專利名稱：一種定量分析蛋白質(zhì)間相互作用的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域中蛋白質(zhì)間相互作用的定量分析方法，特別是涉 及一種將雙熒光素酶(螢火蟲(chóng)熒光素酶Firefly Luciferase，F(xiàn)lue和海腎熒光素酶 RennilaLuciferase, Rluc)用于定量分析蛋白質(zhì)間相互作用的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)間相互作用是各種生理活動(dòng)的基礎(chǔ)，與細(xì)胞的各種生命活動(dòng)緊密相關(guān)。由 于很多疾病的發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)過(guò)強(qiáng)或過(guò)弱等不正常的蛋白質(zhì)間的相互作用密切相關(guān)，很多藥 物也通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)間相互作用的強(qiáng)弱實(shí)現(xiàn)治療作用，因此，研究蛋白質(zhì)間的相互作用，能 更好地理解各種疾病的發(fā)病機(jī)制、并發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶標(biāo)。鑒定蛋白質(zhì)相互作用的方法多種多樣。經(jīng)典的免疫共沉淀(Co-IP)、Pull down技 術(shù)只能對(duì)蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行半定量分析。酵母雙雜交、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、生物發(fā) 光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)、表面等離子體共振(SPR)、串聯(lián)親和純化技術(shù)(TAP)、蛋白質(zhì)片段 互補(bǔ)分析(PCA)和雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(BIFC)等方法，可用于鑒定體內(nèi)外蛋白質(zhì)之間的相 互作用?；诨瘜W(xué)發(fā)光定量檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用的方法有PCA、LUMIER和LuMPIS等，PCA 只能對(duì)兩種蛋白發(fā)生相互作用的總量進(jìn)行確定，無(wú)法對(duì)發(fā)生相互作用的其中任何一種蛋白 進(jìn)行定量；LUMIER和LuMPIS僅能對(duì)發(fā)生相互作用的其中一種蛋白進(jìn)行定量。盡管上述各種方法的綜合應(yīng)用已經(jīng)鑒定了成千上萬(wàn)種蛋白質(zhì)的相互作用，但很多 蛋白質(zhì)間的精確定量信息仍然未知，例如相互作用的各種蛋白質(zhì)的量、它們之間的相對(duì)分 子數(shù)、以及發(fā)生相互作用蛋白與細(xì)胞內(nèi)所有同種蛋白的比例等。精確定量分析蛋白質(zhì)間的 相互作用的方法的缺乏，仍然制約著對(duì)包括致病機(jī)制在內(nèi)的很多生物學(xué)過(guò)程的理解。因此， 發(fā)展簡(jiǎn)單、靈敏、高效、定量分析蛋白質(zhì)間的相互作用的新方法仍然亟待研究探索。熒光素酶(Luc)是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的統(tǒng)稱。雙熒光素酶報(bào)告基因 (DLR)檢測(cè)系統(tǒng)是Promega公司開(kāi)發(fā)的，應(yīng)用兩種不同底物同時(shí)定量檢測(cè)兩種熒光素酶活 性的生物發(fā)光分析系統(tǒng)，可對(duì)同一樣品中的兩個(gè)報(bào)告基因-Flue和Rluc的表達(dá)水平同時(shí)進(jìn) 行定量測(cè)定。樣品與底物混合后，能在20秒內(nèi)完成DLR定量檢測(cè)，靈敏度在pg級(jí)，是靈敏 度為ng級(jí)的Western Blot的約103倍，因此該系統(tǒng)具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。DLR通常 用于研究啟動(dòng)子、增強(qiáng)子的活性和研究基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制。檢測(cè)基因表達(dá)時(shí)通常將雙報(bào) 告基因(即帶有實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因的載體和帶有不同的報(bào)告基因作為內(nèi)對(duì)照的載體)共轉(zhuǎn)染細(xì) 胞，報(bào)告基因表達(dá)活性的改變反映啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的改變，實(shí)驗(yàn)中作為內(nèi)對(duì)照的第二個(gè)報(bào) 告基因，能使實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因的檢測(cè)均一化，從而減少實(shí)驗(yàn)的變化因素，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。由于雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)(DLR assay system)能快速、簡(jiǎn)便、靈敏地對(duì)裂解細(xì)胞 中兩種熒光素酶的表達(dá)水平進(jìn)行定量檢測(cè)，因此用DLR assay取代蛋白質(zhì)相互作用傳統(tǒng)研 究方法Pull down中的蛋白檢測(cè)步驟，建立一種無(wú)需SDS-PAGE、無(wú)需Western Blot、無(wú)需雜 交抗體，同時(shí)又能定量檢測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用的快速、靈敏、簡(jiǎn)便的新方法，在理論上存 在可能性。
那么如何才能用DLR assay取代Pull down實(shí)驗(yàn)中的蛋白檢測(cè)步驟？可通過(guò)將 Flue和Rluc分別與Pull down的目的蛋白X和預(yù)測(cè)蛋白Y分別融合表達(dá)，融合蛋白在細(xì)胞 內(nèi)或細(xì)胞外孵育后進(jìn)行純化，通過(guò)定量檢測(cè)純化得到的Flue和Rluc活性則可確定蛋白X、 Y之間發(fā)生相互作用的情況。如果預(yù)測(cè)蛋白Y與目的蛋白X之間存在相互作用，Y通過(guò)與X 的結(jié)合而被檢測(cè)到，用DLR assay可對(duì)與磁珠結(jié)合的Fluc-X和Rluc-Y融合蛋白的Flue、 Rluc活性進(jìn)行高靈敏定量檢測(cè)，相互作用越強(qiáng)，沉淀下來(lái)的Rluc相對(duì)于Flue的比值就會(huì)越 高。反之，如果預(yù)測(cè)蛋白Y與目的蛋白X之間不存在相互作用，沉淀下來(lái)只有Fluc-X融合 蛋白，沒(méi)有Rluc-Y融合蛋白，雙熒光素酶系統(tǒng)就只能定量檢測(cè)到Flue活性，而不能檢測(cè)到 Rluc活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的定量分析蛋白質(zhì)間相互作用的方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種定量分析蛋白質(zhì)間相互作 用的方法，是將Flue和Rluc分別與要定量分析相互作用的目的蛋白X和預(yù)測(cè)蛋白Y融合 表達(dá)，融合蛋白F1UC-X、R1UC-Y結(jié)合純化后用DLR對(duì)相互作用蛋白的量進(jìn)行精確定量，并對(duì) 表達(dá)蛋白的總量進(jìn)行精確定量，還可對(duì)相互作用蛋白之間的分子數(shù)量比例進(jìn)行定量。所述定量分析相互作用的對(duì)象目的蛋白X與預(yù)測(cè)蛋白Y可以是任何蛋白、多肽或 其它能與Flue、Rluc藕聯(lián)的化合物。所述將Flue和Rluc分別與目的蛋白X和預(yù)測(cè)蛋白Y融合表達(dá)的方法為先構(gòu)建 Fluc-X融合蛋白表達(dá)載體和Rluc-Y融合蛋白表達(dá)載體，再使融合蛋白共表達(dá)或分別表達(dá) 再進(jìn)行體外共同孵育。所述Flue和Rluc與蛋白X和Y的融合方式可以通過(guò)N端和C端分別進(jìn)行。具體來(lái)講，所述融合蛋白Fluc-X表達(dá)載體為生物素化融合蛋白表達(dá)載體，是將 Flue基因插入真核表達(dá)載體pHAVI形成的報(bào)告基因表達(dá)載體，X蛋白基因與Flue基因融合 后得到。所述融合蛋白R(shí)luc-Y表達(dá)載體是Rluc基因插入真核表達(dá)載體pCI-Flag形成的 報(bào)告基因表達(dá)載體，Y蛋白基因與Rluc基因融合后得到。所述生物素化融合蛋白Fluc-X表達(dá)載體和融合蛋白R(shí)luc-Y的報(bào)告基因表達(dá)載體 的表達(dá)可在細(xì)菌、體外細(xì)胞水平表達(dá)，或通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方式在動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞中表達(dá)，也可通 過(guò)體外翻譯系統(tǒng)進(jìn)行合成表達(dá)。所述融合蛋白Fluc-X或Rluc-Y的純化，可以通過(guò)在融合蛋白上添加標(biāo)簽分子，如 生物素、6xHis、MBP或Flag等其它所有可用的標(biāo)簽分子，通過(guò)標(biāo)簽分子與其配基或抗體的 特異性結(jié)合進(jìn)行純化?；蛘卟惶砑訕?biāo)簽，直接用Flue、Rluc抗體或針對(duì)融合蛋白的抗體進(jìn) 行純化。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種定量分析蛋白質(zhì)間相互作用的試劑盒。本發(fā)明所提供的試劑盒，包括生物素化Flue融合表達(dá)載體pHAVI、Rluc融合表達(dá) 載體pCIRl-Flag和鏈親和素磁珠。本發(fā)明提供一種將雙熒光素酶(螢火蟲(chóng)熒光素酶Firefly Luciferase，F(xiàn)lue和海 腎熒光素酶Rermila Luciferase, Rluc)用于定量分析蛋白質(zhì)間相互作用的方法。由于純化得到的Flue和Rluc融合蛋白與蛋白Y與X之間相互作用的強(qiáng)弱和加入樣品總量相關(guān)，因 此該方法能對(duì)蛋白質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行精確定量測(cè)定。本發(fā)明建立的方法不僅能對(duì)發(fā)生 相互作用的任何一種蛋白、兩種蛋白總量進(jìn)行定量，而且能對(duì)細(xì)胞中表達(dá)的待鑒定相互作 用的兩種蛋白分別進(jìn)行定量，可用于對(duì)發(fā)生相互作用的其中一種蛋白與它在細(xì)胞中表達(dá)蛋 白總量的比例進(jìn)行精確定量。這種定量分析方面的優(yōu)勢(shì)是現(xiàn)有方法所不具備的，能夠避免 由于蛋白表達(dá)量的變化造成的假陰性和假陽(yáng)性的出現(xiàn)。該方法能同時(shí)定量測(cè)定相互作用蛋 白，即不同熒光素酶融合蛋白(目的蛋白Fluc-X和預(yù)測(cè)蛋白R(shí)luc-Y)的絕對(duì)量，具體的，該 應(yīng)用是通過(guò)用DLR試劑盒定量測(cè)定純化得到的Fluc-X融合蛋白和Rluc-Y融合蛋白的DLR 活性，從而對(duì)蛋白Y與X之間相互作用的強(qiáng)弱進(jìn)行定量評(píng)價(jià)，可用于確定蛋白質(zhì)的功能等、 研究與疾病相關(guān)的分子致病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)鑒定新的藥物作用靶標(biāo)等。利用本發(fā)明提供的定量 分析蛋白質(zhì)相互作用方法，可快速、靈敏、簡(jiǎn)便、定量分析蛋白質(zhì)間的相互作用，具有較高的 實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，在生物學(xué)、醫(yī)藥、化學(xué)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖1為本發(fā)明定量分析蛋白間相互作用的方法示意2A為DLR定量分析Flue和Rluc之間相互作用結(jié)果-細(xì)胞裂解液中的Flue和 Rluc活性圖2B為DLR定量分析Flue和Rluc之間相互作用結(jié)果-鏈親和素磁珠結(jié)合的Flue 和Rluc活性圖3為DLR定量確定Rluc/Fluc活性比系數(shù)結(jié)果圖 4 為 Western blot 鑒定 HAVI-Fluc，HAVI-Fluc-MAVS，Rluc，Rluc_TRAF3 在 293 細(xì)胞中表達(dá)圖5A為DLR定量分析MAVS-TRAF3之間相互作用，表示Rluc_TRAF3能特異地結(jié)合 HAVI-Fluc-MAVS圖5B為DLR定量分析MAVS-TRAF3之間相互作用，表示鏈親和素磁珠結(jié)合的 Rluc-TRAF3 與 HAVI-Fluc MAVS 的活性比值圖6為Pull down確證MAVS-TRAF3之間存在相互作用
具體實(shí)施例方式本發(fā)明是基于發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的Flue和Rluc之間不存在相互作用的特性，構(gòu)建了生 物素化Flue表達(dá)載體和Rluc表達(dá)載體，將要定量分析的蛋白X和Y分別插入上述載體，得 到生物素化Fluc-X融合蛋白表達(dá)載體和Rluc-Y融合蛋白表達(dá)載體，兩種融合蛋白共表達(dá)， 或分別表達(dá)再進(jìn)行體外共同孵育后，通過(guò)鏈親和素包被的磁珠純化生物素化Fluc-X，然后 用DLR測(cè)定純化得到的Fluc-X融合蛋白和Rluc-Y融合蛋白的DLR活性。由于純化的Flue 和Rluc的活性與加入融合蛋白的量和蛋白X、Y之間相互作用的強(qiáng)弱密切相關(guān)，因此該方法 可定量確定蛋白Y與X之間相互作用的強(qiáng)弱。下面以具體實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的設(shè)計(jì)。應(yīng)該理解，以下實(shí)施例不構(gòu)成對(duì)本發(fā) 明的限制，基于本發(fā)明的設(shè)計(jì)思想，實(shí)施中所述報(bào)告基因HAVI-Fluc-X和Rluc-Y融合蛋白指示載體的表達(dá)可在細(xì)菌中表達(dá)，也可在體外細(xì)胞水平表達(dá)，或通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方式在動(dòng) 物體內(nèi)表達(dá)。所述報(bào)告基因HAVI-Fluc-X和Rluc-Y的融合方式也可為HAVI-X-Fluc和 Y-Rluc。所述Fluc-X或Rluc-Y的純化，可以通過(guò)在融合蛋白上添加標(biāo)簽分子，如生物素、 6xHis、MBP、或Flag等其它所有可用的標(biāo)簽分子，通過(guò)標(biāo)簽分子與其配基、或抗體的特異性 結(jié)合進(jìn)行純化?；蛘邲](méi)有標(biāo)簽，直接用F1UC、R1UC抗體或針對(duì)融合蛋白的抗體進(jìn)行純化。下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。具體操作中，PCR擴(kuò)增中所 用的酶為Invitrogen公司產(chǎn)品，酶切、連接中所有限制性內(nèi)切酶均為NEB公司產(chǎn)品，轉(zhuǎn)化感 受態(tài)菌為Transgen公司產(chǎn)品，序列分析由奧科進(jìn)行測(cè)定。實(shí)施例1、Flue與Rluc之間相互作用的定量分析如圖1所示，本發(fā)明定量分析蛋白質(zhì)間相互作用的方法包括以下步驟一、生物素化Flue表達(dá)載體和Rluc表達(dá)載體的構(gòu)建pHAVI載體構(gòu)建將EMCV IRES序列和birA基因通過(guò)SacII酶切位點(diǎn)連接，插入 pCIneo (Promega)的Smal和NotI酶切位點(diǎn)之間，然后將6xHis、Avi表位的編碼序列插入 含EMCV IRES和birA的載體得到生物素化表達(dá)載體pHAVI。以pGL3_Basic(Promega公司)為模板，在引物Flue F和Flue R的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增 得到Flue基因序列，F(xiàn)lue基因經(jīng)Sail和Xhol雙酶切，插入pHAVI載體的Xhol酶切位點(diǎn)，序 列分析證明獲得了插入方向及序列均正確的生物素化Flue表達(dá)載體，命名為pHAVI-Fluc。Flue F:TC GTCGAC ATGGAAGACGCCAAAAACATAAAFlue R :CG CTCGAG AGATCCAGAGCCCACGGCGATCTTTCCGCCCTT將Flag表位編碼序列插入pCIneo (Promega)的Sail和NotI酶切位點(diǎn)之間構(gòu)建 pCI-Flag表達(dá)載體。然后以pRL-TK (Promega公司)為模板，在引物Rluc F和RlucR的引 導(dǎo)下PCR擴(kuò)增得到Rluc基因序列，Rluc基因經(jīng)Nhel和Xhol雙酶切，插入pCI-Flag載體 的Nhel和Xhol酶切位點(diǎn)之間，序列分析證明獲得了插入方向及序列均正確的Rluc表達(dá)載 體,命名為 pCIRluc-Flag。Rluc F :AG GCTAGC ATGACTTCGAAAGTTTATGATRluc R :AG CTCGAG TTGTTCATTTTTGAGAACTCGCT二、生物素化Flue和Rluc在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)在24 孔板中用真核表達(dá)載體 CMV_Fluc(Biotechnol Lett, 2009, 31 1151-1157)和 pCI-Rluc，pHAVI-Fluc 和 pCI-Rluc 分別共轉(zhuǎn)染 HEK293 細(xì)胞。培養(yǎng)基 選用含有10%胎牛血清、25U/mL青霉素、25 ii g/mL鏈霉素的DMEM (GIBC0)。轉(zhuǎn)染使用 LipofectamindOOOanvitrogen)，轉(zhuǎn)染的步驟按照廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染24_48h后加入 收集細(xì)胞，PBS洗2次后，加入30ul 1XPLB (Promega)裂解細(xì)胞，細(xì)胞裂解液中DLR用DLR 試劑盒(Promega)在化學(xué)發(fā)光儀中進(jìn)行測(cè)定。三、Flue與Rluc之間的相互作用確定20ul鏈親和素磁珠PBS洗2次后重懸于50ul PBS中，加入2ul共表達(dá)Flue和 Rluc，或pHAVI-Fluc和Rluc的細(xì)胞裂解液，室溫孵育lh后，用含Nonidet P-40的PBS 洗2次，PBS洗1次后，重懸于50ul PBS中用DLR試劑盒(Promega)在化學(xué)發(fā)光儀中進(jìn)行測(cè) 定。結(jié)果Fluc/Rluc活性的比值在500-2000倍之間，說(shuō)明鏈親和素磁珠能與細(xì)胞裂解液中 的Flue結(jié)合并被定量檢測(cè)到，但與之共表達(dá)的Rluc沒(méi)有結(jié)合(圖2A表示細(xì)胞裂解液中的Flue和Rluc活性，圖2B表示鏈親和素磁珠結(jié)合的Flue和Rluc活性)，提示Flue和Rluc 之間不存在相互作用。該檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明用DLR assay對(duì)發(fā)生相互作用的蛋白進(jìn)行定量，不 但在理論上存在可能性，而且在實(shí)踐上可行，能操作，為應(yīng)用DLR定量分析蛋白質(zhì)相互作用 新方法的建立提供了最關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持，同時(shí)優(yōu)化了定量分析方法的實(shí)驗(yàn)步驟。三、Rluc/Fluc的活性比率確定將Flue用Xhol和Smal酶切，插入pCIRluc_Flag的Xhol和EcoRV位點(diǎn)之間得到 pCIRluc-Fluc 載體。將 Rluc 用 Xbal 和 Smal 酶切，插入 pHAVI-Fluc 的 Xhol 和 EcoRV 位點(diǎn) 之間得到pHAVI-Fluc-Rluc載體。在24孔板中用真核表達(dá)載體pCIRluc-Fluc和pHAVI-Fluc-Rluc轉(zhuǎn)染HEK293細(xì) 胞，轉(zhuǎn)染24-48h后收集細(xì)胞并用30ul PLB裂解。2ul細(xì)胞裂解液重懸于50ul PBS中，用 DLR試劑盒(Promega)在化學(xué)發(fā)光儀中進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果細(xì)胞裂解液中Rluc與Flue的活性 比值在13左右(參見(jiàn)圖3)。說(shuō)明用DLR assay不但能對(duì)發(fā)生相互作用的蛋白進(jìn)行定量，而 且能精確確定相互作用蛋白的分子數(shù)量比例。實(shí)施例2、定量分析MAVS-TRAF3之間的相互作用本發(fā)明定量分析蛋白質(zhì)間相互作用的方法包括以下步驟一、生物素化Fluc-MAVS表達(dá)載體和Rluc_TRAF3表達(dá)載體的構(gòu)建將MAVS基因序列經(jīng)Xhol和Mlul雙酶切，插入表達(dá)載體pHAVI_Fluc的Xhol和 Mlul酶切位點(diǎn)之間，得到生物素化Flue表達(dá)載體pHAVI-Fluc-MAVS。TRAF3基因序列經(jīng)Xhol和Mlul雙酶切，插入表達(dá)載體pCIRluc-Flag的Xhol和 Mlul酶切位點(diǎn)之間，得到表達(dá)載體pCIRluc-TRAF3。二、生物素化Fluc-MAVS和Rluc_TRAF3在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)鑒定用生物素化Fluc-MAVS表達(dá)載體和Rluc_TRAF3表達(dá)載體在24孔板中共轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染使用LipofectamindOOOanvitrogen)，轉(zhuǎn)染的步驟按照廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn) 行。轉(zhuǎn)染48-72h后加入收集細(xì)胞，PBS洗2次后，加入15ul 1 XPLB (Promega)裂解細(xì)胞， 細(xì)胞裂解液中進(jìn)行SDS-PAGE電泳，Western Blot用HRP標(biāo)記的鏈親和素和抗Flag抗體 (Abmart)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明生物素化Fluc-MAVS和Rluc_TRAF3均正確表達(dá)(參見(jiàn)圖4)。三、定量分析MAVS-TRAF3之間的相互作用在24 孔板中將 pHAVI-Fluc 和 pCIRluc，pHAVI-Fluc-MAVS 和 pCIRluc，pHAVI-Fluc 和 pCIRluc-TRAF3-Flag，pHAVI-Fluc-MAVS 和 pCIRluc-TRAF3_Flag 表達(dá)載體分別共轉(zhuǎn) 染HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染使用LipofectamindOOOanvitrogen)，轉(zhuǎn)染的步驟按照廠家說(shuō)明 書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染24-48h后加入收集細(xì)胞，PBS洗2次后，加入30ul 1 XPLB (Promega)裂 解細(xì)胞，細(xì)胞裂解液中DLR用DLR試劑盒(Promega)在化學(xué)發(fā)光儀中進(jìn)行測(cè)定。然后， 20ul鏈親和素磁珠(Promega) PBS洗2次后重懸于50ul PBS中，加入2ul細(xì)胞裂解液，室 溫孵育lh后，用含Nonidet P_40的PBS洗2次，PBS洗1次后，重懸于50ul PBS中 用DLR試劑盒(Promega)在化學(xué)發(fā)光儀中進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示Rluc_TRAF3能特異地結(jié) 合HAVI-Fluc-MAVS, DLR定量分析結(jié)果顯示Rluc_TRAF3與結(jié)合的HAVI-Fluc_MAVS之間 的比值為228%，與HAVI-Fluc-MAVS結(jié)合的Rluc_TRAF3占細(xì)胞中全部Rluc_TRAF3蛋白 的 1. 8 % (圖 5A 表示 Rluc-TRAF3 能特異地結(jié)合 HAVI-Fluc-MAVS,與 HAVI-Fluc-MAVS 結(jié) 合的R1UC-TRAF3占細(xì)胞中全部Rluc_TRAF3蛋白的1. 8%，圖5B表示鏈親和素磁珠結(jié)合的Rluc-TRAF3 與 HAVI-Fluc_MAVS 的活性比值為 228% )。四、Pull down驗(yàn)證MAVS-TRAF3之間的相互作用在6 孔板上用 pHAVI 和 Flag-MAVS，HAVI-TRAF3 禾P pCI-Flag，HAVI-TRAF3 和 Flag-MAVS 表達(dá)載體分別共轉(zhuǎn)染 HEK293 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染使用 Lipofectamine2000(Invitrogen)， 轉(zhuǎn)染的步驟按照廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染48-72h后加入收集細(xì)胞，PBS洗2次后，加入60ul lXPLB(Promega)裂解細(xì)胞。45ul細(xì)胞裂解液與200ul鏈親和素磁珠(Promega)在室溫孵 育lh后，用含RIPA緩沖液、RIPA高鹽緩沖液、RIPA緩沖液(RIPA緩沖液150mM NaCl,50mM Tris,2mM EDTA, 1 % Nonidet P-40,0. 1% SDS,pH 8.0 ；RIPA高鹽緩沖液500mM NaCl,50mM Tris,2mM EDTA, 1 % Nonidet P-40,0. 1% SDS,pH 8. 0)洗 3 次后，重懸于 lOul RIPA 中。樣 品進(jìn)行6%或8%的SDS-PAGE電泳，Western Blot用HRP標(biāo)記的鏈親和素和抗Flag抗體 進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示HAVI-TRAF3能特異地結(jié)合Flag-MAVS，說(shuō)明MAVS-TRAF3之間存在相互 作用(圖6，PD :SA表示用鏈親和素磁珠Pull down, WCL表示細(xì)胞裂解液)，從而進(jìn)一步證 明本發(fā)明的方法能用于定量分析蛋白質(zhì)間的相互作用。實(shí)施例3、定量分析蛋白質(zhì)間相互作用的試劑盒 將生物素化Flue融合表達(dá)載體pHAVI、Rluc融合表達(dá)載體pCIRl-Flag和鏈親和 素磁珠共同包裝，得到本發(fā)明定量分析蛋白質(zhì)間相互作用的試劑盒。
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權(quán)利要求
一種定量分析蛋白質(zhì)間相互作用的方法，是將Fluc和Rluc分別與要定量分析相互作用的目的蛋白X和預(yù)測(cè)蛋白Y融合表達(dá)，融合蛋白Fluc X、Rluc Y結(jié)合純化后用DLR對(duì)相互作用蛋白的量進(jìn)行精確定量，并對(duì)表達(dá)蛋白的總量進(jìn)行精確定量，還可對(duì)相互作用蛋白之間的分子數(shù)量比例進(jìn)行定量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述定量分析相互作用的對(duì)象目的蛋白X 與預(yù)測(cè)蛋白Y可以是任何蛋白、多肽或其它能與Flue、Rluc藕聯(lián)的化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述將Flue和Rluc分別與目的蛋 白X和預(yù)測(cè)蛋白Y融合表達(dá)的方法為先構(gòu)建Fluc-X融合蛋白表達(dá)載體和Rluc-Y融合蛋 白表達(dá)載體，再使融合蛋白共表達(dá)或分別表達(dá)再進(jìn)行體外共同孵育。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述Flue和Rluc與蛋白X和Y的融合 方式可以通過(guò)N端和C端分別進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述融合蛋白Fluc-X表達(dá)載體為生物素 化融合蛋白表達(dá)載體，是將Flue基因插入真核表達(dá)載體pHAVI形成的報(bào)告基因表達(dá)載體， X蛋白基因與Flue基因融合后得到。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述融合蛋白R(shí)luc-Y表達(dá)載體是Rluc基 因插入真核表達(dá)載體pCI-Flag形成的報(bào)告基因表達(dá)載體，Y蛋白基因與Rluc基因融合后 得到。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述生物素化融合蛋白Fluc-X表達(dá)載體 和融合蛋白R(shí)luc-Y的報(bào)告基因表達(dá)載體的表達(dá)可在細(xì)菌、體外細(xì)胞水平表達(dá)，或通過(guò)轉(zhuǎn)基 因的方式在動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞中表達(dá)，也可通過(guò)體外翻譯系統(tǒng)進(jìn)行合成表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一所述的方法，其特征在于所述融合蛋白Fluc-X或Rluc-Y 的純化，可以通過(guò)在融合蛋白上添加標(biāo)簽分子，如生物素、6xHis、MBP或Flag等其它所有可 用的標(biāo)簽分子，通過(guò)標(biāo)簽分子與其配基或抗體的特異性結(jié)合進(jìn)行純化；或者不添加標(biāo)簽，直 接用Flue、Rluc抗體或針對(duì)融合蛋白的抗體進(jìn)行純化。
9 權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述方法在定量分析蛋白質(zhì)間相互作用中或在確定蛋白質(zhì)的 功能、研究與疾病相關(guān)的分子致病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)鑒定新的藥物作用靶標(biāo)中的應(yīng)用。
10.一種定量分析蛋白質(zhì)間相互作用的試劑盒，包括生物素化Flue融合表達(dá)載體 pHAVI、Rluc融合表達(dá)載體pCIRl-Flag和鏈親和素磁珠。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種定量分析蛋白質(zhì)間相互作用的方法及其應(yīng)用。該方法是將Fluc和Rluc分別與要定量分析相互作用的目的蛋白X和預(yù)測(cè)蛋白Y融合表達(dá)，融合蛋白Fluc-X、Rluc-Y結(jié)合純化后用DLR對(duì)相互作用蛋白的量進(jìn)行精確定量，并對(duì)表達(dá)蛋白的總量進(jìn)行精確定量，還可對(duì)相互作用蛋白之間的分子數(shù)量比例進(jìn)行定量。利用本發(fā)明的定量分析蛋白質(zhì)相互作用方法可快速、靈敏、簡(jiǎn)便、定量分析蛋白質(zhì)間的相互作用，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，在生物學(xué)、醫(yī)藥、化學(xué)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101982778SQ201010285778
公開(kāi)日2011年3月2日 申請(qǐng)日期2010年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月17日
發(fā)明者彭劍淳, 詹林盛, 賈帥爭(zhēng) 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所