專利名稱：：一種結核快速診斷的質(zhì)譜分析試劑盒和方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種新的結核病生物樣品中蛋白質(zhì)分析方法的試劑盒。一種通過能與蛋白質(zhì)結合的基質(zhì)去捕獲生物標志，并用有定量控制的質(zhì)譜分析來檢測結核病生物標志。在此提及的此項發(fā)明涉及蛋白質(zhì)檢測領域，為一種新的非侵入性的體外質(zhì)譜檢測方法。本發(fā)明可以應用到已經(jīng)脫離人體的體液中的結核病生物標志組合的檢測方法或試劑盒。
背景技術：
：隨著人類基因組計劃的實施和完成，科學家們提出了后基因組(post-genome)計劃的概念，研究要點轉(zhuǎn)移到功能基因組學上，而生物功能主要體現(xiàn)物質(zhì)是蛋白質(zhì)。1994年，澳大利亞Macquarie大學的Wilkins和Williams首先提出蛋白質(zhì)組(proteome)的概念，指的是"一種基因組所表達的全部蛋白質(zhì)"，即包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質(zhì)。對于蛋白質(zhì)組的研究是功能基因組學研究的核心，稱為蛋白質(zhì)組學(proteomics)。蛋白質(zhì)組學被認為是后基因組研究中最主要的部分。與基因組相比，蛋白質(zhì)組的組成更復雜，功能更活躍，應用前景更廣泛。蛋白質(zhì)組學從細胞整體水平進行蛋白質(zhì)屬性的研究，如表達水平、翻譯后修飾及相互作用等，并由此獲得對于疾病過程、細胞生理生化特征和調(diào)控網(wǎng)絡的廣泛完整的認識。所以，蛋白質(zhì)組學技術正在逐步成為生物學、醫(yī)學及制藥學等的重要研究手段。不論是細胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細胞所表達的蛋白質(zhì)功能。因此，鑒定人體內(nèi)表達的蛋白質(zhì)的區(qū)別，可用于體外疾病樣本診斷及篩査，并最終用于藥物開發(fā)和疾病治療。而要進行蛋白質(zhì)表達和功能的差異化分析，要求能夠達到分辨細胞內(nèi)分子的復雜混合物的程度。但細胞內(nèi)許多物質(zhì)往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用這些常規(guī)手段難以進行化學結構及蛋白質(zhì)序列鑒定分析。用質(zhì)譜聯(lián)合可克服這一技術缺點。血液，由于易采集性和對機體的生理狀況的易記錄性，成為研究生物標記物的最好的來源之一。蛋白指紋圖譜(質(zhì)譜)技術(MALDI-T0F-MS、SELDI-TOF-MS)是近幾年發(fā)展起來的實驗室診斷新技術，它且具有操作較簡便、多樣本檢測、檢測快速、靈敏性和特異性高等優(yōu)點，是實驗室診斷技術革命性的進展。蛋白指紋圖譜技術在醫(yī)學領域的應用，主要用于多種疾病，特別是疾病的早期診斷。蛋白指紋圖譜技術是一項發(fā)展前景非常好的診斷技術，具有廣闊的臨床應用前景。使用蛋白指紋圖譜技術已經(jīng)成為研究比較蛋白質(zhì)組學和發(fā)現(xiàn)生物標記物可選用的方法，尤其在多肽及低分子量蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的研究中非常有用。但是，我們在進行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析時發(fā)現(xiàn)沒有一個臨床結核質(zhì)譜診斷標準化的試劑盒。結核病是結核分枝桿菌引起的主要呼吸系統(tǒng)傳染性疾病，其病原學診斷主要依靠痰細菌涂片及細菌培養(yǎng)，但前者陽性率低，后者又需歷時48周，耗時長。近幾年出現(xiàn)的基因快速診斷結核聚合酶鏈反應(PCR)，但特異性較差。又因結核聚合酶鏈反應費用較高，實驗室條件要求高，不易廣泛開展。因而急需尋找快速、有效的早期診斷方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是建立一種在結核病生物樣品中檢測的方法。該方法為結核病的早期檢測提供了新的途徑，并為進一步發(fā)現(xiàn)新的結核病生物標志提供了基礎。本發(fā)明旨在利用質(zhì)譜技術，盡可能早、盡可能多地發(fā)現(xiàn)結核病發(fā)病早期診斷的標志蛋白試劑盒和方法，實現(xiàn)疾病的早期診斷、預警和有效治療。建立一套適合質(zhì)譜應用的質(zhì)控品試劑盒和方法。質(zhì)控品是控制檢驗結果的精密度和準確性，使質(zhì)譜結果具有良好的可重復性。通過研究、實驗和分析獲得結核標志蛋白，繪制其特異的蛋白指紋圖譜。研究找到一些和結核病患者預后有密切關系的蛋白質(zhì)并加以測序、鑒定、功能分析等。本發(fā)明涉及一種通過生物標志結合的基質(zhì)表面，并用定量性質(zhì)譜分析來同時檢測多種生物標志狀態(tài)。本發(fā)明中的生物標志是利用一臺質(zhì)譜儀來發(fā)現(xiàn)的。該設備的質(zhì)量精確度約為+/-0.1%?；|(zhì)是任何能與生物標志選擇性或特異性結合的物質(zhì)。舉例說明，WCX陰離子，C8/C18疏水作用基質(zhì)吸附劑，分離生物化學中的這些方法和由這些方法產(chǎn)生的吸附劑具有診斷反面的用途(即陰離子吸附劑捕獲陽離子蛋白質(zhì))。底基洗去未吸附的物質(zhì)。任何適宜的洗液均可使用。生物標志首先能夠被具有能與生物標志物結合基質(zhì)吸附表面捕獲，非吸附物能從基質(zhì)上洗脫，吸附到底基的生物標志物在質(zhì)譜儀中被檢測。生物標志通過離子發(fā)生源，如激光，被離子化，產(chǎn)生的離子被一個離子感受集合器收集，然后質(zhì)量分析器分析那些通過的離子。之后，檢測器將檢測的離子信息轉(zhuǎn)換為質(zhì)荷比。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控-每次測試前，用質(zhì)譜的標準化質(zhì)控血清，將標準化質(zhì)控血清中用于定量的標準峰6634.0Da強度調(diào)至50%質(zhì)譜信號強度的最大值。生物標志的檢測明顯地將與信號強度的檢測有關。這樣，生物標志的數(shù)量與質(zhì)量都可以被檢測出來。飛行質(zhì)譜對待分析物的分析生成飛行時間譜。該飛行時間譜的最終分析并不表示離子化能量攻擊一個樣本產(chǎn)生的單獨的脈沖信號，而是一系列脈沖的信號之和。這樣降低了干擾，并增加了動態(tài)范圍。該飛行時間數(shù)據(jù)受數(shù)據(jù)處理軟件的影響。軟件中數(shù)據(jù)處理主要包括轉(zhuǎn)換飛行時間與質(zhì)荷比而產(chǎn)生質(zhì)譜，降低基線而減少儀器的偏移量，和過濾高頻噪音而減輕高頻噪音。通過對生物標志的吸附和檢測而產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可利用計算機的數(shù)據(jù)分析程序進行分析。該計算機程序分析這些數(shù)據(jù)以顯示檢測出的生物標志的數(shù)量，并顯示信號的強度和確定被檢測的每個生物標志的分子量。數(shù)據(jù)分析還能包括一系列的確定生物標志的信號強度和矯正數(shù)據(jù)對預定統(tǒng)計分布狀態(tài)的偏離。例如，通過計算與某些參數(shù)相關的每個峰值的高度，可規(guī)范觀測到的峰。該參數(shù)可能是由儀器和類似能量吸收分子等化學成分產(chǎn)生的不重要的干擾，這可以設置調(diào)零。計算機可以將計算結果數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成各種形式來表現(xiàn)。其標準譜可以表示，但在一種形式中只有峰高和質(zhì)量信息可以在譜帶中保留，產(chǎn)生一個較清晰的圖，并使具有幾乎相同分子量的生物標志物更易顯現(xiàn)。在另一種形式中，兩個或更多的譜比較，便于突顯獨特的生物標志物和那些高于或低于校準樣本的生物標志物。分析一般包括展示從待分析物得到的信號的圖譜中峰的鑒定。峰可以通過視圖進行選擇，軟件是可用的，它可自動檢測峰。一般情況下，該軟件通過鑒定信號具有信噪比高于一個選擇閾值并標記出在峰信號的質(zhì)心處的峰的質(zhì)量這樣的方式操作。在一個有效的程序中，比較許多譜線以認定出現(xiàn)在質(zhì)譜中某一選定范圍內(nèi)同樣的一些峰。該軟件的一個版本聚集所有出現(xiàn)在確定的質(zhì)量范圍內(nèi)的各條光譜的峰，對所有在質(zhì)量(質(zhì)荷比)中值附近的峰指定一個質(zhì)量(質(zhì)荷比)簇。發(fā)明中使用的生物標志是基質(zhì)所捕獲。這些生物標記是進一步通過質(zhì)譜(massspectrometry)測定其不同分子量來知道它們特定的身份。對生物標志的檢測需要將一個樣本放基質(zhì)的一個吸附點上，接著進行清洗。電噴霧電離質(zhì)譜(electrosprayionizsationmassspectrometry,ESI-MS)是在毛細管的出口處施加一高電壓，所產(chǎn)生的高電場使從毛細管流出的液體霧化成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷強度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個或多個電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進入氣相?；|(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeoffightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)的基本原理是向吸附點上加入SINAPINIC酸等并讓其干燥，將分析物分散在分子中并形成晶體，當用激光照射晶體時，由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射所吸收的能量，導致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質(zhì)晶體升華，致使連同分析物一起進入氣相。而后，用質(zhì)譜測定法對基質(zhì)進行分析，而一個顯示了蛋白質(zhì)分子的遺留物圖將生成，這張圖是在蛋白質(zhì)分子的質(zhì)量-電荷比的基礎上，以彼此分開的峰圖的形式顯示出來的。然而，如果有必要，這些生物標志也可通過，比如，確定多肽的氨基酸序列來進行鑒別。在蛋白質(zhì)化學及蛋白質(zhì)組學研究中，為了增加蛋白質(zhì)鑒定的可信度，獲得一段蛋白質(zhì)肽片段內(nèi)部序列信息通常是非常重要的。對于蛋白質(zhì)及多肽的序列測定，傳統(tǒng)的方法是采用Edman降解方法，而該方法最大的不足之處在于費時太長(一個殘基需花費30-40分鐘)。近年來，隨著質(zhì)譜技術的飛速發(fā)展，尤其是多級質(zhì)譜(MS/MS)以及源后裂解(PSD)等技術的發(fā)展，應用質(zhì)譜測序已成為一種流行的方法。例如，一個生物標志能用許多酶描繪出來，例如V8蛋白酶(V8protease)或胰蛋白酶，而且消化片段(digestionfragments)的分子量可被用來在數(shù)據(jù)庫中搜索序列，這些序列與由多種酶生成的消化片斷的分子量相吻合。或者，如果此生物標志不是已知數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)分子，在生物標志的N極氨基酸序列(N-terminalAminoAcidSequence)的基礎上，可使用降解探針，而后，這些探針會被用來描繪由探測到了生物標志的樣本所生成的基因組或cDNA庫。最后，蛋白質(zhì)生物標志可用蛋白質(zhì)梯狀排序法(proteinladdersequencing)進行排序。通過將分子碎成碎片并將碎片用酶解作用或其他可按順序從碎片末端除去一個單個氨基酸分子的方法進行處理后，可生成蛋白質(zhì)梯度(proteinladders)。然后，用質(zhì)譜對此梯度進行分析。階梯狀碎片(ladderfragments)在質(zhì)量上的差異可鑒別出從分子末端被除去的氨基酸。因此，本發(fā)明可以用于生物標志鑒定的金標準。特異性是指某一物質(zhì)或某種疾病的專一屬性，它是代表某種物質(zhì)或某種疾病的特征。通過某些特征可以識別某種物質(zhì)或某種疾病，從而把它和其他物質(zhì)或疾病區(qū)分開來。對專有特征的識別往往依賴于特殊的檢測方法，例如要了解某種疾病是否存在有特異性抗原就要用有關特異性抗體來檢測。自蛋白質(zhì)組學研究有新發(fā)展以來，這種傳統(tǒng)意義上特異性檢測和界定方法有了很大的突破。如一個蛋白質(zhì)不同片段變異是不同類型腫瘤的標志。本發(fā)明利用WCX陰離子基質(zhì)及利用C8/C18疏水基質(zhì)磁珠為例對正常人與結核病血清(漿)進行蛋白質(zhì)對比分析。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標準化質(zhì)控血清(漿)，將標準化質(zhì)控血清(漿)中用于定量的標準峰6634.0Da強度調(diào)至50%質(zhì)譜信號強度的最大值。一種用質(zhì)譜判斷正常人與結核病的試劑盒和方法的具體操作步驟以下是用本發(fā)明提供的一個操作方案及結核病試劑盒實例。1.樣品處理及標準化質(zhì)控血清(漿)制備將生物樣品稀釋在稀釋緩沖溶液中，視需要離心澄清樣品。質(zhì)譜的標準化質(zhì)控血清(漿)制備定義符合如下標準供血者10人，5男5女，血型為0型；年齡為1S30歲；民族漢。生化指標正常，包括總膽固醇、甘油三酯、空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功檢査、腎功檢査；無遺傳病家族史無重大傳染病史。女性不能懷孕，男性為不吸煙者。2.基質(zhì)與結核病、標準化質(zhì)控血清(漿)制備、樣品上樣抽取0型血的健康受試者(男女各半)的新鮮血液(a)4。C下待血液凝固后馬上離心，4。C離心5min分離血清。(b)4'C下馬上離心，4。C離心5min分離血漿。標準化質(zhì)控或結核病血清(漿)樣品分裝10(^1—小管，于—8(TC儲存；或取混合血清(漿)1:2稀釋于U9緩沖液(9MUrea,2%CHAPS，50mMTris-HCL，pH9.0)—小管，25。C儲存。即成為結核、標準化質(zhì)控血清(漿)試劑盒。將質(zhì)譜的標準化質(zhì)控血清及樣品點樣在有支持物的基質(zhì)中的一個位點上。支持物用磁性珠?；|(zhì)是用于標記、結合血清(漿)的。標記至液相色譜柱子上的基質(zhì)可用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)的標準方法去分析。將質(zhì)譜的標準化質(zhì)控0血清(漿)用于質(zhì)譜儀試劑盒的定量方法。3.洗滌用結合緩沖液洗漆。在樣品完全干燥前將第一份洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復以上步驟。以下步驟用0.05%1%三氟乙酸徹底洗滌整個磁性珠陣列點，將生物標志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然干燥金屬片，加0.5吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸制備的飽和標準溶液)。吸能分子可用Si,inicacid或alpha-Cyano-4-hydroxycinnamicacid等。3.質(zhì)譜的定量控制及測試用激光解吸/離子化飛行時間質(zhì)譜儀，用氮激光儀(337nm)和80cm或120cm飛行8管分析陣列，或用電噴霧電離已洗脫的生物標志后用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)標準方法去分析滯留于各位點的生物標志或蛋白質(zhì)。用計算機分析數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)重疊展示。定量性質(zhì)譜調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標準化質(zhì)控血清(漿)，將標準化質(zhì)控血清中用于定量的標準峰6634.0Da等強度調(diào)至5(W信號強度的最大值。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標準化質(zhì)控血清(漿)，將標準化質(zhì)控血清(漿)中用于定量的標準峰6634.0Da強度調(diào)至50%質(zhì)譜信號強度的最大值。用2746土1Da、5909土1Da、6634土1Da標準峰為質(zhì)譜定性(分子量)質(zhì)控標準。本發(fā)明將蛋白質(zhì)分成了幾大類，即WCX陰離子、C8/C18疏水作用等蛋白。這樣，可用質(zhì)譜儀直接進行分析及定量。通過分析幾百種血清蛋白指紋峰，發(fā)現(xiàn)下述蛋白指紋或質(zhì)譜圖譜可以用于區(qū)分正常與結核病的血清。峰值CV〉3(m或者p〈0.01為有顯著性差異正常與結核病蛋白指紋或質(zhì)譜圖譜的顯著性差異(土15Da)2742.523933.745061.786086.216847.888341.0811682.952873.313957.015336.946107.496872.558555.5713740.092954.474070.175541.186125.636998.478603.7914015.413159.654091.765732.496186.177149.358682.7114132.223219.194156.475808.416297.797568.949415.0115114.903322.634175.245813.376359.017657.069699.2915312.813379.734282.365839.916429.387763.0911079.423383.413396.854346.635881.156476.477926.9611389.123956.233449,314648.055902.366627.358048.7311439.224097.223886.394962.985945.436832.458137.1911526.727993.79用從中篩選出幾個特征蛋白2873.3土15Da、3379.7土15Da、3449.3土15Da、5808.4土15Da、7568.9土15Da、8048.7土15Da、11439.2土15Da、11526.7土15Da、11683.0土15Da、15114.9土15Da、15312.8土15Da，雙盲測試100例正常人與IOO例結核病。試劑盒的敏感性100%，特異性100%(實施例2)。利用C8及C18疏水基質(zhì)磁珠的實驗結果與上述WCX陰離子基質(zhì)磁珠的實驗結果一致。將一組11439.2土15Da、11526.7土15Da、11683.0土15Da生物標志(圖3)用多級質(zhì)譜(MS/MS)、源后裂解(PSD)及蛋白質(zhì)梯狀排序法(proteinladdersequencing)28832.8537001.8643986.1446489.01進行排序。通過將分子碎成碎片，可生成蛋白質(zhì)梯度(proteinladders)。然后，用質(zhì)譜對此梯度進行分析。鑒別出11439.2土15Da、11526.7土15Da、11683.0土15Da生物標志為變異的血清淀粉樣蛋白A。其化學結構為(從N端至C端排列為104個氨基酸)11683土15Da生物標志的化學結構N端RSFFSFLGEAFDGARDMWRAYSDMREANYIGSDKYFHARGNYDAAKRGPGGVWAAEAISDARENIQRFFGHGAEDSLADQAANEWGRSGKDPNHFRPAGLPEKYC端。11527土15Da生物標志的化學結構N端SFFSFLGEAFDGARDMWRAYSDMREANYIGSDKYFHARGNYDAAKRGPGGVWAAEAISDARENIQRFFGHGAEDSLADQAANEWGRSGKDPNHFRPAGLPEKYC端。11439土15Da生物標志的化學結構N端FFSFLGEAFDGARDMWRAYSDMREANYIGSDKYFHARGNYDAAKRGPGGVWAAEAISDARENIQRFFGHGAEDSLADQAANEWGRSGKDPNHFRPAGLPEKYC端。將變異的血清淀粉樣蛋白A抗體的制備并從培養(yǎng)上清中提取所需抗體。此抗體可用于制備檢測所需的試劑盒。用抗血清淀粉樣蛋白A抗體與質(zhì)譜儀聯(lián)合應用(實施例5)發(fā)現(xiàn)被分析物的分子量與實施例3—致，則11439.2土15Da、11526.7土15Da、11683.0土15Da化學結構可以推測為變異的血清淀粉樣蛋白A。即抗體及質(zhì)譜聯(lián)合，可省去變異的血清淀粉樣蛋白A的排序鑒定?？贵w與質(zhì)譜儀聯(lián)合應用時發(fā)現(xiàn)變異的血清淀粉樣蛋白A(圖3)可以用于區(qū)分正常人、輕度結核病人、復發(fā)結核、重度結核病人、結核病人有效治療后的血清。常規(guī)ELISA等檢測試劑盒無法檢測變異的血清淀粉樣蛋白A。本發(fā)明可用于體外細胞和非侵入性的體外結核病質(zhì)譜檢測方法的定量控制，如離體體液的結核病試劑盒用于臨床質(zhì)譜的結核病檢測方法。可以檢測多個結核病蛋白質(zhì)生物標志群及質(zhì)譜圖譜。本發(fā)明中的試劑盒及方法與其他非侵入性的體外檢測方法比較，具有以下的特點(1)準確質(zhì)譜直接分析有很強的精確性，一般誤差率只有0.1Da。因為蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的，而氨基酸的平均質(zhì)量是已知的，如果知道了抗原或生物標志的總分子量，那么抗原的變異(指氨基酸變化)就很容易被推測出來。如，變異的血清淀粉樣蛋白A，而非普通的血清淀粉樣蛋白A，可有準確鑒別正常人與輕度結核病人、復發(fā)結核病人、重度結核病人及結核病人療效的用途。常規(guī)ELISA等檢測試劑盒無法檢測變異的血清淀粉樣蛋白A。(2)方便本方法將蛋白質(zhì)分成了幾大類，即陰離子、疏水作用蛋白。這樣，可用質(zhì)譜儀直接進行分析。磁珠支持基質(zhì)的方法所用吸附劑的支持物是磁性微?；虼胖?。用磁性分離器分離磁珠及樣品，無需離心樣品。這樣，可用質(zhì)譜儀直接進行分析。(3)快捷用本發(fā)明提供的蛋白指紋法進行疾病診斷時，無需對蛋白質(zhì)進行測序。本發(fā)明采用了計算機"條碼格式"，信號強度沿著線性軸以暗度強度值顯示。此強度可以用掃描儀記錄并用分析軟件自動分析對比強弱，從而有助于臨床復雜的診斷，如可用此"蛋白指紋"或條碼格式進行醫(yī)學分析。目前全國結核病患者人數(shù)約450萬，列世界第二位。其中傳染性肺結核病人約200萬，每年死亡人數(shù)約二十五萬，在傳染病中居首位，已經(jīng)超過肝炎成為中國危害最嚴重的傳染病。結核病流行在我國重新加劇，四高一低局面不改，該病將有可能再次成為不治之癥。雖然造成我國結核病重新加劇的原因很多，但是，關鍵問題是目前所使用的結核病篩查、診斷技術不適應需要，它們或陽性率低,或耗時長、或費用較高，或?qū)嶒炇覘l件要求高等原因，以致結核病病人無法及時發(fā)現(xiàn)和治療。本方法用WCX基質(zhì)、血清淀粉樣蛋白A抗體吸附表面基質(zhì)及質(zhì)譜法進行鑒別檢測發(fā)現(xiàn)一種新型變異的血清淀粉樣蛋白A。變異的血清淀粉樣蛋白A可用于檢測正常人、輕度結核病人、復發(fā)結核、重度結核病人、結核病人有效治療后的血清。變異的血清淀粉樣蛋白A升高者提示療效差、重度結核及結核復發(fā)。所以它是一個早期發(fā)現(xiàn)結核惡化、預測結核復發(fā)發(fā)生的早期預警蛋白指紋組。它的持續(xù)陰性表達可以提示結核患者病情穩(wěn)定，而其從陽性經(jīng)治療轉(zhuǎn)陰也可達到此目的。因此，將其作為一種臨床檢測平臺，以預測結核的發(fā)展，并提示相應治療的臨床意義。通過WCX基質(zhì)及被抗體吸附表面基質(zhì)上捕獲的變異的血清淀粉樣蛋白A，用標準化質(zhì)控血清控制下的定量性質(zhì)譜分析來檢測，可以應用到已經(jīng)脫離人體的體液中的生物標志組合的檢測方法或試劑盒開發(fā)。本發(fā)明提供的一個試劑盒和方法用于質(zhì)譜檢測定量控制。從而有助于臨床復雜的結核病體外檢測。本方法準確、方便且快捷。說明書附圖圖1正常人與結核病蛋白指紋圖譜及質(zhì)譜多肽譜圖2正常人與結核病蛋白指紋圖譜及質(zhì)譜圖譜的一個特征峰圖3正常人與結核病蛋白指紋圖譜及質(zhì)譜圖譜的一組特征峰具體實施例方式本發(fā)明將結合具體實施例作進一步說明，這些實例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。實施例1正常與結核病的區(qū)分及質(zhì)譜的試劑盒制備(1)實驗方法一、材料標本來源質(zhì)譜的標準化質(zhì)控血清(漿)制備定義符合如下標準，供血者男女各半，血型為0型；年齡為1830歲；民族，漢。生化指標正常，包括總膽固醇、甘油三酯、空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功檢查、腎功檢査；無遺傳病家族史；無重大傳染病史。女性無懷孕，男性無吸煙史者。抽取10位0型血的健康受試者(男女各半)的新鮮血液，4。C下待血液凝固后馬上離心，10，000rpm,4。C離心5min;樣品儲存于-80'C。取混合血清(漿)乖，用2(V1U9緩沖液(9MUrea，2%CHAPS，50rnMTris-HCL，pH9.0)稀釋，而后，將以上標本冰浴振蕩30min。將30|al上述變性后標本加入36(^1相應的結合緩沖液，待用。所有樣本均進行雙份檢測以減少實驗誤差。簡要操作步驟將上述200nl結合緩沖液(50mMNaAC，pH4.04.5)加至已裝好WCX陰離子磁珠小管中，置振蕩器(MSIMinishaker)400-600rpm，震蕩5min，用磁性分離器分離磁珠及樣品。重復上述操作兩次。用0.05Xiy。三氟乙酸徹底洗滌整個WCX陰離子磁珠陣列點，將生物標志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然干燥金屬片，加0.5吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸制備的飽和標準溶液)。然后用質(zhì)譜分析閱讀。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標準化質(zhì)控血清(漿)，將標準化質(zhì)控血清(漿)中用于定量的標準峰6634.0Da強度調(diào)至50%質(zhì)譜信號強度的最大值。數(shù)據(jù)收集在每次實驗數(shù)據(jù)收集前，用All-in-one蛋白校正儀器，使蛋白質(zhì)分子量誤差<0.1%。數(shù)據(jù)分析用統(tǒng)計學方法，分析所得數(shù)據(jù)的形式是用計算機讀取的條碼格式或峰，蛋白指紋顯示為沿著線性軸的暗度強度值信號，此強度可以用掃描儀記錄并用分析軟件自動分析對比強弱。所有的圖譜都進行了標準化，統(tǒng)一到它們自己全部的離子總數(shù)(峰面積的總和)。將標準化質(zhì)控血清中用于定量的標準峰6634.0Da強度調(diào)至50%信號強度的最大值，并且用6634.0Da的峰進行了校正，而后又進行了"減少基線"，定義蛋白峰(s/n〉5)。分析了所有70050000Da之間的蛋白峰，并且仔細檢査了每個相應的峰，計算出峰的平均數(shù)，標準誤差(SD)和變異系數(shù)(CV%)。通過分析幾百種血清蛋白指紋峰，發(fā)現(xiàn)下述蛋白指紋可以用于區(qū)分正常與結核病。峰值CV〉3(^或者p〈0.01為有顯著性差異(圖l、2，信號強度沿著線性軸以暗度強度值顯示)正常與結核病蛋白指紋或質(zhì)譜圖譜的顯著性差異(±15Da)2742.523933.745061.786086.216847.888341.0811682.952873.313957.015336.946107.496872.558555.5713740.092954.474070.175541.186125.636998.478603.7914015.413159.654091.765732.496186.177149.358682.7114132.223219.194156.475808.416297.797568,949415.0115114.903322.634175.245813.376359.017657.069699.2915312.813379.734282.365839.916429.387763.0911079.423383,413396.854346.635881.156476.477926.9611389.123956.233449.314648.055902.366627.358048.7311439.224097.223886.394962.985945.436832.458137.1911526.727993.79實施例2試劑盒的雙盲測試用從實施例1中篩選出幾個特征蛋白峰2873.3土15Da、3379.7土15Da、3449.3土28832.8537001.8643986.1446489.0115Da、5808.4土15Da、7568.9土15Da、8048.7土15Da、11439.2土15Da、11526.7土15Da、11683.0土15Da、15114.9土15Da、15312.8土15Da，雙盲測試100例正常與100例結核病<table>Complextableseetheoriginaldocumentpage14<table>敏感性100%特異性100%利用C8及C18疏水基質(zhì)磁珠的實驗結果與上述WCX陰離子基質(zhì)磁珠的實驗結果一致。實驗結論用本方法的試劑盒可鑒別正常人與結核病，敏感性100%，特異性100%。實施例3結核病蛋白指紋圖譜一組特征峰的排序鑒定將一組11439.2土15Da、11526.7土15Da、11683.0土15Da生物標志(圖3)用多級質(zhì)譜(MS/MS)、源后裂解(PSD)及蛋白質(zhì)梯狀排序法(proteinladdersequencing)進行排序等方法。通過將分子碎成碎片，可生成蛋白質(zhì)梯度(proteinladders)。然后，用質(zhì)譜對此梯度進行分析。鑒別出11439.2土15Da、11526.7土15Da、11683.0土15Da生物標志為變異的血清淀粉樣蛋白A。其化學結構為(從N端至C端排列為104個氨基酸)11683土15Da生物標志的化學結構N端RSFFSFLGEAFDGARDMWRAYSDMREANYIGSDKYFHARGNYDAAKRGPGGVWAAEAISDARENIQRFFGHGAEDSLADQAANEWGRSGKDPNHFRPAGLPEKYC端。11527土15Da生物標志的化學結構N端SFFSFLGEAFDGARDMWRAYSDMREANYIGSDKYFHARGNYDAAKRGPGG雨MEAISDARENIQRFFGHGAEDSLADQMNEWGRSGKDPNHFRPAGLPEKYC端。11439土15Da生物標志的化學結構N端FFSFLGEAFDGARDMWRAYSDMREANYIGSDKYFHARGNYDAAKRGPGGVWAAEAISDARENIQRFFGHGAEDSLADQAANEWGRSGKDPNHFRPAGLPEKYC端。實施例4變異的血清淀粉樣蛋白A抗體的制備血清淀粉樣蛋白A的合成及序列N端RSFFSFLGEAFDGARDMWRAYSDMREANYIGSDKYFHARGNYDAAKRGPGGVWMEAISDARENIQRFFGHGAEDSLADQAANEWGRSGKDPNHFRPAGLPEKYC端。將合成的變異的血清淀粉樣蛋白A免疫小鼠，待免疫反應出現(xiàn)后，從外周血中分離B細胞。用溶血噬菌斑分析法選擇并分離出能分泌所需抗體的單個淋巴細胞。將單個細胞擴增至1X107個以上，用QuickmRNAPurificationKit提取mRNA。以提取的mRNA為模板，合成cDNA鏈。以此cDNA為模板，加入鼠抗體重鏈可變區(qū)(VH)通用引物，輕鏈可變區(qū)(V,)通用引物，進行聚合酶鏈反應，獲得擴增的l基因片段和V,基因片段。將擴增產(chǎn)物在15g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定和分離。用glassmilk回收擴增的VH基因片段和V,基因片段。與等摩爾嘗試的LimkerPrimerMix混合，進行聚合酶鏈反應，連接、和、。擴增產(chǎn)物分離純化后，獲得特異性單鏈抗體(ScFV)。此ScFV可用于制備檢測所需DNA片。將此擴增產(chǎn)物兩端加限制性酶切位點，純化定量后，連接到pu"a載體上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感染大腸桿菌TOPIO。經(jīng)藍白斑篩選及酶切鑒定，篩選出重組質(zhì)粒。在96孔板形成單克隆抗體。用ELISA法篩選出效價最高的單克隆抗體株，大量制備，并從培養(yǎng)上清中提取所需抗體。此抗體可用于制備檢測所需試劑盒。實施例5血液中血清淀粉樣蛋白A分子抗體及質(zhì)譜鑒定用Carbodiimide方法(CarbodiimideMethod)將帶有羧酸基團標記的磁性珠上基質(zhì)與抗血清淀粉樣蛋白A抗體的氨基基團結合(GimnDL,etal.PreparationofsensitiveandstableerythrocytesbythecarbodiimidemethodforthedetectionofprimaryandsecondaryIgMandIgGantibody.JImmunolMethods.1972;1(4):381-389.)。將樣品點樣在一個抗血清淀粉樣蛋白A抗體基質(zhì)的位點上。用結合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復以上歩驟。用1%三氟乙酸徹底洗滌整個陣列點，將生物標志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然干燥金屬片，加0.5)aLSinapinicacid吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸的制備的標準溶液)。用質(zhì)譜儀，用氮激光儀(337run)和80cm或120cm飛行管分析陣列去分析各位點的生物標志或蛋白質(zhì)。用計算機分析數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)重疊展示。實驗結果用抗血清淀粉樣蛋白A抗體基質(zhì)與質(zhì)譜儀聯(lián)合應用發(fā)現(xiàn)被分析物的分子量與實施例3一致，則11439.2土15Da、11526.7土15Da、11683.0土15Da化學結構可以推測為變異的血清淀粉樣蛋白A。發(fā)現(xiàn)下述變異的血清淀粉樣蛋白A可以用于區(qū)分正常人、輕度結核病人、復發(fā)結核、重度結核病人、結核病人有效治療后的血清<table>complextableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>50例正常人的血清陰性50例輕度結核、復發(fā)結核病人的血清陽性50例重度結核病人的血清強陽性50例結核病人有效治療后的血清陰性用實施例5"血液中血清淀粉樣蛋白A分子抗體及質(zhì)譜鑒定"，即抗體及質(zhì)譜聯(lián)合，可省去變異的血清淀粉樣蛋白A的排序鑒定。本方法用WCX基質(zhì)、血清淀粉樣蛋白A抗體吸附表面基質(zhì)及質(zhì)譜法進行鑒別檢測發(fā)現(xiàn)一種新型變異的血清淀粉樣蛋白A。變異的血清淀粉樣蛋白A可用于檢測正常人、輕度結核病人、復發(fā)結核、重度結核病人、結核病人有效治療后的血清。變異的血清淀粉樣蛋白A升高者提示療效差、重度結核及結核復發(fā)。所以它是一個早期發(fā)現(xiàn)結核惡化、預測結核復發(fā)發(fā)生的早期預警蛋白指紋組。它的持續(xù)陰性表達可以提示結核患者病情穩(wěn)定，而其從陽性經(jīng)治療轉(zhuǎn)陰也可達到此目的。因此，將其作為一種臨床檢測平臺，以預測結核的發(fā)展，并提示相應治療的臨床意義。通過WCX基質(zhì)及被抗體吸附表面基質(zhì)上捕獲的變異的血清淀粉樣蛋白A，用標準化質(zhì)控血清控制下的定量性質(zhì)譜分析來檢測，可以應用到已經(jīng)脫離人體的體液中的生物標志組合的檢測方法或試劑盒開發(fā)。本方法準確、方便且快捷。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。權利要求1.一種用磁珠支持基質(zhì)的方法捕獲生物樣品中結核病蛋白質(zhì)組的試劑盒和方法，其特征是采用蛋白指紋法對結核病中蛋白質(zhì)組或質(zhì)譜圖譜進行鑒別檢測。用標準化質(zhì)控血清(漿)控制下的定量性質(zhì)譜分析來檢測。該方法通過以下步驟實現(xiàn)(1)樣品處理及質(zhì)譜標準化質(zhì)控血清(漿)制備；(2)基質(zhì)與血清(漿)結合試劑盒制備、樣品上樣；(3)洗滌；(4)質(zhì)譜的定量控制及質(zhì)譜檢測；其中所述步驟(1)將生物樣品稀釋在稀釋緩沖溶液中。用O型血，男女相等，混合制備質(zhì)譜的標準化質(zhì)控血清(漿)；所述步驟(2)將質(zhì)譜的標準化質(zhì)控血清(漿)及樣品點樣在有支持物的基質(zhì)中的一個位點上。支持物用磁性珠。基質(zhì)是用WCX陰離子基質(zhì)及C8/C18疏水基質(zhì)與血清(漿)選擇性結合；所述步驟(3)用結合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復以上步驟。用三氟乙酸徹底洗滌整個陣列點，將生物標志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片或位點上。所述步驟(4)加0.5μL吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的制備的飽和標準溶液)用質(zhì)譜儀去分析滯留與各位點的生物標志或用電噴霧電離已洗脫的生物標志后用質(zhì)譜儀去分析。對血液進行蛋白質(zhì)對比分析，用計算機分析血液中質(zhì)荷比數(shù)據(jù)。本試劑盒依據(jù)幾個特征蛋白峰2873.3±15Da、3379.7±15Da、3449.3±15Da、5808.4±15Da、7568.9±15Da、8048.7±15Da、11439.2±15Da、11526.7±15Da、11683.0±15Da、15114.9±15Da、15312.8±15Da，雙盲測試正常人與結核病的敏感性100％，特異性100％。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標準化質(zhì)控血清(漿)，將標準化質(zhì)控血清(漿)中用于定量的標準峰6634±1Da強度調(diào)至50％質(zhì)譜信號強度的最大值。用2746±1Da、5909±1Da、6634±1Da標準峰為質(zhì)譜定性(分子量)質(zhì)控標準。2.權利要求1所述的蛋白質(zhì)分析方法，在磁珠支持基質(zhì)的方法所用的基質(zhì)包括陰離子、疏水作用吸附劑。3.權利要求2中磁珠支持基質(zhì)的方法所用吸附劑的支持物是磁性微?；虼胖?。4.權利要求1所述的一組(簇)分子量為11439.2土15Da、11526.7土15Da、11683.0土15Da變異的蛋白指紋的變化對于鑒別正常人、輕度結核病人、復發(fā)結核病人、重度結核病人、結核病人療效試劑盒的用途。5.權利要求4所述的11683.0土15Da蛋白指紋為血清淀粉樣蛋白A，11526.7土15Da蛋白指紋的化學結構為變異的血清淀粉樣蛋白A(其氨基端除去了精氨酸)，11439.2土15Da蛋白指紋的化學結構為變異的血清淀粉樣蛋白A(其氨基端除去了精氨酸及絲氨酸)。6.—種權利要求5所述的檢測變異的血清淀粉樣蛋白A的試劑盒，其特征在于，它包括一容器以及裝于容器中的權利要求4所述的檢測變異的血清淀粉樣蛋白A的抗體(組)。7.如權利要求6所述的試劑盒，其特征于，所述的抗體(組)為單克隆抗體(組)或多克隆抗體(組)。8.如權利要求1所述的試劑盒，其特征于，所述的生物樣品為血清或血漿。全文摘要本發(fā)明涉及一種用磁珠支持基質(zhì)的方法捕獲生物樣品中結核病蛋白質(zhì)組，用磁性分離器分離磁珠及樣品，無需離心樣品。然后用質(zhì)譜法進行分析的蛋白指紋法。本試劑盒依據(jù)幾個特征蛋白峰，雙盲測試正常人與結核病的敏感性100％，特異性100％。其中變異的血清淀粉樣蛋白A可用于檢測正常人、輕度結核病人、復發(fā)結核病人、重度結核病人、結核病人有效治療后離體的血清。變異的血清淀粉樣蛋白A升高者提示療效差、重度結核及結核復發(fā)。所以它是一個早期發(fā)現(xiàn)結核惡化、預測結核復發(fā)發(fā)生的早期預警蛋白指紋組。本發(fā)明的方法可用于區(qū)別正常人與結核病的蛋白指紋或質(zhì)譜圖譜的試劑盒。本方法準確、方便且快捷。文檔編號G01N33/68GK101196526SQ20061016109公開日2008年6月11日申請日期2006年12月6日優(yōu)先權日2006年12月6日發(fā)明者洋許申請人:洋許