專利名稱：蛋白質(zhì)等電聚焦電泳的方法及其裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是電化學方法分析材料技術(shù)領(lǐng)域的方法和裝置，具體是基于移動反應(yīng)界面(moving reaction boundary, MRB)的蛋白質(zhì)等電聚焦電泳(isoelectricfocusing, IEF)方法及其裝置。
背景技術(shù)：
IEF技術(shù)為蛋白質(zhì)高效分離技術(shù)，其原理是利用兩性電解質(zhì)在凝膠中創(chuàng)造一個PH梯度，同時利用蛋白質(zhì)具有兩性解離和等電點的特點，對蛋白質(zhì)進行分離分析(P.G.Righttij In:T.S.Work and R.H.Rurdonj Laboraotary Techniques in Biochemistryand Molecular Bioboligy, Elsevier Biomedical Press,Amesterdam New YorkOxford, V II，1983，p.1-86，268-313)。IEF具有分離效率高、分離富集同時完成、上樣模式多樣等優(yōu)點。IEF技術(shù)應(yīng)用廣泛，它不僅是蛋白質(zhì)pi表征和純度鑒定的標準分析技術(shù)(0.Vesterbergj Acta Chem.Scand.1969，23，2653)；同時也是復(fù)雜蛋白質(zhì)及其組學研究中的關(guān)鍵分離技術(shù)(S.Nileshj E.Scott, Nature Protocols, 2006，1，1732)，在雙向凝膠電泳中總是作為第一向分離技術(shù)(P.H.0’ Farrell，J.Biol.Chem.1975，250，4007 ；A.D.Rolland，B.Evrardj N.Guittonj J.Proteome Res.2007，6，683)?；诔Ｒ?guī)凝膠電泳的IEF技術(shù)主要二種，包括:(i)、管式凝膠IEF技術(shù)(L.E.M.Miles, G.E.Simmons, A.Chrambachj Anal.Biochem.1972, 49, 109) ； (ιι)λ 薄層凝膠 IEF 技術(shù)(P.G.Righttij In:T.S.Work and R.H.Rurdonj Laboraotary Techniques inBiochemistry and Molecular Bioboligyj Elsevier Biomedical Press, AmesterdamNew York Oxford, v II，1983，p.1-86, 268-313)。但在這兩種凝膠 IEF 電泳技術(shù)中始終存在 pH 梯度漂移(drifting of pH gradient, H.Rilbej In:Electrofocusingand Isotachophoresis(Editors:B.J.Radola and D.Graesl in) , Walter deGruyter&C0., Berlin New York，1977，p35_50)和水平化(plateau of pH gradient, P.Arosioj E.Grana and P.G.Righettij J.Chromatogr.1978，166，55)現(xiàn)象造成的不穩(wěn)定性。并且在雙向凝膠電泳(two dimensional gel electrophoresis, 2DE)中，由于管式和薄層凝膠IEF的凝膠很難取出，取出后也很難完整的進行后續(xù)的轉(zhuǎn)移操作；因此，基于常規(guī)凝膠電泳的第一向IEF分離技術(shù)很難與第二向的SDS-PAGE電泳兼容。為了克服常規(guī)凝膠IEF技術(shù)穩(wěn)定性問題以及與SDS-PAGE電泳兼容性問題，Rightti等于上世紀八十年代發(fā)明了固定化pH梯度(immobilized pH gradient, IPG)膠條以及基于 IPG 膠條的 IEF 技術(shù)((A Cor,., W.Postelj R.Westermeierj B.Bjellqvistj K.Ekj E.Gianazzaj P.G.Righettij Prot.Biol.Fluidsl983，30，607 ;Α.Gorg,W.Postelj R.Westermeierj B.Bjellqvistj K.Ekj E.Gianazzaj P.G.Righettij Prot.Biol.Fluidsl983, 30，607)。由于較好地解決了傳統(tǒng)凝膠IEF技術(shù)穩(wěn)定性和兼容性等問題，基于IPG膠條的IEF是目前應(yīng)用最廣泛的聚焦電泳技術(shù)，已經(jīng)成為2DE的第一向標準分離技術(shù)(S.Nileshj E.ScottjNature Protocols，2006，1，1732)。相關(guān)的 IEF 技術(shù)體系、IPG 膠條以及配套儀器等主要有美國GE公司通用電氣醫(yī)療集團生命科學部(http://gehealthcare.bioon.com.cn/)和 Bio-Rad 公司(http://www.bio-rad.com/)提供。但IPG技術(shù)帶來一些新的問題。第一、由于IPG膠條是直接放在正負電極上，膠條兩端沒有電極液，所以無法有效控制pH梯度的形成，進而對pH梯度進行調(diào)控，這特別不利于酸性和/或堿性蛋白的分離分析；第二、在IPG電泳技術(shù)中，由于兩性電解質(zhì)的固化導致不同Pl的蛋白質(zhì)非同步聚焦，造成IEF分辨率的明顯下降。第三、IPG技術(shù)消耗了 IEF體系中大量的活性極性基團，增加了 PH梯度形成后IEF體系的疏水性，導致聚焦電泳時蛋白質(zhì)很容易沉淀，嚴重影響IEF和2DE穩(wěn)定性以及后續(xù)定量分析的不確定性。因此，亟待發(fā)明一種新的IEF技術(shù)，該IEF技術(shù)能夠較好解決上述IEF時的蛋白質(zhì)沉淀、非同步聚焦和pH梯度的調(diào)控等問題。在新近的研究中，我國學者Cao等提出了系統(tǒng)的移動反應(yīng)界面(moving reaction boundary, MRB)概念和理論(C.-X.Ca。，Acta Phys.-Chim.Sin.1997，13，827 ; C.-X.Cao, Acta Chem.Scand.1998，52，709 ; C.X.Cao, L.Y.Fan, W.Zhang, Analyst2008, 133，1139)，并且基于 MRB 概念 Cao 和 Liang 等建立了較系統(tǒng)的 IEF動力學理論(C.X.Cao, J.Chromatogr.A1998，813, 153 ；C.-X.Cao, J.-H.Zhu, H.Liu, ff.-Η.Fang, ff.-Z.Tang, L.-H.Song, ff.-K.Chen, Acta Chem.Scand.1999, 53, 955.C.X.Cao, L.Y.Fan, ff.Zhang, Analyst2008, 133, 1139; H.Liang, Y.Chen, L.J.Tian, L.Zhang, Electrophoresis2009, 30，3134)。這些前期研究結(jié)果為上述問題的解決創(chuàng)造了重要條件，并且為較穩(wěn)定IEF技術(shù)的設(shè)計等提供了關(guān)鍵基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種蛋白質(zhì)等電聚焦電泳的方法及其裝置，發(fā)展了蛋白質(zhì)等電聚焦電泳的方法與器件，目的在于提高在IEF中的pH梯度可調(diào)控性，解決現(xiàn)有IPG-1EF的蛋 白質(zhì)沉淀和非同步聚焦問題，提高IEF的穩(wěn)定性和分辨率。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:制備含有電極液的多孔親水材料作為酸性墊和堿性墊，然后將酸性墊置于電泳槽內(nèi)的陽極，并與經(jīng)過水化上樣的固化或非固化PH梯度膠條的一端接觸；將堿性墊置于電泳槽內(nèi)的陰極，并與膠條的另一端接觸，陰極和陽極端再經(jīng)輕壓固定確保實現(xiàn)電連接，最后滴加硅油覆蓋整個電泳槽內(nèi)的膠條與酸性電極液墊和堿性電極液墊，并施加直流電壓，通過逐步增加電壓實現(xiàn)等電聚焦電泳測試。在基于MRB的穩(wěn)定pH梯度控制時，所述的酸性墊為酸性電極液墊，其中所含的電極液為:H2S04、HC1、HBr, H1、HNO3> CH3COOH, H3PO4、或者上述混合溶液的除HF外的酸性電解質(zhì)，酸性電極液濃度為5mM 200mM ;所述的堿性墊為堿性電極液墊，其中的電極液為:NaOH, NH4OH, H2NCH2CH2NH2、或者上述混合溶液的除KOH外的堿性電解質(zhì)，堿性性電極液濃度為 5mM 200mM。在基于MRB和擴散技術(shù)設(shè)計非線性pH梯度調(diào)控時，所述的酸性墊為酸性擴散調(diào)控墊，其中所含的電極液為:H2S04、HCUHBr, HI, HNO3> CH3COOH, H3PO4、或者上述混合溶液的酸性電解質(zhì)，濃度為200mM 2000mM ;所述的堿性墊為堿性電極液墊，其中的電極液為:Na0H、NH40H、H2NCH2CH2NH2、或者上述混合溶液的除KOH外的堿性電解質(zhì)，濃度為200mM 2000mM。所述的酸性墊和堿性墊的基材為:濾紙、脫脂棉、海綿或無紡布，其長度是與所在的電泳槽兩端電極到電泳槽道端部之間的距離相適應(yīng)，為4.5_ 12_ ;其寬度與所在的電泳槽的槽道寬度匹配，為2.5 6.5mm,其厚度為0.6mm 4mm。本發(fā)明涉及一種實現(xiàn)pH梯度調(diào)控、避免蛋白質(zhì)沉淀和非同步聚焦的非固化pH梯度膠條，即non-1PG膠條，包括:包含具有親水面并直接與聚丙烯酰胺凝膠聚合的凝膠支持膜、承載蛋白質(zhì)樣品并與支持膜鍵合的抗對流介質(zhì)、形成PH梯度并增加親水性的兩性載體電解質(zhì)和儲存保護non-1PG-1EF的保護膜。所述的凝膠支持膜的其中一面是具有乙烯基團的聚酯材料的薄膜，以便與聚丙烯酰胺凝膠牢固鍵合。所述的凝膠支持膜的寬度為2.5 4.5mm;長度為3.5cm 24cm ;其厚度為
0.15mm 0.35mm。

所述的抗對流介質(zhì)材料由聚丙烯酰胺凝膠，其濃度T為2 10% (質(zhì)量百分比濃度)，交聯(lián)度C為2 6%。所述的抗對流介質(zhì)的長度為3.5cm 24cm,厚度為0.45mm 0.65mm,寬度為2.5 4.Smnin所述的保護膜的材料為聚乙烯膜或聚酯膜或腈綸膜或尼龍膜；其長度和寬度均與凝膠支持膜相匹配，寬度為2.5 4.5mm ;長度為3.5cm 24cm ;厚度為40 μ m 100 μ m。本發(fā)明涉及一種實現(xiàn)上述方法的電泳槽，包括:設(shè)有若干個槽道的聚焦槽框架、散熱底板、用于壓制酸性墊或堿性墊的蓋板和電極部件，其中:聚焦槽框架和散熱底板相互契合，電極部件固定于聚焦槽框架和散熱底板之間，蓋板與散熱底板相互配合。所述的聚焦槽框架有楔形頭且與散熱底板上的楔形孔相配合。所述的聚焦槽框架有定位孔且與蓋板上的定位片相配合。所述的電極部件包括:相互接觸的電極絲和電極片，其中:電極絲的電極絲環(huán)貼在環(huán)聚焦槽框架上所開的電極螺絲孔上。所述的聚焦槽框架的槽道個數(shù)為6 12個，聚焦槽框架沿槽道方向的長度為7cm 24cm。
技術(shù)效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用移動反應(yīng)界面MRB通過設(shè)計穩(wěn)定pH梯度控制方法和器件，提高IEF的可調(diào)控性；基于MRB和擴散技術(shù)設(shè)計非線性pH梯度調(diào)控方法和器件，進一步提高PH梯度調(diào)控范圍和分辨率；基于MRB和親水相互作用設(shè)計非固化pH梯度膠條(non-1PG膠條)，解決IPG-1EF的蛋白質(zhì)非同步聚焦和沉淀問題，提高分辨率和穩(wěn)定性。


圖1為基于MRB的穩(wěn)定pH梯度控制的電泳槽的縱向橫截面圖；圖2為基于MRB的穩(wěn)定pH梯度控制的實驗結(jié)果；圖3為基于MRB和擴散技術(shù)設(shè)計非線性pH梯度的電泳槽的縱向橫截面圖；圖4為基于MRB和擴散技術(shù)設(shè)計非線性pH梯度調(diào)控的實驗結(jié)果；圖5為實施例1和實施例3使用的非固化pH梯度膠條(non-1PG膠條)示意圖；圖6為電泳槽的結(jié)構(gòu)分解圖。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。
實施例1如圖1所示，本實施例是基于MRB的穩(wěn)定pH梯度控制的實例，實施方法具體如下:I)對IPG或non-1PG膠條I進行水化上樣；2)制備IEF酸性電極液墊2和堿性電極液墊3 ；
3)將水化后的IPG或non-1PG膠條放入IEF電泳槽4 ;4)將酸性電極液墊2和堿性電極液墊3分別放置于電泳槽4的陽極5和陰極6，并使其接觸良好；5)將所述蓋板7輕壓酸性電極液墊2和堿性電極液墊3，之后滴加硅油覆蓋整個膠條I ;6)通直流電，并程序性升壓，進行等電聚焦電泳實驗。圖1顯示所述的電泳槽4，其中，電泳槽4是導熱系數(shù)較高的材料制作，如導熱塑料(2 IOff HT1K-1)或?qū)崽沾?5 150W HT1K-1)或它們的混合材料(2 30W mH有良好的散熱效果，所述膠條I放置在電泳槽4的上面，其在等點聚焦過程中產(chǎn)生的熱量會通過所述電泳槽4散去。所述膠條I放置在電泳槽4槽道內(nèi)，其長度比正電極絲和負電極絲之間的間距要略微短些，其兩端離陽極5和陰極6有適當?shù)目臻g，酸性電極液墊2和堿性電極液墊3各自一端放在膠條I上，另一端放置在陽極5或者陰極6上面，起到一個連接橋的作用，并且酸性電極液墊2和堿性電極液墊3分別浸泡正極電極液和負極電極液。等電聚焦電泳時，蓋板7適當落入電泳槽4中，其作用是適當壓緊酸性電極液墊2和堿性電極液墊3與膠條I接觸，使其導 電良好。接通直流電源即可進行等電聚焦實驗。所述的酸性電極液墊2，其中所含的電極液為:H2S04、HCUHBr, HI, HNO3> CH3COOH,H3PO4、或者上述混合溶液的酸性電解質(zhì)，但HF除外，酸性電極液濃度為5mM 200mM ;所述的堿性電極液墊3，其中的電極液為:Na0H、NH40H、H2NCH2CH2NH2、或者上述混合溶液的堿性電解質(zhì)，但KOH除外,堿性電極液濃度為5mM 200mM。所述的酸性電極液墊2和堿性電極液墊3的基材為:濾紙、脫脂棉、海綿或無紡布，其長度是與所在的電泳槽兩端電極到電泳槽道端部之間的距離相適應(yīng)，為4.5mm 12mm ；其寬度與所在的電泳槽的槽道寬度匹配，為2.5 6.5mm,其厚度為0.6mm 3mm。
實施例2如圖2所示，本實施例為基于MRB的穩(wěn)定pH梯度控制的對比實驗結(jié)果。在此描述的實驗中，對有酸性和堿性電極液墊控制的IEF實驗(圖2A)和沒有酸性和堿性電極液墊控制的IEF實驗(圖2B)進行比較。在圖2A中，所述的酸性電極液墊中使用的酸性電極液為H3PO4溶液，濃度為150mM，所述的堿性電極液墊中使用的堿性電極液為H2NCH2CH2NH2,濃度為200mM。而在圖2B中，不使用酸性和堿性電極液墊。實驗中可見的幾種蛋白質(zhì)樣品分別為藻藍蛋白(p1:4.45)、肌紅蛋白(pi:6.8和7.0)、血紅蛋白(p1:7.1和7.5)、細胞色素C (pi:9.6)。圖2A中使用的方法可以很好的控制pH梯度的漂移。與下面的圖2B對比后可以看出，藻藍蛋白的相對位置聚焦在4.3附近，肌紅蛋白和血紅蛋白相對位置分別聚焦在6.7 6.85和7.1 7.3，細胞色素C相對位置設(shè)定在9.6，這些相對位置基本與各自的pi值接近。而在圖2B中，藻藍蛋白相對位置在pH4.55 4.7，肌紅蛋白和血紅蛋白相對位置分別聚焦在7.95 8.1和8.55，細胞色素C相對位置設(shè)定在9.6，說明pH梯度有明顯的陰極漂移現(xiàn)象。圖2A和2B的對比實驗結(jié)果說明在此描述的pH梯度可以很好的控制蛋白質(zhì)的漂移。
實施例3如圖3所示，本實施例是基于MRB和擴散技術(shù)設(shè)計非線性pH梯度調(diào)控實例，其具體方法是:I)對IPG或non-1PG膠條I進行水化上樣；2)制備IEF酸性擴散調(diào)控墊8和堿性擴散調(diào)控墊9 ；3)將酸性擴散調(diào)控墊8和堿性擴散調(diào)控墊9分別放置于電泳槽4的陽極5和陰極6，并使其接觸良好；4)將水化后的IPG或non-1PG膠條I放入IEF電泳槽4，并使膠面與電泳槽底部接觸；5)將所述蓋板7輕壓膠條的陽極端和陰極端，并分別于酸性調(diào)控墊8和堿性調(diào)控墊9電連接，之后滴加硅油覆蓋整個膠條I ;6)通直流電，并程序性升壓，進行等電聚焦電泳實驗。所述的酸性擴散調(diào)控墊，其中所含的電極液為:H2S04、HC1、HBr、H1、HN03、CH3COOH,H3PO4、或者上述混合溶液的酸性電解質(zhì)，濃度為150mM 2000mM ;所述的堿性擴散調(diào)控墊，其中的電極液為:NaOH 、NH4OH, H2NCH2CH2NH2、或者上述混合溶液的除KOH以外的堿性電解質(zhì)，濃度為150mM 2000mM。所述的酸性擴散調(diào)控墊和堿性擴散調(diào)控墊的基材為:濾紙、脫脂棉、海綿或無紡布，其長度是與所在的電泳槽兩端電極到電泳槽道端部之間的距離相適應(yīng)，為4.5mm 12mm ;其寬度與所在的電泳槽的槽道寬度匹配,為2.5 6.5mm,其厚度為0.6mm 3mm。
實施例4如圖4所示，本實施例為基于MRB和擴散技術(shù)設(shè)計非線性pH梯度調(diào)控的實驗結(jié)果。在此描述的實驗中，對有高濃度酸性和堿性電極液墊控制的IEF實驗(圖4A)和只有酸性和堿性電極液墊控制的IEF實驗(圖4B)進行比較。在圖4A中，所述的高濃度酸性電極液墊中使用的酸性電極液為H3PO4溶液，濃度為150mM，所述的高濃度堿性電極液墊中使用的堿性電極液為H2NCH2CH2NH2，濃度為lOOOrnM。而在圖4B中，使用的是實施例2A中所述的酸性和堿性電極液墊，即酸性電極液為H3PO4溶液，濃度為150mM，堿性電極液為H2NCH2CH2NH2,濃度為200mM。實驗中可見的幾種蛋白質(zhì)樣品分別為操監(jiān)蛋白(pi:4.45)、肌紅蛋白(p1:
6.8和7.0)、血紅蛋白(pi:7.1和7.5)、細胞色素C (p1:9.6)。在圖4A中，藻藍蛋白相對聚焦位置在3.6，肌紅蛋白和血紅蛋白相對聚焦位置分別在4.4 4.85和5.05 5.4，細胞色素C相對聚焦位置設(shè)定在9.6，明顯的拉大了陰極端的pH梯度范圍，并且可以看出幾條褐色的條帶分辨率提高了，說明拉大陰極端PH梯度范圍可以很好的用于陰極端堿性蛋白樣品的分離，這對于堿性蛋白質(zhì)樣品的重點分析有重要意義。而在圖4B中，藻藍蛋白聚焦位置在4.3，肌紅蛋白和血紅蛋白位置分別在pH6.65 6.85和7.1 7.3，細胞色素C聚焦位置設(shè)定在PH9.6，進一步對比分析可以看出褐色蛋白的分辨率沒有圖4A中好，當需要對堿性Pl值樣品進行重點分析時就會有困難。綜上所述分析，使用本技術(shù)所述的高濃度酸性和堿性擴散調(diào)控墊有很好的調(diào)節(jié)PH梯度線性和范圍的作用。
實施例5如圖5所示，本實施例是非固化pH梯度膠條(non-1PG膠條)的實例，包括:包含能與聚丙烯酰胺凝膠聚合的親水面的凝膠支持膜10、承載蛋白質(zhì)樣品并與支持膜鍵合的抗對流介質(zhì)11、形成PH梯度和親水性的兩性載體電解質(zhì)12和儲存保護膠條的保護膜13。
所述的凝膠支持膜10的其中一面是具有乙烯基團的材質(zhì)，以便與聚丙烯酰胺凝膠牢固鍵合。所述的凝膠支持膜10的寬度為2.5 4.5mm,長度為3.5cm 24cm，其厚度為
0.15mm 0.35mm0所述的抗對流介質(zhì)11的材料由聚丙烯酰胺凝膠,介質(zhì)濃度T為2 10% (質(zhì)量百分百)，交聯(lián)度C為2 6%。所述的抗對流介質(zhì)11的長度為3.5cm 24cm,厚度為0.45mm 0.65mm,寬度為
2.5 4.5mm。凝膠支持膜10長度和寬度可隨需要裁切?？箤α鹘橘|(zhì)11與凝膠支持膜10牢固結(jié)合，在抗對流介質(zhì)11中添加的兩性載體電解質(zhì)12與抗對流介質(zhì)11沒有化學鍵的結(jié)合，在電場作用下，兩性載體電解質(zhì)12沿正極到負極方向形成從低到高的pH梯度。兩性電解質(zhì)質(zhì)量百分濃度優(yōu)選在1.5%至5%，而現(xiàn)有IPG-1EF中所有兩性電解質(zhì)質(zhì)量濃度為0.5%至1%，兩性電解質(zhì)濃度的提聞有助于提聞抗對流介質(zhì)中的水溶性基團，使其更好的穩(wěn)定pH梯度。所述的保護膜13覆蓋于抗對流介質(zhì)11之上，材料為聚乙烯膜或聚酯膜或腈綸膜或尼龍膜；其長度和寬度均與凝膠支持膜10相匹配，寬度為2.5 4.5mm,長度為3.5cm 24cm，厚度為40 μ m 100 μ m?？梢杂行У胤乐鼓z條受到污染，方便non-1PG膠條的長期保存。
實施例6
如圖6所示，本實施例為電泳槽的實例，包括:設(shè)有若干個槽道的聚焦槽框架14、散熱底板16、用于壓制酸性電極液墊或堿性電極液墊的蓋板7和電極部件，其中:聚焦槽框架14和散熱底板16相互契合，電極部件固定于聚焦槽框架14和散熱底板16之間，蓋板7與散熱底板16相互配合。所述的聚焦槽框架14有楔形頭15且與散熱底板16上的楔形孔17相配合。所述的聚焦槽框架14有定位孔22且與蓋板7上的定位片23相配合。所述的電極部件包括:相互接觸的電極絲和電極片20，其中:電極絲的電極絲環(huán)19貼在環(huán)聚焦槽框架14上所開的電極螺絲孔18上，電極固定螺絲21穿過所述電極絲環(huán)19和電極片20固定于所述聚焦槽框架14上的所述電極螺絲孔18。所述的聚焦槽框架14的槽道個數(shù)為6 12個，聚焦槽框架14沿槽道方向的長度為 7cm 24cm。等電聚焦電泳時，蓋板7落于電泳盤內(nèi)，優(yōu)選所述蓋板材料為PMMA，其作用是適當壓緊所述酸性墊或堿性墊，使其與所述等電聚焦電泳盤兩端的電極絲接觸良好。在此描述的電泳槽能很好的與實施例1至6所述的穩(wěn)定pH梯度的控制技術(shù)和調(diào)節(jié)PH梯度線性的技術(shù)相兼容。具體包括:1)電泳槽4是導熱系數(shù)較高的材料制作，如導熱塑料(2 IOW HT1K-1)或?qū)崽沾?5 150W nrt1)或它們的混合材料(2-30W mH，有良好的散熱效果，而現(xiàn)有通用的電泳槽散熱效果較差，導熱系數(shù)一般在3W HT1ITi以下。2)電泳槽槽道寬度與所述non-1PG-1EF膠條的寬度匹配，寬度在2.5mm至4.5mm之間。3)所述的電極使用內(nèi)嵌設(shè)計，與現(xiàn)有等點聚焦設(shè)備完全兼容，且有更方便操作的優(yōu)勢。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)等電聚焦電泳的pH梯度控制方法，其特征在于，首先制備含有電極液的多孔親水材料作為酸性墊和堿性墊，然后將酸性墊置于電泳槽內(nèi)的陽極與經(jīng)過水化上樣的固化或非固化PH梯度膠條的一端之間，將堿性墊置于陰極與膠條的另一端之間，且并輕壓固定以實現(xiàn)電連接，最后滴加硅油覆蓋整個電泳槽內(nèi)并施加直流電壓，通過逐步增加電壓實現(xiàn)等電聚焦電泳測試。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，在基于MRB的穩(wěn)定pH梯度控制時，所述的酸性墊為酸性電極液墊，其中所含的電極液為:H2S04、HCUHBr, HI, HNO3> CH3COOH, H3PO4、或者上述混合溶液的酸性電解質(zhì)，但HF除外，酸性電極液濃度為5mM 200mM ;所述的堿性墊為堿性電極液墊，其中的電極液為:NaOH、NH4OH, H2NCH2CH2NH2、或者上述混合溶液的堿性電解質(zhì),但KOH除外,堿性性電極液濃度為5mM 200mM ； 在基于MRB和擴散技術(shù)設(shè)計非線性pH梯度調(diào)控時，所述的酸性墊為酸性擴散調(diào)控墊，其中所含的電極液為:H2S04、HC1、HBr, H1、HNO3> CH3COOH, H3PO4、或者上述混合溶液的酸性電解質(zhì)，濃度為150mM 2000mM;所述的堿性墊為堿性電極液墊，其中的電極液為:NaOH、NH40H、H2NCH2CH2NH2、或者上述混合溶液的堿性電解質(zhì)，濃度為150mM 2000mM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是，所述的酸性墊和堿性墊以及的基材為:濾紙、脫脂棉、海綿或無紡布，其長度是與所在的電泳槽兩端電極到電泳槽道端部之間的距離相適應(yīng)。
4.一種實現(xiàn)上述任一項權(quán)利要求所述的方法的非固化pH梯度膠條，其特征在于，包括:包含具有親水面的能與聚丙烯酰胺凝膠聚合的凝膠支持膜、具有承載蛋白質(zhì)樣品并與支持膜鍵合的抗對流介質(zhì)、具有形成PH梯度的兩性載體電解質(zhì)和用于儲存保護等膠條的保護膜。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的非固化pH梯度膠條，其特征是，所述的凝膠支持膜的其中一面是具有乙烯基團，以便與聚丙烯酰胺凝膠牢固鍵合。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的非固化pH梯度膠條，其特征是，所述的抗對流介質(zhì)材料由聚丙烯酰胺凝膠，其濃度T為2%至10，交聯(lián)度C為2%至6%。
7.一種實現(xiàn)上述任一項權(quán)利要求所述的電泳槽，其特征在于，包括:設(shè)有若干個槽道的聚焦槽框架、散熱底板、用于壓制酸性墊或堿性墊的蓋板和電極部件，其中:聚焦槽框架和散熱底板相互契合，電極部件固定于聚焦槽框架和散熱底板之間，蓋板與散熱底板相互配合。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的裝置，其特征是，所述的聚焦槽框架有楔形頭且與散熱底板上的楔形孔相配合。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的裝置，其特征是，所述的聚焦槽框架有定位孔且與蓋板上的定位片相配合。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的裝置，其特征是，所述的電極部件包括:相互接觸的電極絲和電極片，其中:電極絲的電極絲環(huán)貼在環(huán)聚焦槽框架上所開的電極螺絲孔上。
全文摘要
一種基于移動反應(yīng)界面和擴散技術(shù)的蛋白質(zhì)等電聚焦電泳方法及其裝置，首先制備含有電極液的多孔親水材料作為酸性墊和堿性墊，然后將酸性墊置于電泳槽內(nèi)的陽極與經(jīng)過水化上樣的固化或非固化pH梯度膠條的一端之間，將堿性墊置于陰極與膠條的另一端之間且并輕壓固定以實現(xiàn)電連接，最后滴加硅油覆蓋整個電泳槽內(nèi)并施加直流電壓，通過逐步增加電壓實現(xiàn)等電聚焦電泳測試。本發(fā)明的目的在于提高pH梯度可調(diào)控性和分辨率。
文檔編號G01N27/447GK103235026SQ20131011385
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月2日
發(fā)明者曹成喜, 郭陳剛, 劉小平, 李思, 王后禹 申請人:上海交通大學