一種雙向電泳蛋白質(zhì)樣品的定量方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雙向電泳蛋白質(zhì)樣品的定量方法，包括：雙向電泳蛋白樣品制備；用雙向電泳細(xì)胞裂解液配制1-2mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）溶液，取8支離心管，分別加入0-200μL牛血清白蛋白溶液，并用超純水補(bǔ)足至1mL，使標(biāo)準(zhǔn)蛋白的終濃度為0-0.2mg.mL-1，然后每支離心管中加入0.01%考馬斯亮藍(lán)G-250或R-250染液5mL，充分混勻，得不同濃度標(biāo)準(zhǔn)混合溶液；雙向電泳蛋白樣品混合溶液制備；加樣，描并框選熒光強(qiáng)度；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；計算雙向電泳蛋白樣品的濃度。本發(fā)明操作簡單，準(zhǔn)確、快速且廉價。
【專利說明】一種雙向電泳蛋白質(zhì)樣品的定量方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種蛋白質(zhì)的定量方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]蛋白質(zhì)定量是細(xì)胞分子生物學(xué)實驗中的重要環(huán)節(jié)。常用的蛋白定量方法有二喹啉甲酸法(BCA法)以及Bradford MM于1976年發(fā)明的考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)，兩者都是基于吸光度值的定量方法。雙向電泳(2-D)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究過程中的核心技術(shù)，由于2-D蛋白樣品處理工藝復(fù)雜，所用試劑種類繁多。此過程中所使用的尿素、硫脲、曲拉通X-100 (Triton X-100)、十二烷基硫酸鈉(SDS)等試劑易與BCA、考馬斯亮藍(lán)(CBB)反應(yīng)顯色，從而影響吸光度值進(jìn)而影響定量準(zhǔn)確性，因此這兩種方法都不能用于2-D實驗。鑒于以上試劑兼容性問題的存在，伯樂公司(Bio-Rad)公司和通用電氣公司(GE)各自研發(fā)出專門針對2-D的蛋白質(zhì)定量試劑盒，但這些試劑盒都是基于分光光度法開發(fā)的，操作步驟較多，對實驗者操作要求較高，且試劑盒價格不菲。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于 克服上述缺點而提供的一種操作簡單，準(zhǔn)確、快速且廉價的雙向電泳蛋白質(zhì)樣品的定量方法。
[0005]本發(fā)明的一種雙向電泳蛋白質(zhì)樣品的定量方法，包括如下步驟:
(1)雙向電泳蛋白樣品制備:取不同來源的生物樣品IO-1OOmgJpl_5mL雙向電泳細(xì)胞裂解液，重懸后收集于離心管冰上超聲，每次超聲10s，暫停10s，共計5個循環(huán)；4°C、14000g離心30min，將上清轉(zhuǎn)移至新離心管，分裝后_80°C保存，得雙向電泳蛋白樣品；
(2)用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的制備:用雙向電泳細(xì)胞裂解液配制l-2mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液，取8支離心管，分別加入0-200 μ L牛血清白蛋白溶液，并用超純水補(bǔ)足至lmL，使標(biāo)準(zhǔn)蛋白的終濃度為0-0.2mg.mL—1，然后每支離心管中加入0.01%考馬斯亮藍(lán)G-250或R-250染液5mL，充分混勻，得不同濃度標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，待測；
(3)雙向電泳蛋白樣品混合溶液制備:取10-100μ L雙向電泳蛋白樣品加入離心管中，用超純水補(bǔ)足至lmL，再加入0.01%考馬斯亮藍(lán)G-250或R-250染液5mL，充分混勻，待測；
(4)加樣:取孔板一塊，在各孔中分別加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)混合溶液和雙向電泳蛋白樣品混合溶液200-1000 μ L ；
(5)掃描并框選熒光強(qiáng)度:加樣完成后迅速將孔板去蓋后用基因公司L1-COR的Odyssey近紅外熒光成像系統(tǒng)，在680nm通道下掃描成像，并框選熒光區(qū)域；
(6)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:記錄各孔的熒光強(qiáng)度，以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合溶液為橫坐標(biāo)(X)，對應(yīng)的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)(Y)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程；
(7)計算雙向電泳蛋白樣品的濃度:將雙向電泳蛋白樣品混合溶液孔的熒光強(qiáng)度代入回歸方程，即可計算出待雙向電泳蛋白樣品的終濃度。在終濃度基礎(chǔ)上乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即是雙向電泳蛋白樣品原液的濃度。
[0006]上述的一種雙向電泳蛋白質(zhì)樣品的定量方法，其中:步驟(1)中雙向電泳細(xì)胞裂解液中含有:7-9moI/L尿素、0-2moI/L硫脲、質(zhì)量濃度4%的3- [ (3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽、65mmol/L 二硫蘇糖醇。
[0007]上述的一種雙向電泳蛋白質(zhì)樣品的定量方法，其中:步驟(4)中孔板的規(guī)格為24、48或96孔。
[0008]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有明顯的有益效果，由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明基于考馬斯亮藍(lán)染色聯(lián)合紅外熒光成像法的蛋白質(zhì)定量方法，以牛血清白蛋白(BSA)作為蛋白質(zhì)定量的標(biāo)準(zhǔn)品，不同濃度的BSA和考馬斯亮藍(lán)G-250 (或R-250)混合形成蛋白-考馬斯亮藍(lán)結(jié)合物。使用近紅外熒光掃描成系統(tǒng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線用于雙向電泳蛋白質(zhì)樣品的定量。經(jīng)實驗證明，在680nm所在波長下，在0.01mg/mL-0.2mg/mL的范圍內(nèi)，蛋白量與熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出良好的線性和可重復(fù)性。本發(fā)明使蛋白質(zhì)定量不受試劑兼容性的束縛，適用與包括2-D實驗和一些試劑兼容性較差的蛋白樣品。能使2-D蛋白質(zhì)定量不再依賴于昂貴且操作繁瑣的專用蛋白定量試劑盒。本發(fā)明還能用于一些試劑兼容性較差的蛋白樣品的濃度的測定。
[0009]
【具體實施方式】
[0010]以下通過實施例和實驗例來進(jìn)一步說明本發(fā)明方法的有益效果。
[0011]實施例1:
一種能用于雙向電泳技術(shù)的蛋白質(zhì)的定量方法，以人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞雙向電泳蛋白樣品為例，包括以下步驟:
(O雙向電泳蛋白樣品制備:取人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞樣品IOmgJP ImL雙向電泳細(xì)胞裂解液(7mol/L尿素、2mol/L硫脲、質(zhì)量濃度4%的3-[(3_膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽、65mmol/L 二硫蘇糖醇)，重懸后收集于15mL離心管冰上超聲，每次超聲IOs,暫停IOs,共計5個循環(huán)jX^HOOOg離心30min,將上清轉(zhuǎn)移至新離心管，分裝后_80°C保存；
(2)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白與考馬斯亮藍(lán)G-250混合溶液的制備(用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線):用雙向電泳細(xì)胞裂解液配制2mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液，分別取O μ L，5 μ L，15 μ L，25 μ L，35 μ L，50 μ L，75 μ L，100 μ L加入到編號為1-8的離心管中，用超純水補(bǔ)足到ImL,使蛋白終濃度分別為 Omg.mL S 0.01mg.mL ^0.03mg.mL \ 0.05mg.mL \ 0.07mg.mL S 0.1mg.ml/1,0.15mg.ml/1,0.2mg.ml/1,然后每支離心管中加入0.01%考馬斯亮藍(lán)G-250染液5mL,充分混勻，待測；
(3)雙向電泳蛋白樣品混合溶液制備:取一支離心管，標(biāo)記為9號，加入待測濃度的雙向電泳蛋白樣品溶液10 μ L，用超純水補(bǔ)足lmL，再加入0.01%考馬斯亮藍(lán)G-250染液5mL，充分混勻，待測；
(4)加樣:將離心管中的混合溶液充分混勻后，取96孔板一個，從1-8號離心管中各取混合液200 μ L，分別加入到第一排8個孔；從9號中取混合溶液200 μ L，分別加入到第二排的第I個孔；
(5)掃描并框選熒光強(qiáng)度:加樣完成后迅速將96孔板去蓋后用基因有限公司L1-COR的Odyssey近紅外熒光成像系統(tǒng)，選擇成像區(qū)域后用680nm通道掃描成像，并框選熒光區(qū)域(孔板各孔的圓形熒光區(qū)域);
(6)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:記錄680nm通道下各孔的熒光強(qiáng)度，以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合溶液為橫坐標(biāo)(X)，對應(yīng)的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)(Y)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y = 34.96x +0.971，R2=0.991。
[0012](7)計算雙向電泳蛋白樣品的濃度:將SGC-7901蛋白樣品混合溶液孔的熒光強(qiáng)度1.53代入回歸方程，計算得雙向電泳蛋白樣品的濃度為0.016mg/mL，則原液濃度為
0.016X100 (稀釋倍數(shù))=1.60mg/mL。
[0013]實施例2
一種能用于雙向電泳技術(shù)的蛋白質(zhì)的定量方法，以人肝癌HepG2細(xì)胞雙向電泳蛋白樣品為例，包括以下步驟:
(1)雙向電泳蛋白樣品制備:取人肝癌IfepG2細(xì)胞樣品lOOmg，加5mL雙向電泳細(xì)胞裂解液(9mol/L尿素、質(zhì)量濃度4%的3-[(3_膽酰胺基丙基)二甲基銨基]_1_丙磺酸鹽、65mmol/L 二硫蘇糖醇),重懸后收集于15mL離心管冰上超聲,每次超聲IOs,暫停IOs,共計5個循環(huán)；4°C、14000g離心30min，將上清轉(zhuǎn)移至新離心管，分裝后-80°C保存；
(2)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白與考馬斯亮藍(lán)G-250混合溶液的制備(用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線):用雙向電泳細(xì)胞裂解液配制lmg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液，取8支15mL離心管，編號為1-8 號，在 1-8 號管分別加入 0μ L、10y L、30y L、50y L、70y L、100y L、150y L、200y L 牛血清白蛋白溶液，并用超純水補(bǔ)足至ImL,使標(biāo)準(zhǔn)蛋白的終濃度為:0mg.ml/1,0.01mg.mL-1,
0.03mg.mL \ 0.05mg.mL S 0.07mg.mL S 0.lmg.mL \ 0.15mg.HiL1j0.2mg.mL 1,然后每支離心管中加入0.01%考馬斯亮藍(lán)G-250染液5mL，充分混勻，待測；
(3)雙向電泳蛋白樣品與考馬斯亮藍(lán)G-250混合溶液制備:取一支離心管，標(biāo)記為9號，加入待測濃度的雙向電泳蛋白樣品溶液50 μ L，用超純水補(bǔ)足lmL，再加入0.01%考馬斯亮藍(lán)G-250染液5mL，充分混勻，待測；
(4)加樣:將離心管中的混合溶液充分混勻后，取48孔板一塊，從1-8號離心管中各取混合液500 μ L，分別加入到第一排8個孔；從9號中取混合液500 μ L，分別加入到第二排的第I個孔；
(5)掃描并框選熒光強(qiáng)度:加樣完成后迅速將48孔板去蓋后用基因有限公司L1-COR的Odyssey近紅外熒光成像系統(tǒng)，選擇成像區(qū)域后用680nm通道掃描成像，并框選熒光區(qū)域(孔板各孔的圓形熒光區(qū)域)；
(6)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:記錄680nm通道下各孔的熒光強(qiáng)度，以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合溶液為橫坐標(biāo)(X)，對應(yīng)的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)(Y)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y = 32.632x+1.7561，R2 = 0.9942 ；
(7)計算雙向電泳蛋白樣品的濃度:將HepG2細(xì)胞蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度7.66代入回歸方程，計算得雙向電泳蛋白樣品的濃度為0.18mg/mL，則原液濃度為0.18X20 (稀釋倍數(shù))=
3.60mg/mLo
[0014]實施例3
一種能用于雙向電泳技術(shù)的蛋白質(zhì)的定量方法，以人宮頸癌HeIa細(xì)胞雙向電泳蛋白樣品為例，包括以下步驟:(O雙向電泳蛋白樣品制備:取人宮頸癌Hela細(xì)胞樣品50mg，加3mL雙向電泳細(xì)胞裂解液(7mol/L尿素、2mol/L硫脲、質(zhì)量濃度為4%的3-[(3_膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽、65mmol/L 二硫蘇糖醇)，重懸后收集于15mL離心管冰上超聲，每次超聲IOs,暫停IOs,共計5個循環(huán),411CUHOOOg離心30min,將上清轉(zhuǎn)移至新離心管，分裝后_80°C保存；
(2)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白與考馬斯亮藍(lán)R-250混合溶液的制備(用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線):用雙向電泳細(xì)胞裂解液配制lmg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液，取8支15mL離心管，編號為1-8 號，在 1-8 號管分別加入 0μ L、10y L、30y L、50y L、70y L、100y L、150y L、200y L 牛血清白蛋白溶液，并用超純水補(bǔ)足至ImL,使標(biāo)準(zhǔn)蛋白的終濃度為:0 mg.mL_1,0.01mg.mL-1,
0.03mg.mL \ 0.05mg.mL S 0.07mg.mL S 0.lmg.mL \ 0.15mg.HiL1j0.2mg.mL 1,然后每支離心管中加入0.01%考馬斯亮藍(lán)R-250染液5mL，充分混勻，待測；
(3)雙向電泳蛋白樣品與考馬斯亮藍(lán)R-250混合溶液制備:取一支離心管，標(biāo)記為9號，加入待測濃度的雙向電泳蛋白樣品溶液100 μ L，用超純水補(bǔ)足lmL，再加入0.01%考馬斯亮藍(lán)R-250染液5mL，充分混勻，待測；
(4)加樣:將離心管中的混合溶液充分混勻后。取24孔板一塊，從1-8號離心管中各取混合液1000 μ L，分別加入到第一排6個孔和第二排1，2孔；從9號中取混合液1000 μ L，分別加入到第三排的第I個孔；
(5)掃描并框選熒光強(qiáng)度:加樣完成后迅速將24孔板去蓋后用基因有限公司L1-COR的Odyssey近紅外熒光 成像系統(tǒng)，選擇成像區(qū)域后用680nm通道掃描成像，并框選熒光區(qū)域(孔板各孔的圓形熒光區(qū)域)；
(6)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:記錄680nm通道下的熒光強(qiáng)度，以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合溶液為橫坐標(biāo)(X)，對應(yīng)的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)(Y)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為I = 35.245x +1.639，R2 = 0.9899 ；
(7)計算雙向電泳蛋白樣品的濃度:將待測蛋白G-250蛋白樣品孔的熒光強(qiáng)度7.52代入回歸方程，計算得雙向電泳蛋白樣品的濃度為0.17mg/mL，則原液濃度為0.17X10 (稀釋倍數(shù))=1.70 mg/mL。
[0015]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，任何未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種雙向電泳蛋白質(zhì)樣品的定量方法，包括如下步驟:雙向電泳蛋白樣品制備:取不同來源的生物樣品IO-1OOmgJp l_5mL雙向電泳細(xì)胞裂解液，重懸后收集于離心管冰上超聲，每次超聲IOs,暫停IOs,共計5個循環(huán)jX^HOOOg離心30min,將上清轉(zhuǎn)移至新離心管，分裝后_80°C保存，得雙向電泳蛋白樣品； (2)用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的制備:用雙向電泳細(xì)胞裂解液配制l-2mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液，取8支離心管，分別加入0-200 μ L牛血清白蛋白溶液，并用超純水補(bǔ)足至lmL，使標(biāo)準(zhǔn)蛋白的終濃度為0-0.2mg.rnL—1，然后每支離心管中加入0.01%考馬斯亮藍(lán)G-250或R-250染液5mL，充分混勻，得不同濃度標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，待測； (3)雙向電泳蛋白樣品混合溶液制備:取10-100μ L雙向電泳蛋白樣品加入離心管中，用超純水補(bǔ)足至lmL，再加入0.01%考馬斯亮藍(lán)G-250或R-250染液5mL，充分混勻，待測； (4)加樣:取孔板一塊，在各孔中分別加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)混合溶液和雙向電泳蛋白樣品混合溶液200-1000 μ L ； (5)掃描并框選熒光強(qiáng)度:加樣完成后迅速將孔板去蓋后用基因公司L1-COR的Odyssey近紅外熒光成像系統(tǒng)，在680nm通道下掃描成像，并框選熒光區(qū)域； (6)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:記錄各孔的熒光強(qiáng)度，以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合溶液為橫坐標(biāo)(X)，對應(yīng)的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)(Y)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程； (7)計算雙向電泳蛋白樣品的濃度:將雙向電泳蛋白樣品混合溶液孔的熒光強(qiáng)度代入回歸方程，即可計 算出待雙向電泳蛋白樣品的終濃度，在終濃度基礎(chǔ)上乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即是雙向電泳蛋白樣品原液的濃度。
2.如權(quán)利要求1所述的一種雙向電泳蛋白質(zhì)樣品的定量方法，其中:步驟(1)中雙向電泳細(xì)胞裂解液中含有:7-9mol/L尿素、0-2mol/L硫脲、質(zhì)量濃度4%的3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽、65mmol/L 二硫蘇糖醇。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種雙向電泳蛋白質(zhì)樣品的定量方法，其中:步驟(4)中孔板的規(guī)格為24、48或96孔。
【文檔編號】G01N21/64GK104020145SQ201410227258
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年5月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月27日
【發(fā)明者】劉云, 曹嵩, 李曉飛, 朱欣婷, 胡姍姍, 卜雯雯, 鄧文文, 劉仕福 申請人:遵義醫(yī)學(xué)院