲基硅氧烷共聚醇包括具有多種陽離子、陰離子、兩性的和兩性離子的側(cè)鏈半分子的材料。
多聚增稠劑本發(fā)明的組合物可包含至少一種多聚增稠劑。此處有用的多聚增稠劑優(yōu)選地具有超過20,000的數(shù)均分子量，更優(yōu)選地為超過50,000且尤其超過100,000。本發(fā)明的組合物可包含按重量計(jì)約0.01％～約10％的多聚增稠劑組合物或其混合物，優(yōu)選地為約0.1％～約8％且最優(yōu)選地為約0.5％～約5％。
此處所用的優(yōu)選地多聚增稠劑包括非離子型的增稠劑和陰離子增稠劑或其混合物。適當(dāng)?shù)姆请x子型增稠劑包括聚丙烯酰胺多聚體、交聯(lián)的聚(N-乙烯吡咯烷酮)、多糖、天然或合成的樹膠、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇。適當(dāng)?shù)年庪x子增稠劑包括丙烯酸/丙烯酸乙酯共聚物、羧基乙烯基多聚體和交聯(lián)的烷基乙烯醚和順丁烯二酸酐的共聚物。此處所用的特別優(yōu)選地增稠劑為非離子型的聚丙烯酰胺多聚體，如聚丙烯酰胺和異鏈烷烴和laureth-7，以商品名Sepigel 305購自Seppic Corporation，和由B.F.Goodrich Company以商標(biāo)Carbopol樹脂銷售的丙烯酸/丙烯酸乙酯共聚物和羧基乙烯基多聚體或其混合物。適當(dāng)?shù)腃arbopol樹脂可為進(jìn)行了疏水修飾的，以及其他描述于W098/22085中的適當(dāng)?shù)臉渲蚱浠旌衔铩?br> 硅油本組合物可包含至少一種硅油相。硅油相一般占組合物的約0.1％～約20％的組合物，優(yōu)選地為約0.5％～約10％，更優(yōu)選地為約0.5％～約5％。硅油相或其每一個(gè)都優(yōu)選地包含一種或多種硅氧烷成分。
硅氧烷成分可為流體，包括直鏈的、分支的和環(huán)狀的硅氧烷。此處所用的適當(dāng)?shù)墓柩跬榱黧w包括聚烷基硅氧烷流體、聚芳基硅氧烷流體、環(huán)狀和線狀聚烷基硅氧烷、聚烷氧基硅氧烷、氨基和季銨修飾的硅氧烷、聚烷基芳基硅氧烷或聚醚硅氧烷共聚物及其混合物。硅氧烷流體可為揮發(fā)性的或非揮發(fā)性的。硅氧烷流體一般具有低于約200,000的重均分子量。適當(dāng)?shù)墓柩跬榱黧w具有約100,000或更低的分子量，優(yōu)選地為約50,000或更低，最優(yōu)選地為約10,000或更低。硅氧烷流體優(yōu)選地選自具有約100～約50,000(更優(yōu)選地為約200～約40,000)的重均分子量的硅氧烷流體。一般地，硅氧烷流體在25℃具有約0.65～約600,000mm2.s-1的粘度，優(yōu)選地為約0.65～約10,000mm2.s-1。粘度可依靠在1970年7月29日Dow CorningCorporate Test Method CTM0004提出的玻璃毛細(xì)管粘度計(jì)來測量。此處可用的適當(dāng)?shù)木鄱谆柩跬榘切┳鳛镾F和Viscasil(RTM)系列可從General Electric Company購得的和作為DowCorning 200系列可從Dow Corning購得的。同樣可用的是基本非揮發(fā)性的聚烷基芳基硅氧烷，例如聚甲基苯基硅氧烷，其在25℃具有約0.65～30,000mm2.s-1的粘度。這些硅氧烷是例如作為SF 1075甲基苯基流體可從General Electric Company購得的或作為556Cosmetic Grade Fluid可從Dow Corning購得的。適用于此處的環(huán)狀的聚二甲基硅氧烷為那些具有整合了約3～約7個(gè)(CH3)2SiO半分子的環(huán)結(jié)構(gòu)的。
硅氧烷樹膠也可用于此處。此處術(shù)語“硅氧烷樹膠”指具有超過約200,000的重均分子量的高分子量硅氧烷，且優(yōu)選地為約200,000～4,000,000。包括的是非揮發(fā)性的聚烷基和聚芳硅氧烷樹膠。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，硅油相包含硅氧烷樹膠或包括硅氧烷樹膠的硅氧烷混合物。一般地，硅氧烷樹膠在25℃具有超過約1,000,000mm2s-1的粘度。硅氧烷樹膠包括由Petrarch及其他人描述的聚二甲基硅氧烷，后者包括1979年5月1日授予Spitzer等人的US-A-4,152,416和Noll，Walter，Chemistry and Technology ofSilicones，New YorkAcademic Press 1968。同樣描述硅氧烷樹膠的是General Electric Silicone Rubber Product Data SheetsSE30、SE33、SE54和SE76。硅氧烷樹膠特定的例子包括聚二甲基硅氧烷、(聚二甲基硅氧烷)(甲基乙烯基硅氧烷)共聚物、聚(二甲基硅氧烷)(二苯基)(甲基乙烯基硅氧烷)共聚物及其混合物。此處所用的優(yōu)選的硅氧烷樹膠為具有約200,000～約4,000,000的分子量的硅氧烷，該硅氧烷選自聚二甲基硅氧烷醇、聚二甲基硅氧烷共聚物、聚二甲基硅氧烷及其混合物。
此處硅氧烷相優(yōu)選地包含作為部分的硅氧烷樹膠流體混合物整合入組合物的硅氧烷樹膠。當(dāng)將硅氧烷樹膠作為部分的硅氧烷樹膠流體混合物整合時(shí)，硅氧烷樹膠優(yōu)選地組成按重量計(jì)約5％～約40％的硅氧烷樹膠流體混合物，尤其為約10％～20％。此處適當(dāng)?shù)墓柩跬闃淠z流體混合物是基本由下面物質(zhì)組成的混合物(i)具有約200,000～約4,000,000的分子量的硅氧烷，該硅氧烷選自聚二甲基硅氧烷醇、氟硅氧烷和聚二甲基硅氧烷及其混合物，和(ii)硅氧烷流體載體，該載體具有約0.65mm2.s-1～約100mm2.s-1的粘度。
其中i)與ii)的比例為約10∶90～約20∶80，且其中基于該硅氧烷樹膠的成分具有約100mm2.s-1～約100,000mm2.s-1的終粘度，優(yōu)選地為約500mm2.s-1～約10,000mm2.s-1。
適用于此處的硅油相的進(jìn)一步的硅氧烷成分為交聯(lián)的聚硅氧烷多聚體，可選擇地分散于流體載體中。通常，當(dāng)存在時(shí)，交聯(lián)的聚硅氧烷多聚體與其載體一起(如果存在時(shí))占組合物的0.1％～約20％，優(yōu)選地為約0.5％～約10％，更優(yōu)選地為約0.5％～約5％。這種多聚體包含用交聯(lián)劑交聯(lián)的聚硅氧烷多聚體。適當(dāng)?shù)慕宦?lián)劑描述于WO98/22085中。此處所用的適當(dāng)?shù)木酃柩跬槎嗑垠w的例子包括甲基乙烯基聚二甲基硅氧烷、甲基乙烯基二苯基聚二甲基硅氧烷和甲基乙烯基苯基甲基二苯基聚二甲基硅氧烷。
適用于此處硅油相的另一類硅氧烷成分包括聚二有機(jī)基硅氧烷-聚氧化烯共聚物，該共聚物含有至少一個(gè)聚二有機(jī)基硅氧烷片段和至少一個(gè)聚氧化烯片段。適當(dāng)?shù)木鄱袡C(jī)基硅氧烷片段及其共聚物公開于WO98/22085中。適當(dāng)?shù)木鄱袡C(jī)基硅氧烷-聚氧化烯共聚物以商品名Belsil(RTM)可商業(yè)上購自Wacker-Chemie GmbH，Geschftsbereich S，Postfach D-8000 Munich 22和以Abil(RTM)購自Th.Goldschmidt Ltd.，Tego House，VictoriaRoad，Ruislip，Middlesex，HA4 OYL，如Belsil(RTM)6031和Abil(RTM)B88183。此處所用的特別優(yōu)選的共聚物流體混合物包括Dow Corning DC3225C，它具有CTFA名稱Dimethicone/Dimethiconecopolyol。
防曬劑本發(fā)明的組合物可包含有機(jī)防曬劑。適當(dāng)?shù)姆罆駝┛删哂蠻VA吸收性質(zhì)、UVB吸收性質(zhì)或其混合性質(zhì)?；钚苑罆駝┑木_量將依賴于想要的組合物的陽光保護(hù)因子即“SPF”以及想要的UV保護(hù)水平而變化。本發(fā)明的組合物優(yōu)選地包含至少10的SPF，優(yōu)選地為至少15。SPF是防曬劑對紅斑的光保護(hù)的常用測量指標(biāo)。SPF定義為在保護(hù)的皮膚上產(chǎn)生最小的紅斑所必需的紫外線能量與在相同的個(gè)體未保護(hù)的皮膚上產(chǎn)生相同的最小紅斑所必需的紫外線能量之間的比例。參見Federal Register，43，No 166，pp.38206-38269，1978年8月25日。所用的防曬劑的量一般為約2％～約20％，更一般地為約4％～約14％。適當(dāng)?shù)姆罆駝┌ǖ痪窒抻谀切┌l(fā)現(xiàn)于CTFAInternational Cosmetic Ingredien t Dictionary and Handbook，7thedition，第2卷第1672頁中的，由Wenninger和McEwen編輯(The Cosmetic，Toiletry，and Fragrance Association，Inc.，Washington，D.C.，1997)。
本發(fā)明的組合物可包含吸收UV輻射的UVA吸收防曬劑活性物，該輻射具有約320nm～約400nm的波長。適當(dāng)?shù)腢VA吸收防曬劑活性物選自二苯甲酰甲烷衍生物、鄰氨基苯甲酸鹽衍生物如氨茴酸甲酯和同甲基(homomethyl)1-N-氨茴酸乙酯(1-N-acetylanthranilate)及其混合物。二苯甲酰甲烷防曬劑活性物的例子描述于授予Depolo的美國專利No 4,387,089和由N.J.Lowe和N.A.Shaath編輯的SunscreensDevelopment，Evaluation，andRegulatory Aspects，Marcel Dekker，Inc(1990)中。UVA吸收防曬劑活性物優(yōu)選地以單獨(dú)地或與可存在于組合物中的其他UV保護(hù)性活性物一起提供廣譜UVA保護(hù)的量存在。
適當(dāng)?shù)腢VA防曬劑活性物為二苯甲酰甲烷防曬劑活性物及其衍生物。它們包括但不局限于那些選自2-甲基二苯甲酰甲烷、4-甲基二苯甲酰甲烷、4-異丙基二苯甲酰甲烷、4-叔丁基二苯甲酰甲烷、2，4-二甲基二苯甲酰甲烷、2，5-二甲基二苯甲酰甲烷、4，4’-二異丙基苯甲酰甲烷、4-(1，1-二甲基乙基)-4’-甲氧基二苯甲酰甲烷、2-甲基-5-異丙基-4’-甲氧基二苯甲酰甲烷、2-甲基-5-叔丁基-4’-甲氧基二苯甲酰甲烷、2，4-二甲基-4’-甲氧基二苯甲酰甲烷、2，6-二甲基-4’-叔丁基-4’-甲氧基二苯甲酰甲烷及其混合物的。優(yōu)選的二苯甲酰防曬劑活性物包括那些選自4-(1，1-二甲基乙基)-4’-甲氧基二苯甲酰甲烷、4-異丙基二苯甲酰甲烷及其混合物的。優(yōu)選地防曬劑活性物是4-(1，1-二甲基乙基)-4’-甲氧基二苯甲酰甲烷。
也稱為丁基甲氧基二苯甲酰甲烷或Avobenzone的防曬劑活性物4-(1，1-二甲基乙基)-4’-甲氧基二苯甲酰甲烷是商業(yè)上可以以Parsol1789的名字從Givaudan Roure(International)S.A.(Basel，瑞士)購得的和以Eusolex9020從Merck & Co.，Inc(Whitehouse Station，NJ)購得的。也稱為異丙基二苯甲酰甲烷的防曬劑4-異丙基二苯甲酰甲烷是商業(yè)上以Eusolex8020的名字可從Merck購得的。
本發(fā)明的組合物可進(jìn)一步包含UVB防曬劑活性物，該防曬劑活性物吸收具有約290nm～約320nm波長的UV輻射。該組合物包含一定量的UVB防曬劑，該量對于獨(dú)立地或與其他可存在于組合物中的UV保護(hù)性活性物一起提供UVB保護(hù)為安全和有效的。該組合物可包含按重量約0.1％～約16％的UVB吸收有機(jī)防曬劑，更優(yōu)選地為約0.1％～約12％，且最優(yōu)選地為約0.5％～約8％。
多種UVB防曬劑活性物適用于此處。這種有機(jī)防曬劑活性物的非限制性的例子描述于1992年2月11日授予Haffey等人的美國專利No 5,087,372；和均于1991年12月17日授予Turner等人和Segarin等人的美國專利Nos 5,073,371和5,073,372，在Cosmetics Sciences and Technology的第VIII章第189頁以及下列等等。其他有用的防曬劑是那些公開于1990年6月26日授予Sabatelli的美國專利No.4,937,370和1991年3月12日授予Sabatelli等人的美國專利No.4,999,186中的。優(yōu)選地UVB防曬劑活性物選自2-乙基己基-2-氰基-3，2-乙基己基N，N-二甲基-對氨基苯甲酸鹽、對氨基苯甲酸、oxybenzone、水楊酸高薄荷酯(homomenthyl salicylate)、水楊酸辛酯、4，4’-甲氧基-叔丁基二苯甲酰甲烷、4-異丙基二苯甲酰甲烷、3-亞芐基樟腦、3-(4-甲基亞芐基)樟腦、3-二苯基丙烯酸鹽(指氰雙苯丙烯酸辛酯)、2-苯基-苯并咪唑-5-磺酸(PBSA)、肉桂酸鹽及其衍生物如2-乙基己基-對-甲氧基肉桂酸鹽和辛基-對-甲氧基肉桂酸鹽、TEA水楊酸鹽、辛基二甲基PABA、樟腦衍生物及它們的衍生物，及其混合物。優(yōu)選的有機(jī)防曬劑活性物為2-乙基己基-2-氰基-3，3-二苯基丙烯酸鹽(稱為氰雙苯丙烯酸辛酯)、2-苯基-苯并咪唑-5-磺酸(PBSA)、辛基-對-甲氧基肉桂酸鹽及其混合物。酸性防曬劑的鹽和酸中和的形式也用于此處。
也可將試劑加入到本發(fā)明中所用的任何組合物中以使UVA防曬劑穩(wěn)定以防止其在暴露于UV輻射中時(shí)導(dǎo)致光降解，并因此維持其UVA保護(hù)功效。已提到大量化合物可提供這些穩(wěn)定性質(zhì)，并應(yīng)該選擇這些化合物以總體上組合(compliment)UVA防曬劑和組合物。適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑包括但不局限于那些描述于美國專利Nos 5,972,316；5,968,485；5,935,556；5,827,508和Patent WO00/06110中的。用于本發(fā)明的穩(wěn)定劑的優(yōu)選的例子包括2-乙基己基-2-氰基-3，3-二苯基丙烯酸酯(稱為氰雙苯丙烯酸辛酯)、乙基-2-氰基-3，3-二苯基丙烯酸酯、2-乙基己基-3，3-二苯基丙烯酸酯、乙基-3，3-雙(4-甲氧基苯基)丙烯酸酯及其混合物。2-乙基己基-2-氰基-3，3-二苯基丙烯酸酯是最優(yōu)選的。
也可將一種試劑添加到本發(fā)明所用的每一種組合物中以改進(jìn)那些組合物的皮膚直接性(substantivity)，特別是增強(qiáng)其對被水洗去或擦掉的抗性。提供該益處的一種優(yōu)選的試劑是乙烯和丙烯酸的共聚物。包含該共聚物的組合物公開于1987年5月5日授予Brock的美國專利4,663,157中。
除有機(jī)防曬劑之外，本發(fā)明的組合物可額外包含無機(jī)物理防曬劑。適當(dāng)?shù)奈锢矸罆駝┑姆窍拗菩岳用枋鲇贑TFA InternationalCosmetic Ingredient Dictionary，6thEdition，1995，pp.1026-28和1103，Sayre，R.M.等人，“Physical Sunscreens”，J.Soc.Cosmet.Chem.，vol 41，no 2，pp.103-109(1990)中。優(yōu)選的無機(jī)物理防曬劑是氧化鋅和二氧化鈦及其混合物。
當(dāng)使用時(shí)，物理防曬劑是以這樣的量存在的，從而使得本組合物在皮膚上是透明的(即沒有變白的)，優(yōu)選地少于或等于約5％。當(dāng)使用了二氧化鈦時(shí)，它可具有銳鈦礦、金紅石或無定形的結(jié)構(gòu)。物理防曬劑顆粒如二氧化鈦和氧化鋅可不用多種材料包被或用多種材料包被，該材料包括但不局限于氨基酸、鋁化合物如氧化鋁、硬脂酸鋁、月桂酸鋁等；羧酸及其鹽如硬脂酸及其鹽；磷脂如卵磷脂；有機(jī)硅氧烷化合物；無機(jī)硅氧烷化合物如硅石和硅酸鹽；以及其混合物。優(yōu)選的二氧化鈦商業(yè)上以MT micro-ionised系列(如MT 100SAS)購自Tayca(Japan)并由Tri-K Industries(Emerson，NJ)分發(fā)。本發(fā)明的組合物可包含按重量約0.1％～約10％的無機(jī)防曬劑，更優(yōu)選地為約0.1％～約4％，且最優(yōu)選地為約0.5％～約2.5％。
抗微生物和抗真菌活性物此處組合物也可包含抗微生物和抗真菌活性物。此處所用的抗微生物和抗真菌活性物的非限制性例子包括β-內(nèi)酰胺藥物、喹諾酮藥物、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、四環(huán)素、紅霉素、氨羥丁卡那霉素A、2，4，4’-三氯-2’-羥基二苯基醚、3，4，4’-trichlorobanilide、苯氧基乙醇、苯氧基丙醇、苯氧基異丙醇、強(qiáng)力霉素、卷曲霉素、氯己定、金霉素、土霉素、氯林肯霉素、乙胺丁醇、己脒定、伊西酸鹽、甲硝基羥乙唑、噴他脒、艮他霉素、卡那霉素、lineomycin、甲烯土霉素、六胺、二甲胺四環(huán)素、新霉素、奈替米星、巴龍霉素、鏈霉素、妥布拉霉素、霉抗唑、鹽酸四環(huán)素、紅霉素、紅霉素鋅、依托紅霉素、硬脂酸紅霉素、硫酸阿米卡星、鹽酸強(qiáng)力霉素、硫酸卷曲霉素、葡糖酸氯己定、鹽酸氯己定、鹽酸金霉素、鹽酸土霉素、鹽酸氯林肯霉素、鹽酸乙胺丁醇、鹽酸甲硝基羥乙唑、鹽酸噴他脒、硫酸艮他霉素、硫酸卡那霉素、鹽酸lineomycin、鹽酸甲烯土霉素、馬尿酸六胺、扁桃酸六胺、鹽酸二甲胺四環(huán)素、硫酸新霉素、硫酸奈替米星、硫酸巴龍霉素、硫酸鏈霉素、硫酸妥布拉霉素、鹽酸霉抗唑、鹽酸amanfadine、硫酸amanfadine、octopirox、對氯間二甲苯酚、制霉菌素、發(fā)癬退、克霉唑、鯨蠟基氯化吡啶鎓(CPC)、吡羅克酮乙醇胺、二硫化硒、酮康唑、三氯卡班、triclosan、吡硫鋅、伊曲康唑、亞洲積雪草酸、扁柏酚、mipirocin及那些描述于EPA0,680,745中的(此處引用作為參考)、鹽酸clinacycin、苯甲酰過氧化物、芐基過氧化物、美濃霉素、苯氧基異丙醇及其混合物。
其他可選擇的成分多種可選擇的成分如中和試劑、香料和染料也可加入到此處的組合物中。優(yōu)選地是任何額外的成分增強(qiáng)產(chǎn)物的皮膚柔和/柔滑優(yōu)點(diǎn)。此外，優(yōu)選地是任何這種成分不對產(chǎn)物的美學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生負(fù)影響。同樣地，蛋白質(zhì)如膠原蛋白和彈性蛋白的高水平在本發(fā)明所用的組合物中不是優(yōu)選的。
本發(fā)明的組合物也可含有約0.01％～約10％的泛酰醇潮濕化劑，優(yōu)選地為約0.1％～約5％。泛酰醇潮濕化劑可選自D-泛酰醇([R]-2，4-二羥基-N-[3-羥丙基])-3，3-二甲基丁酰胺(dimethylbutamide)、DL-泛酰醇、泛酸鈣、王漿、panthetine、pantotheine、panthenyl ethyl ether、潘氨酸、吡哆醇、泛酰乳糖。
適用于中和此處含有親水膠凝劑的酸性基團(tuán)的中和試劑包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、單乙醇胺、二乙醇胺、氨基甲基丙醇、tris-緩沖液和三乙醇胺。
其他可選擇的材料包括溶角蛋白劑(keratolytic agent)；優(yōu)選地在約0.1％～約5％水平的水溶性或增溶的防腐劑，如Germall115、羥基苯甲酸的甲基、乙基、丙基和丁基酯、芐醇、以商品名Glydant Plus可購自Lonza的DMDM乙內(nèi)酰脲碘丙基丁基碳酸酯、EDTA、Euxyl(RTM)K400、Bromopol(2-溴基-2-硝基丙烷-1，3-二醇)和苯氧基丙醇；抗細(xì)菌劑如Irgasan(RTM)和苯氧基乙醇(優(yōu)選地在0.1％～約5％的水平上)；可溶性或膠狀可溶性潮濕化劑如hylaronic acid和淀粉嫁接的聚丙烯酸鈉，如Sanwet(RTM)IM-1000、IM-1500和IM-2500，購自Celanese SuperabsorbentMaterials，Portsmith，VA，美國并描述于USA-A-4,076,663；維生素如維生素A、維生素C、維生素E及其衍生物和其結(jié)構(gòu)單元(building blocks)如植烷三醇和維生素K及其成分如脂肪醇十二碳三烯醇(fatty alcohol dodecatrienol)；α和β羥酸；蘆薈；鞘氨醇和植物鞘氨醇、膽固醇；皮膚變白劑；N-乙酰半胱氨酸；染料；抗細(xì)菌劑如TCC/TCS，也稱為三氯生和trichlorocarbon；香料和香料增溶劑。α羥酸的例子包括乙醇酸、乳酸、蘋果酸、檸檬酸、與乙醇酸銨結(jié)合的乙醇酸、α-羥基乙酸、α-羥基辛酸、α-羥基辛酸、羥基辛酸、混合的水果酸、三-α羥基水果酸、三水果酸、甘蔗提取物、α羥基和botanical comprise、I-α羥酸和交聯(lián)的脂肪酸αnutrium中的glycomer。α羥酸優(yōu)選的例子為乙醇酸和乳酸。優(yōu)選的是α羥酸在至多10％的水平上使用。
可將安全和有效量的抗炎劑加入到本發(fā)明中的組合物中，該量優(yōu)選地為約0.1％～約5％的組合物，更優(yōu)選地為約0.1％～約2％。抗炎劑增強(qiáng)了本發(fā)明的皮膚外觀益處，如這種試劑有助于更均一的和可接受的膚色或顏色。在組合物中所用的抗炎劑的精確量將依賴于利用的特定的抗炎劑，這是因?yàn)檫@種試劑在能力上有變化。
本發(fā)明的組合物可進(jìn)一步包括抗氧化劑/自由基清除劑。該抗氧化劑/自由基清除劑尤其對于提供對可導(dǎo)致角質(zhì)層皮屑增加和肌理變化的UV輻射和對其他可導(dǎo)致皮膚損害的保護(hù)是有用的。適當(dāng)?shù)牧繛榻M合物的約0.1％～約10％，更優(yōu)選地為約1％～約5％?？寡趸瘎?自由基清除劑如抗壞血酸(維生素C)及其鹽。
加入螯合劑對于提供對可導(dǎo)致過度的皮屑或皮膚肌理變化的UV輻射和對其他可導(dǎo)致皮膚損害的保護(hù)是尤其有用的。適當(dāng)?shù)牧繛榻M合物的約0.01％～約1％，更優(yōu)選地為約0.05％～約0.5％。此處所用的示范性螯合劑公開于美國專利No.5,487,884中，此處引用作為參考。本發(fā)明中所用的優(yōu)選的螯合劑是乙二胺四乙酸(EDTA)、糠偶酰二肟及其衍生物。
本發(fā)明的組合物也可包含皮膚增光劑(lightening agent)。當(dāng)使用時(shí)，該組合物優(yōu)選地包含約0.1％～約10％的皮膚增光劑，更優(yōu)選地為約0.2％～約5％，同樣優(yōu)選地為約0.5％～約2％。適當(dāng)?shù)钠つw增光劑包括那些本領(lǐng)域中公知的，包括曲酸、熊果苷、抗壞血酸及其衍生物，如磷酸抗壞血酸酯鎂鹽。適用于此處的進(jìn)一步的皮膚增光劑也包括那些描述于WO 95/34280和WO 95/23780中的；將每一個(gè)文獻(xiàn)在此處引用作為參考。
其他可選擇的材料包括優(yōu)選地在約0.1％～約5％水平的水溶性或增溶的防腐劑，如Germall 115、羥基苯甲酸的甲基、乙基、丙基和丁基酯、芐醇、以商品名Glydant Plus可購自Lonza的DMDM乙內(nèi)酰脲碘丙基丁基碳酸酯、EDTA、Euxyl(RTM)K400、Bromopol(2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇)和苯氧基丙醇；抗細(xì)菌劑如Irgasan(RTM)和苯氧基乙醇(優(yōu)選地在0.1％～約5％的水平上)。抗細(xì)菌劑如TCC/TCS(也稱為三氯生和trichlorocarbon)在本發(fā)明的組合物中也是有用的。
此處的其他可選擇的材料包括色素，該色素如是水不溶性的，則有助于并包括在油相成分的總水平中。適用于本發(fā)明的組合物的色素可為有機(jī)的和/或無機(jī)的。在術(shù)語色素中同樣包括的是具有低的色彩和光澤的材料，如打毛劑(matte finishing agent)，及光散射劑。本發(fā)明的組合物優(yōu)選地包含具有約1.3～約1.7的折射率的顆粒狀材料，該顆粒狀材料分散于組合物中并具有約2～約30μm的中值顆粒大小。此處所用的顆粒優(yōu)選地具有相對窄的分布，這意味著超過50％的顆粒落在各自中值兩側(cè)的3μm內(nèi)。同樣優(yōu)選的是超過50％的顆粒落在為各自中值限定的大小范圍內(nèi)，優(yōu)選地為超過60％的，更優(yōu)選地為超過70％的。適當(dāng)?shù)念w粒狀材料為有機(jī)的或有機(jī)硅氧烷，且優(yōu)選地為有機(jī)硅氧烷聚合物。優(yōu)選的顆粒是自由流動的固體材料?！肮腆w”指顆粒不是空的。空顆粒中部的空間對于折射率具有負(fù)作用，并因此對皮膚或組合物上的顆粒的視覺效應(yīng)有負(fù)作用。適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)顆粒材料包括那些由上文提到的polymethylsilsesquioxane、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯腈、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚苯乙烯、聚四氟乙烯(PTFE)和聚偏1，1-二氯乙烯制成的。也可使用源自上述材料的單體的共聚物。無機(jī)材料包括硅石和一氮化硼。此處有用的顆粒狀材料的代表性商業(yè)上可購得的例子為具有約4.5μm的中值顆粒大小的Tospearl和來自Kobo的具有約10μm的中值顆粒大小的乙烯/丙烯酸共聚物EA-209，以商品名Orgasol 2002可購自法國ElfAtochem的Nylon-12，或其混合物。
適當(dāng)?shù)纳氐倪M(jìn)一步的例子為二氧化鈦、購自Kobo的預(yù)先分散的二氧化鈦如Kobo GWL75CAP、氧化鐵、?；劝彼猁}(acyglutamate)氧化鐵、群青色、D & C染料、洋紅及其混合物。依賴于組合物的類型，通常使用色素的混合物。從潮濕化、皮膚感覺、皮膚外觀和乳劑相容性的視點(diǎn)看，此處所用的優(yōu)選的色素為處理的色素。色素可用化合物如氨基酸、硅氧烷、卵磷脂和酯油來處理。
適當(dāng)?shù)兀颂幗M合物的pH在約6.1～約10.0的范圍內(nèi)，其中將終組合物的pH通過(必要時(shí))添加酸性、堿性或緩沖鹽來調(diào)節(jié)。
組合物制備本發(fā)明的組合物是通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備的。通常水相和/或油相將單獨(dú)制備，其中相似相分離的材料可以以任意順序加入。如果終產(chǎn)物是乳劑，兩相然后將通過激烈的攪動結(jié)合。制劑中具有高揮發(fā)性的或易于在高溫水解的任何成分可在到該過程結(jié)束時(shí)邊溫和攪動邊加入，如果可行可在乳化之后加入。
具有減少的變應(yīng)原性的蛋白酶也可用于對紡織品的處理中?！凹徔椘诽幚怼卑韵逻^程，其中對可編織、粘結(jié)或編結(jié)為紡織品的紡織品、單獨(dú)的紗或纖維進(jìn)行處理以實(shí)現(xiàn)想要的特征。這種想要的特征的例子為“耐洗(stone-washing)”、脫毛(depilling)、去毛、退漿、軟化和其他本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的紡織品處理。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，此處鑒定的抗原決定部位可用于引起免疫反應(yīng)，如在想要產(chǎn)生抗包括一個(gè)或兩個(gè)這種抗原決定部位的的抗體時(shí)。這種抗體可用于如篩選其他的蛋白酶，該蛋白酶包括這種區(qū)域的一個(gè)或兩個(gè)或者與其高度同源的區(qū)域。因此，本發(fā)明提供了包括下列序列的一種或兩者的蛋白酶解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的(i)殘基70-84和/或(ii)殘基109-123。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)為利用分離的天然抗原決定部位、重組蛋白質(zhì)或代表特定抗原決定部位區(qū)域的合成肽的測定，該測定用于估計(jì)人對包括這些或高度同源的區(qū)域的蛋白質(zhì)的致敏性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，此處的抗原決定部位片段可用于抗原呈遞細(xì)胞的探測，該抗原呈遞細(xì)胞具有能夠結(jié)合并展示這種片段的MHC分子。例如，抗原決定部位片段可包括可探測的標(biāo)記(如放射性標(biāo)記)。然后該標(biāo)記的片段可與目標(biāo)細(xì)胞溫育，然后可探測結(jié)合(或展示)了標(biāo)記片段的細(xì)胞。
應(yīng)理解的是本發(fā)明延伸到想要對其調(diào)節(jié)免疫原性反應(yīng)的所有蛋白質(zhì)，例如用作T-細(xì)胞疫苗的肽或用作對抗如癌、傳染病和自身免疫疾病的治療劑的肽或蛋白質(zhì)。
疫苗和/或治療劑可與藥物可接受的載體結(jié)合使用。如在此處所用的，“藥物可接受的”成分是那些適用于人和/或動物的，且無不適當(dāng)?shù)挠泻Ω弊饔?如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))，與合理的利/害比相稱。如在此處所用的，“藥物載體”是用于將具有減少的變應(yīng)原性的蛋白酶送遞到動物或人中的藥物可接受的溶劑、懸浮劑或載體。載體可為液體的或固體的，并根據(jù)頭腦中計(jì)劃的給予方式來選擇。示范性液體載體包括無菌的鹽水、水、緩沖液、有機(jī)溶劑及其組合。
劑量將依賴于溫血?jiǎng)游锏奈锓N或人以及進(jìn)行處理的病毒而廣泛變化。當(dāng)然，給予的劑量將依賴于已知的因素而變化，如特定的試劑的藥物動力學(xué)特征及其給予模式和途徑；受體的年齡、健康和/或體重；癥狀的特性和程度；藥物和病人的代謝特征、同時(shí)治療的種類；治療的頻率；或想要的效果。
通常少至約每千克(kg)身體質(zhì)量1毫克(mg)的劑量是適當(dāng)?shù)?，但?yōu)選地為少至10mg/kg的，且可用達(dá)10,000mg/kg的。優(yōu)選地使用了10mg/kg～約5000mg/kg。最優(yōu)選地，劑量為250mg/kg～約5000mg/kg。用于局部減少免疫原性反應(yīng)的劑量為250mg/kg、500mg/kg、2500mg/kg、3500mg/kg、4000mg/kg、5000mg/kg和6000mg/kg。可使用任何劑量范圍。通常改變的免疫原性蛋白酶可在日基礎(chǔ)上每日給予一次或多次，或者減少的免疫原性的蛋白酶可以以一日中單個(gè)劑量或分開的劑量每星期給予1～4次。在至少幾個(gè)星期的時(shí)段內(nèi)每周兩次是優(yōu)選的，且給藥經(jīng)常持續(xù)到延長的時(shí)段并可能為病人的一生。然而，劑量或劑量制度將依賴于病人維持血液中想要的和有效的抗病毒試劑血漿水平的能力而改變。
靜脈內(nèi)給予時(shí)，最優(yōu)選的劑量為在恒定速率的注入過程中約1～約10mg/kg/分鐘。
對人的劑量一般少于用于小鼠的，且一般為在小鼠中有效的劑量的約1/12。因而，如果500mg/kg在小鼠中是有效的，那么42mg/kg的劑量即可用于人中。對于60kg的人，該劑量將為2520mg。
本發(fā)明的化合物可通過任何適當(dāng)?shù)姆绞浇o予，該方式包括但不局限于如口腔的、直腸的、鼻的、局部的(包括經(jīng)皮膚的、氣溶膠、口的和舌下的)、陰道的、腸胃外的(包括皮下的、肌內(nèi)的、靜脈內(nèi)的和皮內(nèi)的)、膀胱內(nèi)的或注射入病毒或其周圍。
劑量是基于在抗病毒研究中觀察的有效抑制濃度的。優(yōu)選的途徑將根據(jù)(1)受體的狀況和年齡，(2)要處理的病毒(3)傳染病的特性和(4)想要的血液水平而改變。據(jù)信對本發(fā)明用適當(dāng)?shù)妮d體、其他抗病毒劑或化合物或稀釋劑制備的化合物通過靜脈內(nèi)、皮下或肌內(nèi)應(yīng)用的腸胃外治療以促進(jìn)應(yīng)用將成為將化合物給予溫血?jiǎng)游锏膬?yōu)選的方法。
此處引用的所有出版物和專利均在此處整體引用作為參考。下面是以例子的途徑提供的，且不應(yīng)該理解為對權(quán)利要求范圍的限制。
實(shí)施例實(shí)施例1皮膚護(hù)理產(chǎn)品“次要成分(minor)”包含pH調(diào)節(jié)物、防腐劑、粘度調(diào)節(jié)物和香料。除非另外說明，量代表近似的重量百分比，且不打算指示特殊數(shù)字(significant digit)。
增濕沐浴露(bodywash) pH＝7
沐浴露 pH 6.5 pH 7pH 8.5
1-Cognis
身體洗劑(Lotion) pH 7 pH 7 pH 7.5pH 7
1-Uniqema2-Seppic4-Dow Corning
超高增濕面部面霜/洗劑 pH 7 pH 7
1-Seppic3-Dow Corning4-Uniqema5-Scher Chemicals6-Dow Chemicals
面部增濕面霜?jiǎng)?pH 7 pH 7 pH 7.5
1-Uniqema2-BF Goodrich4-Dow Corning實(shí)施例2用未實(shí)驗(yàn)過的人T-細(xì)胞對肽T-細(xì)胞抗原決定部位進(jìn)行鑒定的測定從“未實(shí)驗(yàn)過的”人中收集新鮮人外周血細(xì)胞用于確定來自遲緩芽孢桿菌的蛋白酶和人枯草桿菌蛋白酶中的抗原性抗原決定部位，該“未實(shí)驗(yàn)過的”人即已知未暴露于或不對遲緩芽孢桿菌蛋白酶致敏的人。未實(shí)驗(yàn)過的人意指已知在過去未暴露于蛋白酶中或未發(fā)展對蛋白酶的反應(yīng)。如下制備外周單核血細(xì)胞(貯藏于室溫，不老于24小時(shí))以供使用將來自1單位全血的約30ml棕黃層制劑溶液置于50ml Dulbecco氏磷酸鹽緩沖溶液(DPBS)中并分為兩個(gè)試管。將樣品置于12.5ml室溫lymphoprep密度分離介質(zhì)(Nycomed密度1.077g/ml)的下面。將試管在600G離心30分鐘。收集兩相的界面，匯聚并在DPBS中洗滌。結(jié)果所得的溶液中的細(xì)胞濃度是用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行測量的。生存力是用錐蟲藍(lán)排除(trypan blueexclusion)來測量的。
從結(jié)果所得的溶液中，以如下方式自外周血單核細(xì)胞樣品制備了分化的樹突細(xì)胞培養(yǎng)物，該樣品具有培養(yǎng)基燒瓶中的每75ml溶液108個(gè)細(xì)胞的密度(1)將50ml無血清的AIM V培養(yǎng)基(Gibco)用1∶100稀釋的β-巰基乙醇(Gibco)來補(bǔ)充。將燒瓶在5％的CO2中于37℃平放2小時(shí)以使得單核細(xì)胞粘著到燒瓶壁上。
(2)單核細(xì)胞向樹突細(xì)胞的分化如下將非粘著的細(xì)胞去除并使結(jié)果所得的粘著細(xì)胞(單核細(xì)胞)與30ml AIM V、800單位/mlGM-CSF(Endogen)和500單位/ml IL-4(Endogen)組合；將結(jié)果所得的混合物在5％的CO2中于37℃的條件培養(yǎng)5天。5天后，將細(xì)胞因子TNFα(Endogen)加到0.2單位/ml的終濃度，并將細(xì)胞因子IL-1α(Endogen)加到50單位/ml的終濃度，然后將混合物在5％的CO2中于37℃溫育另外2天。
(3)在第7天，將絲裂霉素C加到50微克/ml的濃度以使現(xiàn)在分化的樹突細(xì)胞培養(yǎng)物的生長停止。將溶液在5％的CO2中于37℃溫育60分鐘。通過用細(xì)胞刮棒輕輕地將粘著的細(xì)胞刮到燒瓶底部來收集樹突細(xì)胞。然后使粘著和非粘著的細(xì)胞在600G離心5分鐘，在DPBS中洗滌并計(jì)數(shù)。
(4)將制備的樹突細(xì)胞以100微升AIM V培養(yǎng)基總體積中2×104/孔的密度置于96孔的圓底陣列中。
CD4+T細(xì)胞是用人CD4+Cellect Kit(Biotex)按照制造商的說明書從用于制備樹突細(xì)胞的外周血細(xì)胞樣品的冷凍的等分試樣制備的，其程序作了以下修改將等分試樣解凍并洗滌，從而在每個(gè)Cellect柱上將應(yīng)用約108個(gè)細(xì)胞；將細(xì)胞重懸于4ml DPBS和1ml來自Cellect Kit的細(xì)胞試劑中，使溶液于室溫維持20分鐘。將結(jié)果所得的溶液在室溫于600G離心5分鐘，并將沉淀重懸于2mlDPBS且應(yīng)用于Cellect柱。柱的流出物收集于DPBS中的2％人血清中。將結(jié)果所得的CD4+細(xì)胞溶液離心，重懸于AIMV培養(yǎng)基中并進(jìn)行密度計(jì)數(shù)。
將CD4+T-細(xì)胞懸浮液以2×106/ml的量重懸于AIM V培養(yǎng)基中以促進(jìn)96孔平板的有效操作。
肽抗原是通過在AIM V培養(yǎng)基中按1∶10的比例稀釋而從DMSO中的1 M貯存液中制備的。將10微升的貯藏液置于含有分化的樹突細(xì)胞的96孔平板的每一個(gè)孔中。將如上所述制備的100微升稀釋的CD4+T-細(xì)胞溶液進(jìn)一步添加到每一個(gè)孔中。有用的對照包括稀釋的DMSO空白對照，及破傷風(fēng)類毒素正對照。
每一個(gè)孔中的終濃度如下，總體積為210微升2×104CD4+2×105樹突細(xì)胞(10∶1的R∶S)5mM肽實(shí)施例3通過全酶/人細(xì)胞體外增殖測定對蛋白酶變體中減少的變應(yīng)原性的檢驗(yàn)原理本測定設(shè)計(jì)為檢驗(yàn)人外周血單核細(xì)胞(PBMC)對目標(biāo)肽(P1，BPN’-Y217L)及其變體的體外增殖反應(yīng)。將P1與酶變體通過用苯甲基磺酰氟(“PMSF”)處理以失活。人PBMC是用要檢驗(yàn)的失活P1和所有變體的逐漸增加的劑量培養(yǎng)的。在這些實(shí)驗(yàn)中檢驗(yàn)的變體為LAP 1BPN’-Y217L；I79ALAP 2BPN’-Y217L；I79A；I122ALAP 3BPN’-Y217L；N76D；I122ALAP 4BPN’-Y217L；N76D；I79A；I122A
LAP 5BPN’-Y217L；N76D對P1的增殖顯示整個(gè)分子已被加工并由PBMC群體中的抗原呈遞細(xì)胞呈遞給T細(xì)胞了。對變體不增殖顯示了哪些氨基酸修飾成功地抑制了P1抗原決定部位的加工、呈遞和/或T細(xì)胞識別。
方法從Stanford University Blood Center(Palo Alto，CA)獲得人棕黃層樣品。將PBMC通過密度分離而分離，在Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水(“DPBS”)中洗滌并計(jì)數(shù)。
P1及其變體是用PMSF失活的將100％乙醇中的100mM PMSF以1∶50的稀釋液加入到2mg/ml的酶溶液中。將混合物渦旋振蕩并使其于室溫靜置5分鐘。再次將PMSF以1∶50的稀釋液加入，并使其靜置另外5分鐘。第3次加入PMSF，使其靜置額外的5分鐘，且殘余的酶活性是在比色底物琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-對硝基酰苯胺測定中估計(jì)的(Delmar，EG等人(1979))。
將PBMC以2×106細(xì)胞/ml的濃度重懸于5％的人AB-血清RPMI1640(pen/strep/谷氨酰胺)中。將細(xì)胞以2ml/孔置于24孔的平板上并加入酶。將每一個(gè)供體用P1進(jìn)行檢驗(yàn)，且檢驗(yàn)盡量多的變體(細(xì)胞數(shù)目限制)。在大多數(shù)這些研究中所用的酶濃度為1、5、10和20μg/ml。最后9個(gè)實(shí)驗(yàn)是用擴(kuò)大的劑量范圍5、10、20和40μg/ml的酶來進(jìn)行的。然而，為了一致性，此處匯編的數(shù)據(jù)是基于20μg/ml的最高劑量的。將培養(yǎng)物在5％的CO2中于37℃溫育5天。在第5天，用移液管使培養(yǎng)物重懸，并將100μl來自每一個(gè)孔的拷貝轉(zhuǎn)移到96孔的平板上。將孔用含氚的胸苷(0.5μCi/孔)脈沖并于37℃中進(jìn)行6個(gè)小時(shí)溫育。然后收獲平板，并確定整合的數(shù)量。
結(jié)果對30～40個(gè)個(gè)體檢驗(yàn)了其對P1與基于P1的變體(如LAP1-LAP5)的反應(yīng)。將LAP5酶稍后加入到規(guī)程中，且用該變體只檢驗(yàn)了18個(gè)個(gè)體。所有個(gè)體的結(jié)果都匯編并提供于下面的表和圖中。如果在較高的劑量有大于或等于2.0的刺激指數(shù)(S.I.)時(shí)則稱結(jié)果是陽性的(“是”)。一個(gè)反應(yīng)如果它顯示少于2.0的S.I.但高于背景時(shí)稱為弱的(圖4)。
檢驗(yàn)的供體的60％表現(xiàn)了對P1具有2.0的S.I.或更好的增殖反應(yīng)。對所有6種酶的反應(yīng)進(jìn)行了匯編并提供于下面的表中表1P1 LAP1 LAP2 LAP3 LAP4LAP5n＝40 n＝40 n＝37 n＝34 n＝33 n＝1822％否 87％否 65％否 82％否69％否 83％否17％弱的2％弱的11％弱的 3％弱的 18％弱的11％弱的60％是 10％是 24％是 15％是12％是 5％是許多具有對變體的陽性反應(yīng)的個(gè)體具有比對親代P1分子低得多的反應(yīng)。
結(jié)論所有檢驗(yàn)的變體誘導(dǎo)了較低百分比的反應(yīng)。所有的變體包括70-84區(qū)域的氨基酸變化，即N76D變化或I79A變化。少數(shù)供體對每一個(gè)變體有反應(yīng)，提示在培養(yǎng)物中變體能由抗原呈遞細(xì)胞加工和呈遞。然而，對變體的反應(yīng)通常比對親代分子P1的低。僅在40個(gè)檢驗(yàn)的個(gè)體中的一個(gè)個(gè)體(T78186)中，在不存在對親代酶的反應(yīng)時(shí)有對變體的反應(yīng)。該供體對LAP1和LAP2有反應(yīng)，但對LAP3、LAP4或LAP5無反應(yīng)。
實(shí)施例4抗原決定部位中特定的改變的變應(yīng)原性殘基的確定基于P1的70-84序列的肽變體是在Stickler等人用20個(gè)群體供體血液樣品的作圖測定中檢驗(yàn)的。一組肽是由Mimostopes(SanDiego，CA)構(gòu)建的。對于每一個(gè)肽變體，構(gòu)建了3個(gè)氨基酸子序列(offset)(15聚體)以覆蓋計(jì)劃改變的整個(gè)區(qū)域。這樣做是為了確保當(dāng)將變體結(jié)合到低變應(yīng)原性蛋白酶中時(shí)我們不在另一個(gè)3聚體“讀框”中形成新的T細(xì)胞抗原決定部位。用質(zhì)譜分析對該組中的親代肽進(jìn)行了分析并發(fā)現(xiàn)該親代肽為約70％完整的15聚體。
肽序列如下
為了清楚，未顯示跨過每一個(gè)區(qū)域的3聚體子序列。
將20個(gè)血液樣品用于檢驗(yàn)所有的肽變體。肽以5μM使用。在這個(gè)群組中，發(fā)現(xiàn)50％的供體對70-84區(qū)域有反應(yīng)，圖4b。所有的70-84變體誘導(dǎo)了顯著低的反應(yīng)。注意只有一個(gè)對I79A肽有反應(yīng)，且沒有其他的對N76D有反應(yīng)，從而闡明了在特定的肽修飾之后變體免疫原性反應(yīng)的減少。
實(shí)施例5第二個(gè)抗原決定部位中特定的改變的變應(yīng)原性殘基的確定對一組在P1的109-123區(qū)域進(jìn)行丙氨酸替代的肽在標(biāo)準(zhǔn)的引發(fā)測定程序(priming assay procedure)進(jìn)行了檢驗(yàn)(Stickler，MM等人，J.Immunother.23(6)654-660(2000))。109-123的序列為NGIEWAIANNMDVIN。丙氨酸替代的肽描述于圖6中。非反應(yīng)者描述于圖4c中。
檢驗(yàn)了總共20個(gè)群體供體。2個(gè)個(gè)體達(dá)到了3或更大的刺激指數(shù)[“SI”](圖5)，這與未實(shí)驗(yàn)過的反應(yīng)者對該區(qū)域的低百分比一致。“1.0”的刺激值與背景水平相等。例如，刺激指數(shù)值2指反應(yīng)是背景水平的2倍。為了對錨定殘基有更堅(jiān)定的估計(jì)，也匯編了所有對對照肽的SI反應(yīng)為2或更好的個(gè)體的數(shù)據(jù)(圖7)。從這些數(shù)據(jù)看，認(rèn)為位置13上的變化對于減少免疫原性是最重要的，這是因?yàn)闆]有任何一個(gè)非反應(yīng)者對該變化有反應(yīng)(圖7)，且所有具有對對照肽的SI為2或更好的反應(yīng)者都對該改變的肽顯示減少的增殖。將肽#13的氨基酸改變命名為I122A，且應(yīng)為這個(gè)序列NGIEWAIANNMDVAN。
此外，從該數(shù)據(jù)看，認(rèn)為位置11上的變化對于增加免疫原性反應(yīng)是最重要的，這是因?yàn)榫哂袑φ针牡腟I為2或更好的5個(gè)反應(yīng)者中的3個(gè)對該改變的肽顯示增加的增殖。將肽#11的氨基酸改變命名為D120A，且應(yīng)為這個(gè)序列NGIEWAIANNMAVIN。
實(shí)施例6體內(nèi)變應(yīng)原性的減少HLA-DR3/DQ2小鼠T細(xì)胞對P1有反應(yīng)方法將HLA-DR3/DQ2轉(zhuǎn)基因小鼠培育在MHC類型II基因敲除(C2D)背景上以形成本研究中所用的小鼠(Cosgrove D等人，Cell661051-66(1991))。在這些研究中使用了雄性和雌性小鼠兩者。動物在一年到6-8個(gè)星期的年齡范圍內(nèi)。所有動物都是在AvironAnimal Facility(Mountain View，CA)即AALAC公認(rèn)的設(shè)備中飼養(yǎng)并維持的。用流式細(xì)胞儀對動物進(jìn)行了估計(jì)并用兩種不同的抗-HLA-DQ抗體試劑發(fā)現(xiàn)其表達(dá)高水平的HLA-DR及低水平的HLA-DQ。雌性表達(dá)比雄性總體更高水平的HLA分子。動物是通過許多途徑進(jìn)行免疫接種的，包括用完全弗氏佐劑(CFA)的爪墊免疫接種、用CFA的腹膜內(nèi)免疫接種和用沉淀在明礬上的P1的腹膜內(nèi)免疫接種。一些動物是通過多途徑進(jìn)行免疫接種的。
結(jié)果
為了核實(shí)HLA-DR3/DQ2小鼠加工并呈遞來自完整的P1酶的70-84和/或109-123抗原決定部位，在P1免疫接種的小鼠中對脾細(xì)胞反應(yīng)做了抗原決定部位的作圖。雌性和雄性小鼠是用10μg在明礬中的P1在1日、3日和10日進(jìn)行3次免疫接種的。在15日，將脾臟去除。將來自雌性小鼠的脾細(xì)胞在體外以每孔106個(gè)細(xì)胞與50μg/ml的P1肽一起放置。收集了來自5個(gè)雄性小鼠的脾細(xì)胞，并如所述地建立了對雌性小鼠脾細(xì)胞的復(fù)制(duplicate)培養(yǎng)物。將該培養(yǎng)物用0.5μCi的含氚胸苷在第24小時(shí)進(jìn)行脈沖，并在第48小時(shí)時(shí)收獲。對復(fù)制培養(yǎng)物的計(jì)數(shù)進(jìn)行了平均并減去了背景。每一個(gè)培養(yǎng)物的背景計(jì)數(shù)對于明礬中的雌性HLA-Dr3/DQ2 P1為2486+218cpm(圖7a)，對于明礬中的雄性HLA-DR3/DQ2 P1為5314+529cpm(圖7B)。雌性小鼠對培養(yǎng)基中PMSF失活的20μm/ml P1有反應(yīng)，SI為2.2，雄性脾細(xì)胞的SI為1.7。對10μg/ml PHA的反應(yīng)是強(qiáng)的，且雌性顯示18的SI而雄性顯示10的SI。
兩組小鼠(上述的雄性和雌性)都顯示對109-123肽的明顯的反應(yīng)。對70-84的反應(yīng)在用這個(gè)途徑免疫接種的雌性小鼠中是缺失的。然而，雄性小鼠展示了對該肽的反應(yīng)。
實(shí)施例7低變應(yīng)原性穩(wěn)定蛋白酶變體的構(gòu)建在確定了T-細(xì)胞抗原決定部位的位置之后，用確立的蛋白質(zhì)工程技術(shù)構(gòu)建了蛋白酶變體。該變體是這樣構(gòu)建的，從而使蛋白質(zhì)中高變應(yīng)原性的氨基酸序列用來自低變應(yīng)原性同系物中的相應(yīng)序列進(jìn)行替代。在這個(gè)例子中，對解淀粉芽孢桿菌突變的枯草桿菌蛋白酶(P1)中多個(gè)殘基進(jìn)行了替代。蛋白酶P1的制備公開于美國再次申請的專利RE 34,606、歐洲專利130,756和美國專利5,441,882中。變體P1基因和氯霉素標(biāo)記基因側(cè)翼與相應(yīng)于apre E座位的5’序列的重復(fù)序列相接，以用于通過用氯霉素選擇來擴(kuò)增拷貝數(shù)。
構(gòu)建了3個(gè)蛋白酶突變體。
LAP2蛋白酶變體LAP2是通過在基于pBluescript的載體中用定點(diǎn)誘變將I79轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼岷蛯122轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼岫氲絇1(BPN’-Y217L)中的。
在結(jié)果所得的LAP2質(zhì)粒中，使aprE座位的5’序列在氯霉素基因之后重復(fù)以通過用增加的氯霉素濃度來擴(kuò)增基因拷貝數(shù)。將LAP2質(zhì)粒用標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化程序轉(zhuǎn)化入芽孢桿菌屬生產(chǎn)品系中。在含有5μg/ml氯霉素的LA平板上選擇轉(zhuǎn)化體。用增加的氯霉素水平使轉(zhuǎn)化體生長并亞培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基中以擴(kuò)增染色體上LAP2的拷貝數(shù)。在LAP2品系對25μg/ml氯霉素進(jìn)行擴(kuò)增之后，將LAP2轉(zhuǎn)化體置于含有1％的脫脂乳的LA+25μg/ml氯霉素中，并測定指示蛋白酶活性的暈圈的存在。LAP2擴(kuò)增的品系在脫脂乳平板測定中產(chǎn)生了暈圈。
LAP3蛋白酶變體LAP3是通過在基于pBluescript的載體中用定點(diǎn)誘變將N76用天冬氨酸殘基替代和將I122用丙氨酸替代而引入到P1中以形成LAP3的。將LAP3轉(zhuǎn)化入芽孢桿菌屬生產(chǎn)品系中并如上所述進(jìn)行擴(kuò)增，然后平板培養(yǎng)于脫脂乳平板上。LAP3轉(zhuǎn)化體在脫脂乳平板測定中產(chǎn)生了暈圈。
LAP4蛋白酶變體LAP4是通過在基于pBluescript的載體中用定點(diǎn)誘變將N76用天冬氨酸殘基替代、將I79用丙氨酸殘基替代和將I122用丙氨酸替代而引入到P1中以形成LAP4的。將LAP4轉(zhuǎn)化入芽孢桿菌屬生產(chǎn)品系中并如上所述進(jìn)行擴(kuò)增，然后平板培養(yǎng)于脫脂乳平板上。LAP4轉(zhuǎn)化體在脫脂乳平板測定中產(chǎn)生了暈圈。
實(shí)施例8低變應(yīng)原性蛋白酶穩(wěn)定突變(N76D、I79A、I122A、N218S、Q206L、P40Q、D41A、H238Y)通過定點(diǎn)誘變來增加穩(wěn)定性的變體列在下面
P1-N76D/I79A/I122A/N218S；P1-N76D/I79A/I122A/Q206L；P1-N76D/I79A/I122A/Q206L/N218S；P1-I79A/I122A/Q206L；P1-I79A/I122A/N218S；P1-I79A/I122A/P40Q；P1-I79A/I122A/D41A；和P1-I79A/I122A/H238Y每一個(gè)蛋白酶變體都是通過在基于pBluescript的載體中用定點(diǎn)誘變替代各自想要替代的殘基(如N76用天冬氨酸殘基、I79用丙氨酸殘基、I122用丙氨酸殘基、Q206用賴氨酸殘基、N218用絲氨酸殘基、P40用谷氨酰胺殘基、D41用丙氨酸殘基及H238用酪氨酸殘基)而形成各自的穩(wěn)定的LAP變體的。將每一個(gè)穩(wěn)定的LAP轉(zhuǎn)化入芽孢桿菌屬生產(chǎn)品系中并如上所述進(jìn)行擴(kuò)增，然后平板培養(yǎng)于脫脂乳平板上。LAP轉(zhuǎn)化體在脫脂乳平板測定中產(chǎn)生了暈圈。
實(shí)施例9低變應(yīng)原性蛋白酶的穩(wěn)定突變(A216K、D181G、S101V、G215A、A216E、L217S、R247Y、R247S、R247Q、G48S、S101Q/S154G、G128S、S182T、S101R、Y104W/I107V、L250G、T254G、T254A、G258S、M50A、G47S、A48G、S182R、S183R、Q185A、S101R/I107V、S248G、Y262F)通過定點(diǎn)誘變來增加穩(wěn)定性的變體列在下面P1-N76D/I79A/I122A/A216K；P1-N76D/I79A/I122A/D181G；P1-N76D/I79A/I122A/S101V；P1-N76D/I79A/I122A/G215A；P1-N76D/I79A/I122A/A216E；P1-N76D/I79A/I122A/L217S；P1-N76D/I79A/I122A/R247Y；P1-N76D/I79A/I122A/R247S；
P1-N76D/I79A/I122A/R247Q；P1-N76D/I79A/I122A/G46S；P1-N76D/I79A/I122A/S101Q/S154G；P1-N76D/I79A/I122A/G128S；P1-N76D/I79A/I122A/S182T；P1-N76D/I79A/I122A/S101R；P1-N76D/I79A/I122A/Y104W/I107V；P1-N76D/I79A/I122A/L250G；P1-N76D/I79A/I122A/T254G；P1-N76D/I79A/I122A/T254A；P1-N76D/I79A/I122A/G258S；P1-N76D/I79A/I122A/M50A；P1-N76D/I79A/I122A/G47S；P1-N76D/I79A/I122A/A48G；P1-N76D/I79A/I122A/S182R；P1-N76D/I79A/I122A/S183R；P1-N76D/I79A/I122A/Q185A；P1-N76D/I79A/I122A/S101R/I107V；P1-N76D/I79A/I122A/S248G；和P1-N76D/I79A/I122A/Y262F；每一個(gè)蛋白酶變體都是通過在基于pBluescript的載體中用定點(diǎn)誘變替代各自想要替代的殘基(如N76用天冬氨酸殘基、I79用丙氨酸殘基、I122用丙氨酸殘基、A216用賴氨酸殘基、D181用甘氨酸殘基、S101用纈氨酸殘基、G215用丙氨酸殘基等)而形成各自的穩(wěn)定的LAP變體的。將每一個(gè)穩(wěn)定的LAP變體轉(zhuǎn)化入芽孢桿菌屬生產(chǎn)品系中并如上所述進(jìn)行擴(kuò)增，然后平板培養(yǎng)于脫脂乳平板上。LAP轉(zhuǎn)化體在脫脂乳平板測定中產(chǎn)生了暈圈。
實(shí)施例10由突變的變體枯草桿菌蛋白酶對二甲基酪蛋白(“DMC”)的水解對用此處所描述的方法分離和純化的突變的變體枯草桿菌蛋白酶(P1、LAP2、LAP3和LAP4)分析了其水解商業(yè)合成底物二甲基酪蛋白(Sigma C-9801)的能力。在適當(dāng)?shù)木彌_液中制備5mg/ml DMC底物溶液(5mg/ml DMC，0.005％(w/w)Tween 80(聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯，Sigma P-1754))。適當(dāng)?shù)腄MC底物緩沖液為如下的50mM pH 5.5的乙酸鈉；50mM pH 6.5的N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸(“TES”)；50mM pH 7.5的哌嗪-N-N’-雙-2-乙烷磺酸(“PIPES”)和50mM pH 8.5的Tris。將200μl想要的pH底物轉(zhuǎn)移到96孔的微量滴定板上并在加入酶之前于37℃預(yù)溫育20分鐘。2，4，6-三硝基苯磺酸鹽(“TNBS”)顏色反應(yīng)方法是在Spectra Max 250分光光度計(jì)上確定的。該測定測量了DMC向含有自由氨基基團(tuán)的肽的酶促水解。這些氨基基團(tuán)與2，4，6-三硝基苯磺酸反應(yīng)形成黃色的復(fù)合物，如在下面的反應(yīng)中描述的因而反應(yīng)的顏色越深，則測量到越高的活性。TNBS探測測定是在于37℃溫育2個(gè)小時(shí)后在上清液中進(jìn)行的。在一種試劑中制備了1mg/ml的TNBS溶液(2.4g NaOH、通過加熱溶解于1000ml的45.4g(Na2B4)7·10H2O)。將60μl等分試樣置于96孔的微量滴定板上。將10μl上述的溫育的酶溶液加入到每一個(gè)孔中并于室溫混合20分鐘。使20μl NaH2PO4溶液(2000ml中70.4g NaH2PO4·H2O和1.2g Na2SO3)在孔中混合1分鐘以使反應(yīng)停止，確定了在SpectraMax 250分光光度計(jì)上405nm處的吸收。也制備了空白對照(相同的TNBS溶液不含酶)。水解是在不同的酶濃度下(0、2.5、5、7.5和10ppm)用下面的公式進(jìn)行測量的吸收405(酶溶液)-吸收405(無酶的)圖8a-10中的數(shù)據(jù)顯示突變的變體水解這種底物的相對能力(與來自已知的突變變體(P1)的蛋白酶相比的)。
如可在圖中看到的，所有3個(gè)酶在不同的pH和不同的酶濃度都顯示對DMC底物的顯著的水解。
實(shí)施例11
膠原蛋白、彈性蛋白和角蛋白由蛋白酶的水解對用上述方法分離和純化的突變的變體枯草桿菌蛋白酶(P1、LAP2、LAP3和LAP4)分析了其水解商業(yè)底物牛膠原蛋白(Sigma C-9879)、牛彈性蛋白(Sigma E-1625)和牛角蛋白(ICNBiomedical 902111)的能力。制備了5mg/ml底物溶液(0.005％Tween 80)。每一種底物都是在如所述的適當(dāng)?shù)膒H(如pH 5.5、6.5、7.5和8.5)下制備的。將1.5ml的每一種底物于37℃轉(zhuǎn)移到24孔的Costar平板上。將該平板在加入酶之前于37℃預(yù)溫育20分鐘。上述TNBS探測測定是在于37℃溫育2個(gè)小時(shí)后在上清液中進(jìn)行的。
圖11-13中的數(shù)據(jù)顯示突變的變體水解這種底物的相對能力(與來自已知的突變變體(P1)的蛋白酶相比)?；钚允窍鄬咏摹Ｗ凅wLAP3水解膠原蛋白比已知的P1變體和前述的雜交蛋白酶好。
如可在圖中看到的，所有3個(gè)酶在不同的pH和不同的酶濃度都顯示對膠原蛋白、彈性蛋白和角蛋白底物的顯著的水解。
實(shí)施例12在哌嗪-N-N’-雙-2-乙烷磺酸(“PIPES”)緩沖液中蛋白酶變體的熱穩(wěn)定性參數(shù)在類型Stratagene Robocycler的PCR熱循環(huán)儀上確定，5.0ppm的酶(使用P1、LAP2、LAP3、LAP4之一)，在每一溫度(在上述PCR熱循環(huán)儀42-56℃范圍內(nèi)兩度的時(shí)間間隔)于pH 6.5時(shí)從5個(gè)時(shí)間點(diǎn)(5、10、20、40和60分鐘)取樣，在42-56內(nèi)每隔一度對穩(wěn)定性進(jìn)行測量。
制備了50mM PIPES緩沖液(50mM PIPES，0.005％Tween80)。將pH調(diào)節(jié)到6.5。
樣品是用標(biāo)準(zhǔn)的琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-對硝基酰苯胺(“SAAPFpNA”)測定進(jìn)行測定的(Delmar，E.G.等人，Anal.Biochem.94(1979)316-320；Achtstetter，Arch.Biochem.Biophys207445-54(1981))(pH 6.5，25℃)。將樣品稀釋到約300毫OD/分鐘。熱穩(wěn)定性表達(dá)為酶半衰期(分鐘)，該半衰期如下進(jìn)行確定H.L.＝ln2/斜率，其中斜率是在每一個(gè)溫度時(shí)曲線上速率對時(shí)間的斜率。
如可在圖14中看到的，突變的變體LAP4具有最好的穩(wěn)定性，該穩(wěn)定性在超過52℃時(shí)好于對照P1的。
實(shí)施例13在N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸(“TES”)中蛋白酶變體的熱穩(wěn)定性參數(shù)5.0ppm的酶(P1、LAP2、LAP3、LAP4)，在每一溫度(在使用上述PCR熱循環(huán)儀溫度梯度的42-56℃范圍內(nèi)兩度的時(shí)間間隔)于pH 6.5時(shí)從5個(gè)時(shí)間點(diǎn)(5、10、20、40和60分鐘)獲取，在42-56內(nèi)每隔一度對穩(wěn)定性進(jìn)行測量。
通過混合50mM TES(Sigma T 1375)和0.005％Tween 80制備了TES緩沖液。將pH調(diào)節(jié)到6.5。
變體的熱穩(wěn)定性是作為用琥珀酰-ala-ala-pro-phe-對硝基酰苯胺(“SAAPFpNA”)(Sigma no.S-7388，Mol.Wt.624.6g/摩爾)測定的殘余變體的活性進(jìn)行確定的(E.G.Delmar等人，Anal.Biochem.94(1979)316-320；Achtstetter，Arch.Biochem.Biophys 207445-454(1981))(pH 6.5，25℃)。形成的(黃色)對硝基酰苯胺(pNA)是用SpectraMax 250分光光度計(jì)在410nm進(jìn)行分光廣度法測量的εM＝8,480 M-1·cm-1()，其中將樣品稀釋到約300mOD/分鐘。熱穩(wěn)定性表達(dá)為上述的酶半衰期(分鐘)。
如可在圖15中看到的，突變的變體LAP4具有最好的穩(wěn)定性，該穩(wěn)定性在超過50℃時(shí)好于對照P1的。
實(shí)施例14二甲基酪蛋白(“DMC”)和角蛋白由突變的變體枯草桿菌蛋白酶的水解用在實(shí)施例10和11中提供的方法，將在實(shí)施例9中所述制備的變體的酶活性與LAP2酶活性用所述的DMC和角蛋白底物進(jìn)行了比較。結(jié)果概述于表2中。
表2
實(shí)施例15沐浴露溶液中蛋白酶變體的穩(wěn)定性使用克隆的酶(如在實(shí)施例1中描述的)，多種蛋白酶的穩(wěn)定性是用下面的規(guī)程測量的。結(jié)果概述于下面的表中。
測量沐浴露溶液穩(wěn)定性的方法參數(shù)(P1、LAP2、LAP3、LAP4)，在一個(gè)研究中為于45℃中30分鐘，而在另一個(gè)研究中為于50℃中30分鐘。
通過將以商標(biāo)ZEST(Procter & Gamble，Cincinnati，Ohio)銷售的沐浴露與去離子水混合而制備50/50(w/w)的沐浴露溶液。緩沖液混合物的pH約為6.8。
將要檢驗(yàn)的酶進(jìn)行稀釋，從而當(dāng)用SAAPFpNA測定終點(diǎn)方法(Dalmer等人，1979)對酶/沐浴露溶液進(jìn)行測定時(shí)，在50 w/w％的沐浴露去離子水溶液中的最終酶濃度可產(chǎn)生OD4050.5到0.1的改變。一旦確定了稀釋的量，則將200μl稀釋的混合物置于96孔的微量滴定板孔中。將平板密封并在一個(gè)研究中置于40℃的水浴中，且在另一個(gè)研究中置于50℃中。在45分鐘之后將平板從水浴中去除，且用終點(diǎn)方法對10μl樣品進(jìn)行測定。剩余活性百分?jǐn)?shù)是通過將終活性除以起始活性再乘以100而計(jì)算的。
表340℃和50℃時(shí)的殘余活性百分?jǐn)?shù)變體 40° 50°Y217L*84 11Y217L，N76D，I122A - 71Y217L，N79A，I122A 56 11Y217L，N76D，N79A，I122A 75 29Y217L，N76D，N79A，I122A，N218S 94 64Y217L，N76D，N79A，I122A，Q206L 90 58Y217L，N76D，N79A，I122A，Q206L，N218S 105 84Y217L，N79D，I122A4，Q206L 76Y217L，N79D，I122A4，N218S 85Y217L，N79D，I122A4，P40Q72Y217L，N79D，I122A4，D41A77Y217L，N79D，I122A4，H238Y 73*BPN’＝解淀粉芽孢桿菌(Y217→L)如可從表3所看到的，包括N76D的變體具有增加的酶活性剩余量并因而比P1具有更寬的熱穩(wěn)定性。例如，在50℃，N76D化合物具有71％、29％、64％、58％和84％的活性剩余，而不具有穩(wěn)定的殘基變體的P1只具有11％的剩余活性。此外，Q206L、N218S、P40Q、D41A和H238Y具有76％、85％、72％、77％和73％的活性剩余，但是沒有額外的穩(wěn)定殘基的LAP2具有56％的活性剩余。在50℃時(shí)沐浴露存在時(shí)，所有的酶均具有增加的穩(wěn)定性，但P1-N76D、N79A、I122A、Q206L、N218S具有最好的穩(wěn)定性。
描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案之后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可看到對公開的實(shí)施方案可進(jìn)行多種修改，且這種修改是在本發(fā)明的范圍內(nèi)的。
權(quán)利要求
1.一種包含T-細(xì)胞抗原決定部位的目標(biāo)蛋白酶的變體，其中該變體與所述目標(biāo)蛋白酶區(qū)別在于具有改變的T-細(xì)胞抗原決定部位，從而該變體和所述目標(biāo)蛋白酶在人中產(chǎn)生不同的免疫原性反應(yīng)；其中該目標(biāo)蛋白酶的該T-細(xì)胞抗原決定部位包括選自相應(yīng)于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的76、79和122殘基的氨基酸替代。
2.權(quán)利要求1的變體，其中由該變體產(chǎn)生的該免疫原性反應(yīng)比由該目標(biāo)蛋白酶產(chǎn)生的免疫原性反應(yīng)弱。
3.權(quán)利要求2的變體，其中由該變體產(chǎn)生的該免疫原性反應(yīng)特征在于體內(nèi)的變應(yīng)原性減少。
4.權(quán)利要求2的變體，其中由該變體產(chǎn)生的該免疫原性反應(yīng)特征在于體外的變應(yīng)原性減少。
5.權(quán)利要求1的變體，其中由該變體產(chǎn)生的該免疫原性反應(yīng)比由該目標(biāo)蛋白酶產(chǎn)生的免疫原性反應(yīng)強(qiáng)。
6.在位置122以及在位置76和79之一或兩者具有替代的權(quán)利要求1的變體。
7.在位置122、在位置76和79之一或兩者及在位置3、31、40、41、111、147、218、206和217的一個(gè)或多個(gè)具有替代的權(quán)利要求6的變體。
8.權(quán)利要求6的變體，該變體包含選自相應(yīng)于Y217L/I79A/I122A、Y217L/N76D/I122A和Y217L/N76D/I79A/I122A的位置的組合替代組。
9.權(quán)利要求6的變體，該變體包含選自Y217L/N76D/I79A/I122A/N218S、Y217L/N76D/I79A/I122A/Q206L、Y217L/N76D/I79A/I122A/Q206L/N218S、Y217L/I79A/I122A/Q206L、Y217L/I79A/I122A/N218S、Y217L/I79A/I122A/P40Q、Y217L/I79A/I122A/D41A和Y217L/I79A/I122A/H238Y的組合替代組。
10.權(quán)利要求6的變體，該變體包含選自Y217L/N76D/I122A/N218S、Y217L/N76D/I122A/Q206L、Y217L/N76D/I122A/Q206L/N218S、Y217L/N76D/I122A/P40Q、Y217L/N76D/I122A/D41A和Y217L/N76D/I122A/H238Y的組合替代組。
11.權(quán)利要求1的變體，該變體在該目標(biāo)蛋白酶中相應(yīng)于解淀粉芽孢桿菌I122A的位置包含替代。
12.權(quán)利要求11的變體，該變體在該目標(biāo)蛋白酶中相應(yīng)于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的N76D和/或I79A的位置之一或兩者具有至少一個(gè)額外的替代。
13.權(quán)利要求11的變體，該變體進(jìn)一步在該目標(biāo)蛋白酶中與選自解淀粉芽孢桿菌的216、181、101、215、216、217、247、46、154、128、182、104、107、250、254、258、50、47、48、182、183、185、248和262的那些位置相當(dāng)?shù)囊粋€(gè)或多個(gè)位置包含替代。
14.權(quán)利要求13的變體，其中在一個(gè)或多個(gè)位置的該進(jìn)一步的替代選自位置A216H、D181G、S101V、G215A、A216E、Y217S、R247Y、R247S、R247Q、G46S、S101Q、S154G、G128S、S182T、S101R、Y104W、I107V、L250G、T254G、T254A、G258S、M50A、G47S、A48G、S182R、S183R、Q185A、S101R、S248G和Y262F。
15.權(quán)利要求11的變體，該變體進(jìn)一步在該目標(biāo)蛋白酶中與選自解淀粉芽孢桿菌的3、76、31、40、41、111、147、218、206和217的那些位置相當(dāng)?shù)囊粋€(gè)或多個(gè)位置包含替代。
16.權(quán)利要求15的變體，其中在一個(gè)或多個(gè)位置的該進(jìn)一步的替代選自S3T、N76D、I31L、P40Q、D41A、I111V、V147P、N218S、Q206L和Y217M。
17.一種編碼權(quán)利要求1的變體的核酸。
18.一種包含權(quán)利要求17的核酸的表達(dá)載體。
19.一種用權(quán)利要求18的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
20.包含權(quán)利要求1的變體的清潔組合物、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品、洗發(fā)精、身體洗劑、口腔清潔組合物或藥物組合物。
21.進(jìn)一步包含藥物可接受的載體的權(quán)利要求20的藥物組合物。
22.一種包含含有T-細(xì)胞抗原決定部位的目標(biāo)蛋白酶的變體的皮膚護(hù)理組合物，其中該變體與該目標(biāo)蛋白酶區(qū)別在于具有改變的T-細(xì)胞抗原決定部位，從而該變體和該目標(biāo)蛋白酶在人中產(chǎn)生不同的免疫原性反應(yīng)；其中該目標(biāo)蛋白酶的該T-細(xì)胞抗原決定部位包括選自相應(yīng)于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的76、79和122殘基的氨基酸替代。
23.進(jìn)一步包含化妝品可接受的載體的權(quán)利要求22的皮膚護(hù)理組合物。
24.權(quán)利要求23的皮膚護(hù)理組合物，其中該載體包含選自水、丙二醇、乙醇、丙醇、甘油、丁二醇、分子量為約200～約600的聚乙二醇、分子量為約425～約2025的聚丙二醇及其混合物的親水稀釋劑。
25.進(jìn)一步包含皮膚護(hù)理活性物的權(quán)利要求22的皮膚護(hù)理組合物。
26.權(quán)利要求25的皮膚護(hù)理組合物，其中該皮膚護(hù)理活性物選自維生素B3成分、泛酰醇、維生素E、維生素E乙酸鹽、視黃醇、丙酸視黃酯、棕櫚酸視黃酯、視黃酸、維生素C、可可堿、α-羥酸、法尼醇、phytrantriol、水楊酸、palmityl peptapeptide-3及其混合物。
26.權(quán)利要求26的皮膚護(hù)理組合物，其中該維生素B3成分是煙酰胺。
27.進(jìn)一步包含甘油的權(quán)利要求22的皮膚護(hù)理組合物。
28.一種皮膚護(hù)理組合物，包含a)按重量計(jì)約0.00001％～約1％的包含T-細(xì)胞抗原決定部位的目標(biāo)蛋白酶的變體，其中該變體與該目標(biāo)蛋白酶區(qū)別在于具有改變的T-細(xì)胞抗原決定部位，從而該變體和該目標(biāo)蛋白酶在人中產(chǎn)生不同的免疫原性反應(yīng)；其中該目標(biāo)蛋白酶的該T-細(xì)胞抗原決定部位包括選自相應(yīng)于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的76、79和122殘基的氨基酸替代；b)按重量計(jì)約0.01％～約20％的濕潤劑；c)按重量計(jì)約0.1％～約20％的皮膚護(hù)理活性物；d)按重量計(jì)約0.05％～約15％的表面活性劑；和e)按重量計(jì)約0.1％～約20％的硅氧烷。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的蛋白質(zhì)變體，該變體當(dāng)與親代蛋白質(zhì)相比時(shí)顯示減少的變應(yīng)原性。同樣包括的是編碼新變體的DNA分子、包含DNA的宿主細(xì)胞和制備較小變應(yīng)原性的蛋白質(zhì)的方法。
文檔編號C07H21/04GK1512998SQ02807083
公開日2004年7月14日 申請日期2002年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月23日
發(fā)明者D·A·埃斯特爾, D A 埃斯特爾, G·C·甘斯霍, 甘斯霍, F·A·哈丁, 哈丁, E·A·拉雷納斯, 拉雷納斯, A·J·普洛斯, 普洛斯, E·E·希科斯基, ?？扑够? R·P·埃里奧特, 埃里奧特 申請人:金克克國際有限公司, 寶潔公司