專利名稱：：用質譜檢測多發(fā)性骨髓瘤特征蛋白的試劑的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種多發(fā)性骨髓瘤蛋白的檢測試劑，特別是用質譜檢測多發(fā)性骨髓瘤特征蛋白的試劑。
背景技術：
：多發(fā)性骨髓瘤(醒)是克隆B細胞紊亂，惡性漿細胞(PC)在骨髓中聚集導致溶骨病變并且產生過多的單克隆蛋白。雖然對于多發(fā)性骨髓瘤的治療已經取得了實質性的進展，預防和早期發(fā)現仍是降低多發(fā)性骨髓瘤死亡率的有效途徑和提高患者成活率的關鍵。目前用于篩査多發(fā)性骨髓瘤的實驗室檢測方法敏感性和特異性均較低，已成為多發(fā)性骨髓瘤早期檢測的一個瓶頸。而且這些方法通常都有侵襲性，且花費昂貴，所以需要一種高敏感性，特異性，非侵襲性，便宜又方便的方法。己知蛋白質的分離和質譜分析可用于生物標志物的檢測。雖然單克隆蛋白(M-蛋白)是重要的檢測多發(fā)性骨髓瘤的生物標記物，但它沒有特異性，因為此蛋白也可以在意義未定的單克隆丙種球蛋白病(MGUS)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)的血清中找到。臨床上僅以單克隆蛋白一種蛋白作為血清學檢測指標在敏感性和特異性上是遠遠不足的。蛋白質的分離技術在蛋白質組學中應用分離技術有兩個目的。第一、通過將蛋白質的混合物分離成單一蛋白質或蛋白質小組以簡化復雜的蛋白質混合物；第二、通過標記的方法可以比較兩個蛋白質的混合物樣品中蛋白質的不同表現。其中主要的技術有雙向電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)、高效液相層析(high-performanceliquidchromatography,HP1X)、毛細管電泳(capillaryelectrophoresis,CE)、親禾口層析(affinitychoromatography)、蛋白芯片(proteinmicroarray)、磁性微球(magneticbeads,簡稱磁珠)和免疫組等。特別是蛋白芯片和磁珠兩項新的蛋白指紋圖譜技術克服了以往技術的缺點，具有高靈敏度、高通量、結果重復性好、可機械化操作和方法靈活等特點。待測樣品來源廣泛，不需作特殊前處理，可以直接點樣檢測，如血清、尿液及組織液等；檢測快速，一般一例標本的檢測時間僅需約5分鐘，從標本制備到出結果全過程僅約1小時。蛋白芯片和磁珠兩項新的蛋白指紋圖譜技術有可能在體液中潛在生物標志(biomarker)檢測方面創(chuàng)造革命性突破(許洋，蛋白質指紋圖譜技術在實驗診斷與臨床醫(yī)學中的研究進展，基礎醫(yī)學與臨床，2007,27:134-142)?；|輔助激光解析/電離飛行日寸間質譜(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeoffightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)與蛋白芯片分離技術聯合應用即為表面增強激光解析/電離飛行日寸間質譜(surfaceenhancedlaserdesorption/ionizationtimeoffightmassspectrometry,SELDI-T0F-MS)。2-DE最先被用于臨床蛋白組學研究，但其對疏水性、強酸性和強鹼性蛋白的分辯率不夠，而且不能檢測低豐度蛋白，故實用價值受限。近來，蛋白芯片與質譜技術(SELDI-T0F-MS)的結合，已被成功地用于腫瘤研究。由于磁珠表面的結合面積遠遠大于蛋白芯片，從而磁珠的靈敏性比蛋白芯片更高(劉建棟等，血液蛋白質組與質譜儀檢測流程標準化初探。基礎醫(yī)學與臨床，2007,27:193-197)。磁珠具有優(yōu)于二維電泳、蛋白芯片和其他質譜方法的特點，已被廣泛地用于腫瘤生物標志的篩査等研究(屠世良等，癌胚抗原陰性結直腸癌的檢測和結直腸癌預后相關生物標志，基礎醫(yī)學與臨床，2007，27:926-931)。該技術具有操作簡便、無需離心樣品、可直接分析原始生物樣本(如血清、尿液等)、樣本用量小等特點，同時適合多樣品平行檢測和直接進行蛋白質全景式的搜索和分析，特別是對小分子量蛋白和低豐度蛋白具有較高的捕獲效果，可以與其他蛋白質組學方法互補，目前已被廣泛地用于腫瘤標志的篩査和臨床檢測，并均已獲得很好的結果。但迄今尚未見到采用磁珠捕獲生物標志，并用質譜分析技術檢測多發(fā)性骨髓瘤血清特征蛋白的報道。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種新的檢測多發(fā)性骨髓瘤的方法和試劑，通過建立檢測多發(fā)性骨髓瘤特征蛋白的優(yōu)化質譜模型，提供用質譜法檢測多發(fā)性骨髓瘤特征蛋白的試劑。本發(fā)明通過能與蛋白質結合的磁珠基質去捕獲生物標志，并用有定量控制的質譜分析來檢測多發(fā)性骨髓瘤生物標志。本發(fā)明建立了一種檢測多發(fā)性骨髓瘤的血清蛋白質譜模型，其特征在于包括選自56個特征蛋白中任意兩個或兩個以上蛋白；所述特征蛋白質荷比m/z和臨界峰值均值M分別為m/z=8139，M《5.88;m/z=11682，M《0.78;m/z=22778，M《0.64;單克隆免疫球蛋白疾病k組和人組分型，在多發(fā)性骨髓瘤k類型m/^6191,M〉5.20，X類型m/z二6191，M《5.20;分子量(m/z)誤差〈0.01%,臨界峰值均值M的CV<510%。從血清中篩選出56蛋白作為特征蛋白；選取上述56個特征蛋白中的任意兩個或兩個以上的蛋白，根據各蛋白質峰的質荷比m/z值及以該蛋白的臨界峰值均值M，建立了多發(fā)性骨髓瘤患者與正常人、多發(fā)性骨髓瘤相鑒別的患者(P0EMS綜合癥；NHL;MGUS;CRF;風濕??；巨球蛋白血癥；或者其他伴有骨轉移的腫瘤)兩兩鑒別的血清特征蛋白檢測質譜模型。按照單克隆免疫球蛋白類型疾病分期對多發(fā)性骨髓瘤血清的蛋白質組進行分析；根據單克隆免疫球蛋白的輕鏈，所有的多發(fā)性骨髓瘤病人被分成兩組，k組和X組；來自多發(fā)性骨髓瘤病人的血清樣本被用于分析，在多發(fā)性骨髓瘤組的k和入類型中發(fā)現了幾個差異峰；對照入類型上的5190Da、6191Da、6308Da、6364Da、7098Da和11858Da的峰升高了，k類型上的22778Da,、22964Da和23188Da的峰下降了;m/z〉24kDa(24374,24553，24664)的三個峰，在k類型上也升高了，但是沒有其他升高的峰升高的那樣明顯；6191Da的峰可以作為標記蛋白來區(qū)分兩種類型的多發(fā)性骨髓瘤單克隆免疫球蛋白疾病k組和入組分型，在多發(fā)性骨髓瘤k類型m/^6191，M>5.20,入類型m/z二6191，M《5.20;比較所有類型的多發(fā)性骨髓瘤(IgG，IgA,IgD，唯一的k輕鏈和入輕鏈多發(fā)性骨髓瘤)和其他類型相比，6364Da和6449Da峰在IgD多發(fā)性骨髓瘤患者上呈顯著下降(P^.002,P=0.001)。上述質譜模型是采用以下步驟制備而得的1)4C條件下2小時內收集多發(fā)性骨髓瘤患者和健康人的血清兩組血清標本，在-80'C低溫冷凍備用；2)采用WCX陰離子基質磁珠或C8及C18疏水基質磁珠對所述兩組血清標本的蛋白進行吸附；3)用激光解吸/電離飛行時間質譜儀，用氮激光儀(337nm)和80cm或120cm飛行管分析陣列，或用電噴霧電離己洗脫的血清蛋白后用液相色譜質譜聯用儀(LC-MS)對結合在表面的WCX陰離子基質磁珠或C8及C18疏水基質磁珠上的兩組血清蛋白進行讀取，由此獲得兩組蛋白質譜圖譜；4)在每次實驗數據收集前，用標準蛋白及質譜的標準化質控0型血清校正儀器，使蛋白質分子量誤差<0.01%和臨界峰值均值M的CV<510%，并精確地、定量地收集多發(fā)性骨髓瘤患者和正常人優(yōu)化的血清質譜圖譜數據；5)對所得數據進行統(tǒng)計學處理，根據多發(fā)性骨髓瘤患者和正常人血清之間蛋白峰的差異，檢測出2組血清蛋白質譜圖譜之間有56個穩(wěn)定的差異蛋白及其臨界峰值；將所述56個差異蛋白作為多發(fā)性骨髓瘤蛋白質譜模型的特征蛋白；6)選取所述56個特征蛋白中任意兩個或兩個以上的蛋白，以各蛋白質峰的質荷比m/z值及以該蛋白的臨界峰值均值M構成用于檢測多發(fā)性骨髓瘤血清特征蛋白質譜模型；其中所述的特異蛋白質質荷比m/z和臨界峰值均值M分別為m/^8139，M《5.88;m/z=11682，M《0.78;m/z=22778，M《0.64;單克隆免疫球蛋白疾病k組和X組分型，在多發(fā)性骨髓瘤k類型m/z^6191，M〉5.20，入類型m/z=6191，M《5.20;分子量(m/z)誤差<0.01%，臨界峰值均值M的CV<510%。具體操作步驟如下1)4。C條件下2小時內收集經病理明確診斷的多發(fā)性骨髓瘤患者血清及經體檢確定為正常健康者的血清作為兩組血清標本，進行一8(TC低溫冷凍備用；病人和血清樣本隨后被分成兩組一組為訓練集，另一組為盲測組(表l);表l用于訓練集組和測試集組的血清樣本<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2)采用陰離子基質磁珠或C8及C18疏水基質磁珠對所述多發(fā)性骨髓瘤患者及正常人的兩組血清標本的蛋白進行吸附；3)用激光解吸/電離飛行時間質譜儀，用氮激光儀(337nm)和80cm或120cm飛行管分析陣列，或用電噴霧電離已洗脫的生物標志后用液相色譜質譜聯用儀(LC-MS)對結合在表面的WCX陰離子基質磁珠或C8及C18疏水基質磁珠上的兩組血清蛋白進行讀取，設定最高檢測分子量為50kDa，優(yōu)化分子量范圍100015000Da，最佳聚集中心8000Da，數據采集參數范圍2080，激光強度150180，檢測敏感度為78,收集總數為130次，由此獲得兩組蛋白質譜圖譜；4)在每次實驗數據收集前，用All-in-one標準蛋白及質譜的標準化質控O型血清校正儀器，用2746土1Da、5909土1Da、6634土1Da標準峰為質譜內標定性(分子量)質控標準，使分子量誤差<0.01%，從而獲得的精確的蛋白質譜圖譜；5)定量性質譜調控每次測試前，用質譜的標準化質控血清(漿)，將標準化質控血清中用于定量的標準峰6634.0Da等強度調至50%信號強度的最大值，使臨界峰值均值M的CV<510%，并收集精確的質譜圖譜數據；6)對所得數據進行Mann-WhitneyV檢驗統(tǒng)計學處理，根據多發(fā)性骨髓瘤患者和正常人血清之間蛋白峰值的差異(共得到260個蛋白峰，認定P值小于0.01時具有統(tǒng)計學意義)，檢測出2組血清蛋白指紋質譜圖譜之間有56個穩(wěn)定的差異蛋白，見表2:表2多發(fā)性骨髓瘤和對照組的56個差異峰<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>P由多發(fā)性骨髓瘤組(MM)和非多發(fā)性骨髓瘤組(non-MM)的對照產生標志著的峰被選為多發(fā)性骨髓瘤檢驗模型的標記峰圖l在訓練數據組的決定樹分類圖表母節(jié)點(頂端)的數目，子節(jié)點，和終節(jié)點1-4代表N組，MM(多發(fā)性骨髓瘤組)和non-麗(非多發(fā)性骨髓瘤組)總數。在母節(jié)點和子節(jié)點下面的數目是基于蛋白峰強度值的質量值。比如，在母節(jié)點的質量值是8139(Da)，強度《5.88。將上述56個差異蛋白作為多發(fā)性骨髓瘤質譜檢驗模型的特征蛋白。由于多個特征蛋白組合起來才可將多發(fā)性骨髓瘤與正常人等完全分開，故選取上述56個特征蛋白中的任意兩個或兩個以上的蛋白，根據各蛋白質峰的質荷比m/z值及以該蛋白的臨界峰值均值M，建立了多發(fā)性骨髓瘤患者與正常人、多發(fā)性骨髓瘤相鑒別的患者(POEMS綜合癥；NHL;MGUS;CRF;風濕??；巨球蛋白血癥；或者其他伴有骨轉移的腫瘤)兩兩鑒別的血清特征蛋白檢測質譜模型(圖l-5)，所說的特異蛋白質質荷比m/z和臨界峰值均值M分別為m/z:8139，M《5.88;ra/z=11682，M《0.78;m/z=22778，M《0.64((圖2(a)、(b)、(c)的上部是代表MM的校準圖(標記為麗1和麗2);圖2(a)、(b)、(c)的中部是non-醒對照[必須要和MM做鑒別診斷的疾病(標記為D1和D2);圖2(a)、(b)、(c)的下部是健康人群(標記為N1和N2)]的圖譜，有3個蛋白標記物；圖2(a)的m/z為8131;圖2(b)的m/z為11660;圖2(c)的m/z為22752)。臨界峰值均值M的CV〈510%。按照單克隆免疫球蛋白類型疾病分期對多發(fā)性骨髓瘤血清的蛋白質組進行分析；根據單克隆免疫球蛋白的輕鏈，所有的多發(fā)性骨髓瘤病人被分成兩組，k組和入組。來自多發(fā)性骨髓瘤病人的血清樣本被用于分析，在多發(fā)性骨髓瘤組的k和入類型中發(fā)現了幾個差異峰。對照入類型上的5190Da、6191Da、6308Da、6364Da、7098Da和11858Da的峰升高了，k類型上的22778Da，、22964Da和23188Da的峰下降了。m/z>24kDa(24374,24553,24664)的三個峰，在k類型上也升高了，但是沒有其他升高的峰升高的那樣明顯。6191Da的峰可以作為標記蛋白(圖4)來區(qū)分兩種類型的多發(fā)性骨髓瘤單克隆免疫球蛋白疾病k組和入組分型，在多發(fā)性骨髓瘤k類型m/z-6191，M>5.20，A類型m/zi191，M《5.20;比較所有類型的多發(fā)性骨髓瘤(IgG，IgA，IgD,唯一的k輕鏈和入輕鏈多發(fā)性骨髓瘤)和其他類型相比，6364Da和6449Da峰在IgD多發(fā)性骨髓瘤患者上呈顯著下降(Pi.002，P=0.001)(圖5)。利用該質譜模型，只要將受檢者血清中相應蛋白質的質荷比及該蛋白的臨界峰值均值M與本發(fā)明質譜模型逐一進行對比分析，就可用于多發(fā)性骨髓瘤(MM)檢驗表3多發(fā)性骨髓瘤對照非多發(fā)性骨髓瘤的蛋白譜和決定樹分類的標記物統(tǒng)計多發(fā)性骨髓瘤非多發(fā)性骨髓瘤<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>利用C8及C18疏水基質磁珠的實驗結果與上述WCX陰離子基質磁珠的實驗結果一致。本發(fā)明采用上述質譜模型可用于多發(fā)性骨髓瘤早期檢測、單克隆免疫球蛋白疾病k組和A組分型、IgG,IgA,IgD分類、篩査和復發(fā)、轉移的評估。所述質譜模型的應用方法，特征是將待檢樣品中相應蛋白質的質荷比及該蛋白的臨界峰值均值M與所述選自56個特征蛋白中任意兩個或兩個以上蛋白逐一進行對比分析。艮卩，只要在56個特征蛋白中任選兩個與待檢樣品中相比，就可以得知樣品中是否含有多發(fā)性骨髓瘤血清特征蛋白或其它一些疾病的特征蛋白，從而得到樣品陽性或陰性的檢測結果。本發(fā)明已證實，多發(fā)性骨髓瘤血清中的特征蛋白是m/z6191的特征蛋白。本發(fā)明根據上述質譜模型，還提供了一種用質譜方法檢測生物樣品中特異蛋白的試劑，其特征在于含有能與特異蛋白質結合的磁珠基質，所述磁珠是可吸附樣品中蛋白質WCX陰離子基質磁珠或C8及C18疏水基質磁珠。所述特異蛋白是多發(fā)性骨髓瘤、P0EMS綜合癥、NHL、MGUS、CRF、風濕病、巨球蛋白血癥、伴有骨轉移的腫瘤，以及單克隆免疫球蛋白疾病IgG,IgA，IgD分類中的蛋白。本發(fā)明的試劑的使用方法如下1)取樣46'C條件下收集待測者的血清標本，在-8(TC低溫冷凍備用；2)用本試劑中的磁珠對血清標本的蛋白進行吸附及用標準的質譜前處理(細見實施例1);3)用激光解吸/電離飛行時間質譜儀，用氮激光儀(337nra)和80cm或120cm飛行管分析陣列，或用電噴霧電離已洗脫的血清蛋白后用液相色譜質譜聯用儀(LC-MS)對結合在磁珠上的血清蛋白進行讀取，獲得蛋白質譜圖譜；4)與特征蛋白質譜模型進行對比選取蛋白質譜模型中56個特征蛋白中任意兩個或兩個以上的蛋白，對比各蛋白質峰的質荷比m/z值及以該蛋白的臨界峰值均值M。本發(fā)明用所述的試劑開發(fā)了檢測試劑盒，按盒中說明書的操作方法可用于檢測多發(fā)性骨髓瘤、POEMS綜合癥、NHL、MGUS、CRF、風濕病、巨球蛋白血癥、伴有骨轉移的腫瘤，以及單克隆免疫球蛋白疾病IgG，IgA，IgD分類。所述試劑盒中含有通常檢測蛋白質常規(guī)的其它試劑和設備，這些試劑和設備，本領域普通技術人員均熟知。如試劑盒，還含有可用質譜儀進行分析的陽性對照與陰性對照。在多發(fā)性骨髓瘤檢測試劑盒中，所述陽性對照是兩個或兩個以上的特征蛋白的質譜模型，所述特征蛋白質荷比m/z和臨界峰值均值M分別為m/z二8139，M《5.88;m/z=11682，M《0.78;m/z=22778，M《0.64;單克隆免疫球蛋白疾病k組和A組分型，在多發(fā)性骨髓瘤k類型m/z:6191，M>5.20，入類型m/zi191，M《5.20;分子量(m/z)誤差<0.01%，臨界峰值均值M的CV<510%。本發(fā)明的特點及效果本發(fā)明與其他多發(fā)性骨髓瘤的檢測方法比較，具有以下優(yōu)點-第一、本發(fā)明采用多發(fā)性骨髓瘤患者與正常人具有差異的多個特征蛋白組合起來進行對多發(fā)性骨髓瘤血清的檢測，提供的質譜模型是多發(fā)性骨髓瘤早期檢測和篩查的新方法和新途徑，并為進一步發(fā)現新的多發(fā)性骨髓瘤生物標志提供了基礎；第二、與以往的血清學檢測方法比較具有較高的敏感性和特異性，是一種在蛋白組學水平上的檢測，對多發(fā)性骨髓瘤的早期檢測提供了新標準；第三、本發(fā)明由于磁珠表面的結合面積遠遠大于蛋白芯片，從而磁珠的靈敏性比蛋白芯片更高而具有了更高的靈敏度，從而優(yōu)化了質譜模型；第四、本發(fā)明首創(chuàng)采用了定量性質譜調控，CV<510%，使磁珠的臨界峰值均值M比蛋白芯片更可靠及精確；第五、本發(fā)明采用了用質譜的標準化質控血清(漿)，將標準化質控血清(槳)中用于質譜內標定性的2746i1Da、5909土1Da、6634土1Da標準峰(分子量)質控標準，使分子量誤差<0.01%，從而獲得的精確的蛋白質譜圖譜；第六、本發(fā)明質譜模型的構建方法設計精確及合理可行，為降低我國多發(fā)性骨髓瘤的病死率、提高多發(fā)性骨髓瘤的臨床治愈提供了一種新的篩查和復發(fā)、轉移的評估方法、單克隆免疫球蛋白疾病k組和A組分型、IgG，IgA，IgD分類。圖1在訓練數據組的決定樹分類圖表(母節(jié)點(頂端)的數目，子節(jié)點(綠色長方形區(qū)域)，和終節(jié)點1-4(灰色長方形區(qū)域)代表N組，廳和non-麗總數。在母節(jié)點和子節(jié)點下面的數目是基于蛋白峰強度值的質量值。比如，在母節(jié)點的質量值是8131Da，強度《5.88);圖2多發(fā)性骨髓瘤代表性的質譜峰(圖2(a)、(b)、(c)的上部是代表畫的校準圖(標記為MM1和麗2);圖2(a)、(b)、(c)的中部是non-醒對照[必須要和畫做鑒別診斷的疾病(標記為D1和D2);圖2(a)、(b)、(c)的下部是健康人群(標記為N1和N2)]的圖譜，有3個蛋白標記物；圖2(a)的m/z為8131;圖2(b)的m/z為11660;圖2(c)的m/z為22752);圖3多發(fā)性骨髓瘤類型的鑒別模型的ROC曲線；圖4k和入類型的多發(fā)性骨髓瘤的6191Da標記峰(圖中橫坐標代表分子量(Da)、縱坐標代表質譜峰強度)；圖5IgD多發(fā)性骨髓瘤和其他類型的多發(fā)性骨髓瘤病人的6364Da標記峰(圖中橫坐標代表分子量(Da)、縱坐標代表質譜峰強度)。圖中m/z表示特異蛋白的質荷比，M代表該特異蛋白的臨界峰值均值。具體實施例方式本發(fā)明將結合具體實施例作進一步說明，這些實例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。實施例中實驗材料來源如下-陰離子的WCX磁珠(愛睦世、CX)、C8及C18的疏水基質磁珠(愛睦世《C8及C18)、ElutionBuffer(愛睦世"'EB)和標準化質控0型血清(愛睦世"標血O)購買于北京愛睦世健康科技有限公司；9mol/L尿素，2%CHAPS，1%DTT，50mmol/LTris-CL;100咖ol/LNaAc;SPA(SinapinicAcid)飽和溶液；all-in-one標準蛋白購買于美國Sigma公司。實施例1正常與多發(fā)性骨髓瘤患者的區(qū)分及質譜的試劑盒制備(1)實驗方法此研究中應用的所有連續(xù)的54個患有多發(fā)性骨髓瘤的病人(男性37例，女性17例)。他們的平均年齡是58歲(從46歲到83歲)。新診斷的有25例病人，根據Durie/Salmon分期系統(tǒng)，其中7例是多發(fā)性骨髓瘤II期，18例是III期，29例在收集了血液樣本后進行了化療(6例達到了完全緩解，13例部分緩解，5例復發(fā)，5例有其他狀況)。在29例進行化療的病人中，抽出了13例在已有2或3次抽樣化療后，進行了第二次化療。這些病人的血樣是從血清收集的。108例非多發(fā)性骨髓瘤的對照血清樣本，來自于健康志愿者(n=62)或者有其他疾病的患者，這些疾病必須與多發(fā)性骨髓瘤相鑒別(POEMS綜合癥，n=4):NHL，n=7;MGUS，n=6;CRF，n=5，風濕病(n=14);巨球蛋白血癥，n=5;或者其他伴有骨轉移的腫瘤，n=5)。磁珠操作歩驟血清樣品處理從-80。C冰箱中取出血清，于4。C，10OOOrpm離心5min。取IO叱血清樣品，加20叱U9處理液(9mol/L尿素，2。/。CHAPS，1雷T,50腿ol/LTris-CL，pH9.0),充分混勻，冰浴振蕩30min后取出，加入360叱結合緩沖液(10O腿ol/LNaAc,pH4.0)，立即混勻。所有樣本在分析前僅被凍溶一次(劉建棟等，血液蛋白質組與質譜儀檢測流程標準化初探?；A醫(yī)學與臨床，2007,27:193-197)。病人和血清樣本隨后被分成兩組一組為訓練集，另一組為盲測組(表5)。表5用于訓練集組和測試集組的血清樣本<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>磁珠上樣及洗脫將處理好的樣品IOO叱加至己裝好WCX磁珠(弱陰離子表面，羧酸基團，捕獲正電荷基團蛋白)的PCR管中，置磁性處理器上孵育30min，除去液體。加IOO叱磁珠結合緩沖液(50mraol/LNaAc,pH4.04.3)至己裝好WCX磁珠的PCR管，置磁性處理器上孵育2分鐘，除去液體，重復上述操作2次。加10^ElutionBuffer2min，洗脫標本至上清液。取5^上清液移至另一個PCR管中，加入5叱SPA飽和溶液充分混勻，取lPL混合溶液加樣到Au或Steel片上，晾干后上機測量。數據收集將處理好的Au或Steel片置入MALDI-TOF-MS進行蛋白質譜分析。在讀取數據前，用加有all-in-one標準蛋白質的芯片校正質譜儀，使分子量誤差〈0.1%。本研究中閱讀儀的主要參數設定為，最高檢測分子量為50kDa,優(yōu)化分子量范圍100015000Da，最佳聚集中心8000Da，數據采集參數范圍2080，收集總數為130次。軟件中設定讀片程序，以讀取數據。定量性控制及質譜激光能量調控每次測試前，用質譜的標準化質控血清(漿)，將標準化質控血清(漿)中用于定量的標準峰6634.0Da強度調至50y。質譜信號強度的最大值。用2746土1Da、5909土1Da、6634土1Da標準峰為質譜內標定性(分子量)質控標準，使分子量誤差<0.01%，從而獲得的精確的蛋白質譜圖譜。統(tǒng)計學分析應用軟件分析處理所有峰譜，形成蛋白質譜圖譜。所有的圖譜都進行了標準化，統(tǒng)一到它們自己全部的離子總數(峰面積的總和)。將標準化質控血清中用于定量的標準峰6634.0Da強度調至4050%信號強度的最大值，并且用最顯著的峰進行了校正，而后又進行了"減少基線"，定義蛋白峰(s/n>5，最小的峰強度>1.6)。分析所有150kDa之間的蛋白峰，并且仔細檢査了每個相應的峰，計算出峰的平均值M，標準誤差(SD)和變異系數(CV%)。用Mann-Whitney〃檢驗比較配對樣本的蛋白峰，計算尸值。多發(fā)性骨髓瘤檢測多肽蛋白篩選用Mann-Whitney"檢驗比較配對樣本的蛋白峰，CV<510%;初步分析篩選出尸<0.01的多發(fā)性骨髓瘤患者與正常人群有56個差異多肽蛋白，不同峰的分子量(m/z)及特征蛋白的表達變化見表6:表6多發(fā)性骨髓瘤和對照組的56個差異峰<table>complextableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>m/z表示質荷比；P由多發(fā)性骨髓瘤組(MM)和非多發(fā)性骨髓瘤組(non-應)的對照產生；標志著的峰被選為多發(fā)性骨髓瘤檢驗模型的標記峰；圖l在訓練數據組的決定樹分類圖表母節(jié)點(頂端)的數目，子節(jié)點，和終節(jié)點1-4代表N組，MM(多發(fā)性骨髓瘤組)禾卩non-麗(非多發(fā)性骨髓瘤組)總數。在母節(jié)點和子節(jié)點下面的數目是基于蛋白峰強度值的質量值。比如，在母節(jié)點的質量值是8139(Da)，強度《5.88。將上述56個差異蛋白作為多發(fā)性骨髓瘤質譜檢驗模型的特征蛋白；實施例2臨床試用及雙盲測試；由于多個特征蛋白組合起來才可將多發(fā)性骨髓瘤與正常人等完全分開，故選取上述56個特征蛋白中的任意兩個或兩個以上的蛋白，根據各蛋白質峰的質荷比m/z值及以該蛋白的臨界峰值均值M，建立了多發(fā)性骨髓瘤患者與正常人、多發(fā)性骨髓瘤相鑒別的患者(POEMS綜合癥；NHL;MGUS;CRF;風濕??；巨球蛋白血癥；或者其他伴有骨轉移的腫瘤)兩兩鑒別的血清特征蛋白檢測質譜模型(圖卜5)，所說的特異蛋白質質荷比m/z和臨界峰值均值M分別為m/z-8139，M《5.88;m/z=11682，M《0,78;m/z=22778，M《0.64((圖2(a)、(b)、(c)的上部是代表MM的校準圖(標記為MM1和MM2);圖2(a)、(b)、(c)的中部是non-畫對照[必須要和麗做鑒別診斷的疾病(標記為D1和D2);圖2(a)、(b)、(c)的下部是健康人群(標記為N1和N2)]的圖譜，有3個蛋白標記物；圖2(a)的m/z為8131;圖2(b)的m/z為11660;圖2(c)的m/z為22752)。臨界峰值均值M的CV〈510%。按照單克隆免疫球蛋白類型疾病分期對多發(fā)性骨髓瘤血清的蛋白質組進行分析；根據單克隆免疫球蛋白的輕鏈，所有的多發(fā)性骨髓瘤病人被分成兩組，k組和A組。來自多發(fā)性骨髓瘤病人的血清樣本被用于分析，在多發(fā)性骨髓瘤組的k和X類型中發(fā)現了幾個差異峰。對照A類型上的5190Da、6191Da、6308Da、6364Da、7098Da和11858Da的峰升高了，k類型上的22778Da,、22964Da和23188Da的峰下降了。m/z>24kDa(24374，24553，24664)的三個峰，在k類型上也升高了，但是沒有其他升高的峰升高的那樣明顯。6191Da的峰可以作為標記蛋白(圖4)來區(qū)分兩種類型的多發(fā)性骨髓瘤單克隆免疫球蛋白疾病k組和入組分型，在多發(fā)性骨髓瘤k類型m/z:6191，M〉5.20，入類型m/zi191，M《5,20;在多發(fā)性骨髓瘤k類型的平均峰高是8.218，A類型的平均峰高是2.365。比較所有類型的多發(fā)性骨髓瘤(IgG,IgA，IgD，唯一的k輕鏈和入輕鏈多發(fā)性骨髓瘤)和其他類型相比，6364Da和6449Da峰在IgD多發(fā)性骨髓瘤患者上呈顯著下降(P=0.002,P=0.001)(圖5)。利用該質譜模型，只要將受檢者血清中相應蛋白質的質荷比及該蛋白的臨界峰值均值M與本發(fā)明質譜模型逐一進行對比分析，就可用于多發(fā)性骨髓瘤(MM)檢驗。表7多發(fā)性骨髓瘤對照非多發(fā)性骨髓瘤的蛋白譜和決定樹分類的標記物統(tǒng)計多發(fā)性骨髓瘤非多發(fā)性骨髓瘤<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>利用該質譜模型(圖1)，將受檢者血清中相應蛋白質的質荷比及該蛋白的臨界峰值均值M與本發(fā)明的質譜模型逐一進行對比分析，經臨床試用及雙盲測試，其鑒別多發(fā)性骨髓瘤患者與對照組的敏感性為86.67%，特異性為81.36%:對全盲測試組(30例多發(fā)性骨髓瘤和59例對照組)分析，從30例多發(fā)性骨髓瘤標本中正確的區(qū)分出了26例(86.67%)，在59例作為非多發(fā)性骨髓瘤的對照組中正確的區(qū)分出了48例(81.36%)(表4)。更重要的是此檢測模型從需要和多發(fā)性骨髓瘤做鑒別的疾病中成功的區(qū)分出了多發(fā)性骨髓瘤(比如說MGUS，NHL等等)。表8多發(fā)性骨髓瘤檢測模型的預測結果分組例數正確分類準確率％多發(fā)性骨髓瘤302686.67對照組594881.36利用C8及C18疏水基質磁珠的實驗結果與上述WCX陰離子基質磁珠的實驗結果一致。為一種新的非侵入性的體外質譜檢測方法。本發(fā)明可以應用到已經脫離人體的體液中的多發(fā)性骨髓瘤生物標志組合的檢測方法或試劑盒。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。權利要求1.一種用質譜方法檢測生物樣品中特異蛋白的試劑，其特征在于含有能與特異蛋白質結合的磁珠基質，所述磁珠是可吸附樣品中蛋白質的WCX陰離子基質磁珠或C8及C18疏水基質磁珠。2、權利要求l所述的試劑，所述特異蛋白是多發(fā)性骨髓瘤、P0EMS綜合癥、NHL、MGUS、CRF、風濕病、巨球蛋白血癥、伴有骨轉移的腫瘤，以及單克隆免疫球蛋白疾病IgG,IgA，IgD分類中的蛋白。3、一種檢測試劑盒，其特征在于含有權利要求l所述的試劑和說明書。4、權利要求3所述的試劑盒，其特征在于還含有陽性對照與陰性對照，所述對照可用質譜儀進行分析。5、權利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述陽性對照是兩個或兩個以上的特征蛋白的質譜模型，所述特征蛋白質荷比ffl/z和臨界峰值均值M分別為m/z^139，M《5.88;m/z=11682，M《0.78;m/z=22778，M《0.64;單克隆免疫球蛋白疾病k組和X組分型，在多發(fā)性骨髓瘤k類型m/z二6191，M>5.20，人類型m/z-6191，M《5.20;分子量(m/z)誤差<0.01%，臨界峰值均值M的CV〈510%。6、一種檢測多發(fā)性骨髓瘤的血清蛋白質譜模型，其特征在于包括選自56個特征蛋白中任意兩個或兩個以上蛋白；所述特征蛋白質荷比m/z和臨界峰值均值M分別為m/^8139，M《5.88;m/z=11682，M《0.78;m/z=22778，M《0.64;單克隆免疫球蛋白疾病k組和入組分型，在多發(fā)性骨髓瘤k類型in/zz6191，M>5.20，A類型m/z二6191，M《5.20;分子量(m/z)誤差<0.01%，臨界峰值均值M的CV〈5亂7、權利要求6所述的質譜模型的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)4'C條件下2小時內收集多發(fā)性骨髓瘤患者和健康人的血清兩組血清標本，在-80°C低溫冷凍備用；2)采用WCX陰離子基質磁珠或C8及C18疏水基質磁珠對所述兩組血清標本的蛋白進行吸附；3)用激光解吸/電離飛行時間質譜儀，用氮激光儀(337nm)和80cm或120cm飛行管分析陣列，或用電噴霧電離己洗脫的血清蛋白后用液相色譜質譜聯用儀(LC-MS)對結合在表面的WCX陰離子基質磁珠或C8及C18疏水基質磁珠上的兩組血清蛋白進行讀取，由此獲得兩組蛋白質譜圖譜；4)在每次實驗數據收集前，用標準蛋白及質譜的標準化質控0型血清校正儀器，使蛋白質分子量誤差〈0.0P/。和臨界峰值均值M的CV<510%，并精確地、定量地收集多發(fā)性骨髓瘤患者和正常人優(yōu)化的血清質譜圖譜數據；5)對所得數據進行統(tǒng)計學處理，根據多發(fā)性骨髓瘤患者和正常人血清之間蛋白峰的差異，檢測出2組血清蛋白質譜圖譜之間有56個穩(wěn)定的差異蛋白及其臨界峰值；將所述56個差異蛋白作為多發(fā)性骨髓瘤蛋白質譜模型的特征蛋白；6)選取所述56個特征蛋白中任意兩個或兩個以上的蛋白，以各蛋白質峰的質荷比m/z值及以該蛋白的臨界峰值均值M構成用于檢測多發(fā)性骨髓瘤血清特征蛋白質譜模型；其中所述的特異蛋白質質荷比m/z和臨界峰值均值M分別為m/z二8139，M《5.88;m/z=11682，M《0.78;m/z=22778，M《0.64;單克隆免疫球蛋白疾病k組和X組分型，在多發(fā)性骨髓瘤k類型m/z-6191，M〉5.20,入類型m/z=6191，M《5.20;分子量(m/z)誤差<0.01%，臨界峰值均值M的CV<510%。8、權利要求6所述的質譜模型的應用方法，其特征在于將待檢樣品中相應蛋白質的質荷比及該蛋白的臨界峰值均值M與所述選自56個特征蛋白中任意兩個或兩個以上蛋白逐一進行對比分析。9、權利要求8所述的質譜模型的應用方法，其特征在于所述蛋白是m/z6191的特征蛋白。全文摘要本發(fā)明建立了一種檢測多發(fā)性骨髓瘤的血清蛋白質譜模型，本發(fā)明發(fā)現了多發(fā)性骨髓瘤的血清蛋白中具有56個特征蛋白，選取其中任意兩個或兩個以上蛋白，并用質譜分析，可檢測多發(fā)性骨髓瘤等疾病。本發(fā)明根據所述質譜模型，開發(fā)了用質譜方法檢測生物樣品中特異蛋白的試劑和試劑盒。文檔編號G01N27/64GK101354379SQ20081012787公開日2009年1月28日申請日期2008年7月7日優(yōu)先權日2008年1月18日發(fā)明者梁玉芳,王清濤,翟玉華,洋許,趙冠飛,陳文明申請人:洋許