專利名稱：一種蛋白質(zhì)定量分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于化學(xué)分析領(lǐng)域，尤其涉及一種蛋白質(zhì)材料定量分析的方法，特別用于指導(dǎo)真絲、合成蛋白質(zhì)纖維、羽絨等材料的低損傷加工工藝的優(yōu)化與表征。
背景技術(shù)：
目前的蛋白質(zhì)成分的標(biāo)準(zhǔn)定量分析方法是基于N元素含量測(cè)試的凱氏定氮法，這種方法的最大問題是只認(rèn)N元素，而不考慮其來源，這就給食品、材料等領(lǐng)域中的蛋白質(zhì)分析帶來很多的麻煩，乃至給不法分子提供了可乘之機(jī)，如在奶粉中添加含N量極高的三聚氰胺，造成了及其惡劣的社會(huì)問題。同時(shí)，絲綢、羊毛、羽絨等蛋白質(zhì)纖維在染整加工、服用過程中，當(dāng)經(jīng)受不合適的酸堿、氧化劑等化學(xué)藥劑，或使用中的紫外光照、熱量等外在因素的影響，會(huì)造成蛋白質(zhì)成分損失。中國(guó)專利號(hào)為CN200910172516.3公開了一種食品中蛋白質(zhì)含量快速檢測(cè)方法，根據(jù)樣品中蛋白質(zhì)與檢測(cè)試劑起顯色反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物在610nm處有最大吸收峰，通過比較不同濃度蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的Abs61tl(吸光度)值，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而計(jì)算待測(cè)物中蛋白質(zhì)的含量，該檢測(cè)方法具有檢測(cè)方便、測(cè)量速度快且檢測(cè)成本較低等優(yōu)點(diǎn)，可以滿足快速檢測(cè)蛋白質(zhì)的需要。但這種檢測(cè)方法且需要配制較為復(fù)雜的溶液，十二烷基鹽組合等多種助劑的加入將使溶液渾濁，直接影響測(cè)量吸光度值的準(zhǔn)確性，且蛋白質(zhì)材料中多糖類等其他非蛋白質(zhì)成分可與染料形成基色，測(cè)量不能真實(shí)反映蛋白質(zhì)吸光值，并且本方法測(cè)量對(duì)象較為局限。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種準(zhǔn)確度高、實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便易行的蛋白質(zhì)材料中蛋白質(zhì)定量分析的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為提供一種蛋白質(zhì)定量分析方法，包括如下步驟:(I)制備芳香胺類重氮鹽；(2)蛋白質(zhì)材料與芳香胺類重氮鹽進(jìn)行重氮偶合；(3)對(duì)上述重氮偶合產(chǎn)物進(jìn)行光譜測(cè)試；(4)根據(jù)光譜特征建立吸光度與酪氨酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線；(5)取待測(cè)樣品經(jīng)上述前三個(gè)步驟處理后得到其重氮偶合產(chǎn)物的吸光度；(6)根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系推導(dǎo)出其酪氨酸含量；(7)根據(jù)待測(cè)樣品的酪氨酸含量，推導(dǎo)出其蛋白質(zhì)含量。優(yōu)選的，所述的蛋白質(zhì)材料為絲素粉、絲素膜、酪素、羊毛粉、真絲、合成蛋白質(zhì)纖維或羽絨材料。優(yōu)選的，所述的芳香胺類重氮鹽為苯胺重氮鹽、鄰硝基苯胺重氮鹽、間硝基苯胺重氮鹽、對(duì)硝基苯胺重氮鹽或者間苯二胺重氮鹽。優(yōu)選的，所述的蛋白質(zhì)材料為親水性，將蛋白質(zhì)材料與重氮鹽進(jìn)行浸染偶合工藝。
優(yōu)選的，所述的蛋白質(zhì)材料為疏水性，將蛋白質(zhì)材料溶于有機(jī)溶劑后再與重氮鹽進(jìn)行浸染偶合工藝。優(yōu)選的，所述的吸光度采用分光光度計(jì)測(cè)試。采用本發(fā)明的技術(shù)方案，不需要對(duì)蛋白質(zhì)材料進(jìn)行水解，消除了水解過程對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)試精確度的影響，同時(shí)本發(fā)明還可以消除含N元素色素或染料對(duì)材料蛋白質(zhì)分析結(jié)果的影響，本方法簡(jiǎn)便易行、測(cè)量更準(zhǔn)確、測(cè)試對(duì)象更廣，通過對(duì)偶合反應(yīng)溫度和時(shí)間的控制，得到的重氮偶合產(chǎn)物較純，便于后面光譜測(cè)量的進(jìn)行。對(duì)于蛋白質(zhì)材料采取浸染偶和工藝使蛋白材料與重氮鹽充分發(fā)生偶合反應(yīng)。對(duì)于親水性蛋白質(zhì)材料，保證重氮鹽稍過量；對(duì)于疏水性蛋白質(zhì)材料，將材料溶于有機(jī)溶劑，便于偶合反應(yīng)的充分進(jìn)行。本發(fā)明方法為蛋白質(zhì)定量分析提供一種全新的思路，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，具有重要的科學(xué)意義和實(shí)際應(yīng)用的價(jià)值。


圖1是本發(fā)明酪氨酸殘基重氮偶合反應(yīng)機(jī)理圖；圖2是本發(fā)明的偶合反應(yīng)裝置，其中:1_攪拌機(jī)，2-溫度計(jì)，3-滴液漏斗，4-三口燒瓶，5-低溫浴槽；圖3是本發(fā)明實(shí)施例偶合產(chǎn)物的光譜側(cè)視圖；圖4是本發(fā)明根據(jù)光譜特征建立的吸光度與酪氨酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式芳香族伯胺和亞硝酸作用生成重氮鹽的反應(yīng)稱為重氮化。Ar-NH2+2HX+NaN02- — Ar-N2X+NaX+2H20重氮化反應(yīng)要在強(qiáng)酸中進(jìn)行，實(shí)際上是亞硝酸作用于銨離子。由于亞硝酸不穩(wěn)定，通常使用亞硝酸鈉和鹽酸或硫酸，使反應(yīng)生成的亞硝酸立刻與芳伯胺反應(yīng)，避免亞硝酸的分解。為了使反應(yīng)能順利進(jìn)行，必須首先把芳伯胺轉(zhuǎn)化為銨正離子。芳胺的堿性較弱，因此重氮化要在較強(qiáng)的酸中進(jìn)行。有些芳胺堿性非常弱，要用特殊的方法才能進(jìn)行重氮化。重氮化是放熱反應(yīng)，重氮鹽對(duì)熱不穩(wěn)定，因此要在冷卻的情況下進(jìn)行，并調(diào)節(jié)亞硝酸鈉的加入速度，維持反應(yīng)溫度在0°c附近，由于重氮鹽不穩(wěn)定，一般就用它們的溶液，隨做隨用。自重氮化反應(yīng)發(fā)現(xiàn)以來，人們?yōu)榱伺宄浞磻?yīng)的影響因素，對(duì)重氮化反應(yīng)的機(jī)理進(jìn)行了反復(fù)研究，已普遍接受了重氮化反應(yīng)的亞硝化學(xué)說即重氮化反應(yīng)是由亞硝酸產(chǎn)生的親電質(zhì)點(diǎn)對(duì)游離芳伯胺基進(jìn)行親電取代反應(yīng)的機(jī)理。蛋白質(zhì)材料中各氨基酸成分與比例是相對(duì)固定的，材料的聚集態(tài)結(jié)構(gòu)，即無定形區(qū)的比例也是相對(duì)固定的。蛋白質(zhì)材料特別是纖維材料的無定形區(qū)中，各氨基酸殘基可以表現(xiàn)出其特征的反應(yīng)活性，如酪氨酸殘基對(duì)羥基苯亞甲基，即可發(fā)生特征的重氮偶合反應(yīng)。本發(fā)明中蛋白質(zhì)材料中酪氨酸殘基與重氮鹽發(fā)生重氮偶合特征反應(yīng)后，其蛋白質(zhì)母體將會(huì)產(chǎn)生特殊的光譜特性，通過酪氨酸重氮偶合產(chǎn)物特征波長(zhǎng)下吸光度數(shù)值即可定量分析出酪氨酸殘基的含量，進(jìn)而推導(dǎo)出蛋白質(zhì)成分的含量。重氮偶合顯色反應(yīng)機(jī)理如圖1所示。重氮偶合產(chǎn)物具有在紫外可見光譜中，具有特征吸收波長(zhǎng)，吸收峰值與成分含量對(duì)應(yīng)。1、制備芳香胺類重氮鹽:鄰硝基苯胺重氮鹽；在帶有電動(dòng)攪拌機(jī)和冷凝器的三口燒瓶中，加入10± Iml濃鹽酸和10±2ml水，劇烈攪拌，然后緩緩加入0.03±0.0Olmol鄰硝基苯胺，加熱至75°C左右，攪拌使之充分溶解，然后加入冰水，將溫度降至0°C，稱取0.032mol亞硝酸鈉，溶解于水中，向含有鄰硝基苯胺的三口燒瓶中緩慢滴加亞硝酸鈉溶液，并將反應(yīng)溫度保持在0°C，滴加結(jié)束后繼續(xù)反應(yīng)20min，用淀粉-碘化鉀試紙檢測(cè)亞硝酸是否過量，待反應(yīng)結(jié)束后，用尿素除去過量的亞硝酸，再攪拌lOmin，得到澄清透明的鄰硝基苯胺重氮鹽黃色溶液，最后保存在冰水中待用。2、蛋白質(zhì)材料與芳香胺類重氮鹽進(jìn)行重氮偶合；如圖2所示，在帶有電動(dòng)攪拌機(jī)I和冷凝器6的三口燒瓶4中，把絲素粉混合物加入到含有碳酸鈉的溶液，由溫度計(jì)2觀察反應(yīng)溫度，并通過低溫浴槽5使反應(yīng)溫度控制在2°C;劇烈攪拌，然后通過滴液漏斗3逐滴加入鄰硝基苯胺重氮鹽溶液，滴加結(jié)束后繼續(xù)反應(yīng)2h，最后用滲圈法檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)結(jié)束后將其酸析、靜置，隔夜抽濾，室溫下陰干得到黃色重氮偶合產(chǎn)物。3、對(duì)上述重氮偶合產(chǎn)物進(jìn)行光譜測(cè)試；通過分光光度計(jì)的測(cè)試，鄰硝基苯胺重氮鹽與絲素粉的偶合產(chǎn)物在DMF中的吸收光譜如圖3所示，最大吸收波長(zhǎng)處在紫外線的UVA波段，在328nm處有最大吸收峰，記錄此處的吸光度值。4、根據(jù)光譜特征建立吸光度與酪氨酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線；絲素粉中酪氨酸含量是公知的，從而在已知絲素粉混合物濃度的情況下可計(jì)算出酪氨酸的濃度。再通過上述方法測(cè)量不同絲素粉混合物濃度下重氮偶合產(chǎn)物的特征(最大吸收峰值)吸光度值，繪制吸光度-酪氨酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示。5、取待測(cè)樣品經(jīng)上述前三個(gè)步驟處理后得到其重氮偶合產(chǎn)物的吸光度，即特征(最大吸收峰值)吸光度值。6、根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系推導(dǎo)出其酪氨酸含量，即通過吸光度值，根據(jù)吸光度-酪氨酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖可得出其對(duì)應(yīng)的酪氨酸含量。7、根據(jù)待測(cè)樣品的酪氨酸含量，推導(dǎo)出其蛋白質(zhì)含量。酪氨酸含量在蛋白中的占比是固定的，通過氨基酸分析儀測(cè)定待測(cè)樣品中酪氨酸的占比，進(jìn)而通過酪氨酸的含量除以該占比即可推導(dǎo)出蛋白質(zhì)含量。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)定量分析方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)制備芳香胺類重氮鹽； (2)蛋白質(zhì)材料與芳香胺類重氮鹽進(jìn)行重氮偶合； (3)對(duì)上述重氮偶合產(chǎn)物進(jìn)行光譜測(cè)試； (4)根據(jù)光譜特征建立吸光度與酪氨酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線； (5)取待測(cè)樣品經(jīng)上述前三個(gè)步驟處理后得到其重氮偶合產(chǎn)物的吸光度； (6)根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn) 曲線的線性關(guān)系推導(dǎo)出其酪氨酸含量； 根據(jù)待測(cè)樣品的酪氨酸含量，推導(dǎo)出其蛋白質(zhì)含量。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)定量分析方法，其特征在于:所述的蛋白質(zhì)材料為絲素粉、絲素膜、酪 素、羊毛粉、真絲、合成蛋白質(zhì)纖維或者羽絨材料。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的一種蛋白質(zhì)定量分析方法，其特征在于:所述的芳香胺類重氮鹽為苯胺重氮鹽、鄰硝基苯胺重氮鹽、間硝基苯胺重氮鹽、對(duì)硝基苯胺重氮鹽或者間苯二胺重氮鹽。
4.按照權(quán)利要求1或2所述的一種蛋白質(zhì)定量分析方法，其特征在于:所述的蛋白質(zhì)材料為親水性，將蛋白質(zhì)材料與重氮鹽進(jìn)行浸染偶合工藝。
5.按照權(quán)利要求1或2所述的一種蛋白質(zhì)定量分析方法，其特征在于:所述的蛋白質(zhì)材料為疏水性，將蛋白質(zhì)材料溶于有機(jī)溶劑后再與重氮鹽進(jìn)行浸染偶合工藝。
6.按照權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)定量分析方法，其特征在于:所述的吸光度采用分光光度計(jì)測(cè)試。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛋白質(zhì)定量分析方法，屬于蛋白質(zhì)材料分析領(lǐng)域，利用蛋白質(zhì)中游離酪氨酸或酪氨酸殘基重氮偶合產(chǎn)物的紫外可見光譜特性，建立吸光度與酪氨酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)對(duì)酪氨酸的定量分析，進(jìn)而推導(dǎo)出蛋白質(zhì)成分的含量，本發(fā)明測(cè)試對(duì)象廣，不需要對(duì)蛋白質(zhì)材料進(jìn)行水解，消除了水解過程對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)試精確度的影響，消除含N元素色素或染料對(duì)材料蛋白質(zhì)分析結(jié)果的影響，測(cè)量簡(jiǎn)便易行、準(zhǔn)確度高。
文檔編號(hào)G01N21/31GK103207154SQ20131008444
公開日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月18日
發(fā)明者王宗乾, 李長(zhǎng)龍, 陳維國(guó), 孫瑞霞 申請(qǐng)人:安徽工程大學(xué)