生物膜蛋白質(zhì)的提取方法和電泳樣品的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物處理技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種生物膜蛋白質(zhì)的提取方法和電泳樣品的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]許多研宄證明，通過傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法鑒定的微生物只占天然環(huán)境微生物總數(shù)的I %。近年來，新興的宏蛋白質(zhì)組學(xué)是一種運(yùn)用蛋白質(zhì)組技術(shù)對特定微生物群落所產(chǎn)生的全部蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模研宄與分析的新技術(shù)，也是一種探索微生物群落結(jié)構(gòu)的新策略。通過宏蛋白質(zhì)組研宄能夠把微生物群落組成與其生態(tài)功能聯(lián)系起來，從而更好地了解系統(tǒng)中的功能微生物。
[0003]隨著對微生物和環(huán)境微生物的宏基因的測序研宄的不斷深入和發(fā)展，對基因表達(dá)蛋白質(zhì)的研宄更加重要。盡管宏基因組學(xué)研宄能夠提供很多有價(jià)值的數(shù)據(jù)，其弊端也顯現(xiàn)出來:，比如，由于重復(fù)基因的出現(xiàn)和基因表達(dá)的時(shí)空性等原因，造成了微生物的基因表達(dá)不能通過宏基因組的研宄來解釋。此外，微生物對物質(zhì)的轉(zhuǎn)化主要是通過其分泌的酶來實(shí)現(xiàn)的。眾所周知，大多數(shù)酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，因此，在基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組這4個(gè)研宄層次中，蛋白質(zhì)組學(xué)是最直接的對特定環(huán)境和特定時(shí)刻生物功能本質(zhì)的研宄，這種研宄具有較大的生物學(xué)意義。盡管現(xiàn)在只開展了少數(shù)的宏蛋白質(zhì)組學(xué)研宄，但是其在環(huán)境微生物研宄中的巨大作用已經(jīng)顯現(xiàn)出來。
[0004]Wilmes.P.等人在生物強(qiáng)化除磷系統(tǒng)中鑒定出了 702個(gè)與A.phosphatis有關(guān)的蛋白點(diǎn)，并指出在好氧和厭氧環(huán)境下，僅有3%的蛋白表達(dá)產(chǎn)生顯著差別。Lv.F.等人研宄纖維素的厭氧消化處理時(shí)發(fā)現(xiàn)微生物能夠?qū)w維素進(jìn)行劇烈水解作用，并且檢測到了分子生物技術(shù)未能檢出的具有纖維素分解功能的微生物。Kan等人對Chesapeake海灣海水微生物群落進(jìn)行研宄通過2D電泳發(fā)現(xiàn)該海灣不同水域蛋白質(zhì)組存在較大差異，通過對有表達(dá)差異的7種蛋白質(zhì)譜分析，鑒定出4種新的蛋白質(zhì)。因此，微生物的蛋白表達(dá)是隨著時(shí)間和空間的變化而變化的動(dòng)態(tài)信息，能夠更加直接具體地給出關(guān)于微生物活性方面的信息，因而宏蛋白質(zhì)組學(xué)在微生物群落功能分析、代謝與環(huán)境相互作用過程中具有更大的潛力。
[0005]進(jìn)行宏蛋白質(zhì)組學(xué)分析的關(guān)鍵步驟是實(shí)現(xiàn)對樣品中蛋白質(zhì)的有效提取。Taylor等模擬天然環(huán)境，對培養(yǎng)的微生物樣品進(jìn)行了兩種提取方法的比較。結(jié)果顯示直接提取法的蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖像模糊不可辨，而且蛋白質(zhì)回收率很低；DGC-EXT提取法的SDS-PAGE圖像有6?10條帶，說明先收集細(xì)胞再提取蛋白法(DGCEXT提取法)優(yōu)于直接提取法。Wilmes.P.等對活性污泥的蛋白質(zhì)提取進(jìn)行了不同細(xì)胞破碎法、不同洗滌及裂解緩沖液、不同蛋白沉淀及溶解方法對蛋白提取效果的影響的研宄，最終確定了一種適合活性污泥的總蛋白提取方法。Kuhn.R.等人采用了酚提法來提取MBR反應(yīng)器中活性污泥的蛋白質(zhì)。苯酚對其中的腐殖質(zhì)有一定的萃取作用，并對粗提液進(jìn)行了多次醋酸銨沉淀最終獲得了可用于2D電泳分析的蛋白質(zhì)溶液。由于環(huán)境樣品的復(fù)雜性，目前仍然沒有通用的適用于提純各種環(huán)境下微生物總蛋白的方法，尤其是從生物膜或活性污泥等環(huán)境中提取蛋白還是有很多的困難。
[0006]對污水污泥處理中微生物的宏蛋白質(zhì)組學(xué)主要集中于活性污泥。然而，在自然環(huán)境下，與活性污泥系統(tǒng)相比，生物膜也是個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，諸多因素共同影響著污染物的迀移、轉(zhuǎn)化以及微生物的群落結(jié)構(gòu)，目前，對于生物膜系統(tǒng)的研宄大都是在實(shí)驗(yàn)室可控條件下開展的，需要預(yù)先培養(yǎng)或者富集特定微生物。另外，生物膜是復(fù)雜的微生物聚集體，食物鏈長，腐殖化程度明顯，生物膜中各種微生物以附著形式生長，在濾料表面繁殖形成致密的生物膜，其結(jié)構(gòu)與微生物種類往往比活性污泥菌膠團(tuán)更加復(fù)雜和多樣。而且在生物膜老化的過程中產(chǎn)生的腐殖質(zhì)會(huì)與微生物釋放和分泌的蛋白質(zhì)結(jié)合，難以分離導(dǎo)致樣品提純難度大，是這一研宄中存在的最大困難。加上蛋白質(zhì)技術(shù)又沒有類似于PCR的擴(kuò)增手段等，對于蛋白質(zhì)含量低的樣品分析更加困難?，F(xiàn)有的各種蛋白質(zhì)提取方法運(yùn)用于生物膜效果都不盡人意，目前還沒有一種提取生物膜總蛋白質(zhì)的通用有效的方法，這也是導(dǎo)致宏蛋白質(zhì)組學(xué)在環(huán)境研宄方面的遲滯最重要原因。
[0007]目前被宏蛋白質(zhì)組研宄者廣泛使用的由Wilmes.P.建立的方法，發(fā)明人重復(fù)該方法提取生物膜的蛋白質(zhì)，沒有獲得理想的效果，表明該方法缺乏較好的通用性。因此提出了新的高效、通用的蛋白質(zhì)提取方法對宏蛋白質(zhì)組學(xué)研宄與應(yīng)用至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為了解決上述問題，本發(fā)明的主要目的在于提供一種生物膜蛋白質(zhì)的提取方法，該種方法能夠?qū)碜杂谏锬さ牡鞍踪|(zhì)進(jìn)行有效提取，其無需對特定的微生物進(jìn)行預(yù)先培養(yǎng)或者富集，同時(shí)也能夠降低腐殖質(zhì)對蛋白質(zhì)的掩蔽作用，使蛋白質(zhì)能夠很好地與腐殖質(zhì)相脫離。
[0009]本發(fā)明的另外一個(gè)目的在于提供一種電泳樣品的制備方法，該方法采用上述被提取后的蛋白質(zhì)制成電泳樣品，能夠使得該電泳樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測后所成的條帶清晰，或者，使該電泳樣品經(jīng)雙向電泳(two-dimens1nalelectrophoresis)分離后所成的蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰，為蛋白質(zhì)組學(xué)研宄等后續(xù)的研宄工作打下了良好的基礎(chǔ)。
[0010]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的解決方案是:
[0011]一種生物膜蛋白質(zhì)的提取方法，其包括如下步驟:
[0012](I).對生物膜樣品進(jìn)行預(yù)處理，得到沉淀物；
[0013](2).將步驟(I)所得沉淀物與裂解液和苯甲基磺酰氟溶液混合，在冰浴條件下超聲裂解，得到樣品裂解液；
[0014](3).將步驟⑵所得樣品裂解液震蕩并離心，取上清液，采用TCA-丙酮沉淀法對上清液進(jìn)行處理，得到蛋白質(zhì)樣品。
[0015]其中，步驟(I)中的預(yù)處理包括如下步驟:
[0016]a.采用濃度為9 土 lmg/mL的氯化鈉溶液洗滌生物膜樣品，以8000 土 100rpm的轉(zhuǎn)速于4±1°C下離心5±lmin，收集沉淀；
[0017]b.采用磷酸緩沖鹽溶液洗滌步驟a所得沉淀，渦旋振蕩后以8000 土 100rpm的轉(zhuǎn)速于4±1°C下離心5±lmin，得到沉淀物。
[0018]在步驟(2)中，裂解液可以含有1±0.5界七％的Triton X_100、l±0.5wt%的脫氧膽酸鈉和 0.1±0.05wt%^ SDSo
[0019]在步驟⑵中，苯甲基磺酰氟溶液的濃度可以為100±10mmol/L，超聲的強(qiáng)度可以為250-300W，超聲的時(shí)間可以為20±10個(gè)周期，每個(gè)周期內(nèi)連續(xù)超聲20秒并且停止超聲10秒。
[0020]在步驟(3)中，震蕩的條件可以為:以200-300rpm的速度于4土1°C下進(jìn)行震蕩；離心的條件可以為:以13000± 100rpm的轉(zhuǎn)速于4±1°C下離心30±10min。
[0021 ] 在步驟(3)中，TCA-丙酮沉淀法可以包括如下步驟:
[0022]a.將上清液與三氯乙酸以(9±3): (I ± I)的體積比混合，于4土 1°C下靜置，然后離心，得到初級(jí)沉淀物；
[0023]b.將步驟a所得初級(jí)沉淀物用三倍于初級(jí)沉淀物體積的預(yù)冷后的丙酮洗滌，于4±1°C下靜置并離心，得到次級(jí)沉淀物；
[0024]c.重復(fù)步驟b兩至三次，得到蛋白質(zhì)樣品。
[0025]其中，在步驟a中，靜置的時(shí)間可以為30±10min，離心的條件可以為:以13000± 100rpm 的轉(zhuǎn)速于 4±1°C下離心 10±5min。
[0026]在步驟b中，靜置的時(shí)間為30±10min，離心的條件為:以13000±1000rpm的轉(zhuǎn)速于 4± 1°C下離心 10±5min。
[0027]一種電泳樣品的制備方法，其包括如下步驟:使用溶解液溶解上述的蛋白質(zhì)樣品，依次進(jìn)行超聲、渦旋振蕩和離心，取上清液得到電泳樣品。
[0028]其中，溶解液中含有7mol/L的尿素和2mol/L的硫脲。超聲的時(shí)間可以為20±5min ;渦旋振蕩的時(shí)間可以為30min以上；離心的條件可以為以13000± 100rpm的速度于4± 1°C下離心30± 1min。
[0029]由于采用上述方案，本發(fā)明的有益效果是:
[0030]首先，本發(fā)明采用含有多