專(zhuān)利名稱：一種適用于雙向電泳的淋巴細(xì)胞蛋白樣品制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬疾病發(fā)病機(jī)制研究技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于雙向電泳的淋巴細(xì)胞蛋白樣品制備方法。
背景技術(shù)：
淋巴細(xì)胞是人體的免疫細(xì)胞之一，機(jī)體免疫應(yīng)答功能的重要細(xì)胞成分。在人體約占白細(xì)胞的20% -30%。根據(jù)淋巴細(xì)胞的發(fā)育部位、表面抗原、受體及功能等不同，可將淋巴細(xì)胞分為T(mén)淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞等多種。成熟淋巴細(xì)胞在人體中發(fā)揮重要的免疫功能，很多疾病都與淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能異常有關(guān)。像感染、血液病、腫瘤、過(guò)敏性疾病、自身免疫性疾病、免疫缺陷等疾病都與淋巴細(xì)胞密切相關(guān)。隨著科學(xué)進(jìn)步，淋巴細(xì)胞與越來(lái)越的疾病的發(fā)病過(guò)程相聯(lián)系。人類(lèi)基因組計(jì)劃的實(shí)施和推進(jìn)，已使生命科學(xué)研究進(jìn)入 了后基因組時(shí)代，這一轉(zhuǎn)變的標(biāo)志之一就是蛋白質(zhì)組學(xué)的興起。蛋白質(zhì)雙向電泳(2-DE)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)之一，盡管蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)進(jìn)展飛速，2-DE仍然是進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品分離的方法之一。蛋白樣品的制備是2-DE的關(guān)鍵，也是進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析的前提。由于淋巴細(xì)胞的分離和培養(yǎng)中含有鹽分及其它雜質(zhì)，使得雙向電泳結(jié)果的分辨率低，重復(fù)性差，難以獲得令人滿意的2-DE圖譜。淋巴細(xì)胞蛋白制備已有商品化的試劑盒，但由于價(jià)格昂貴，不適用于大批量樣本研究。給淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì)的進(jìn)一步分析帶來(lái)了困難。因此建立適用于電泳分析的淋巴細(xì)胞蛋白提取方法是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目是提供一種具有較高質(zhì)量并適用于雙向電泳的淋巴細(xì)胞蛋白樣品制備方法。本發(fā)明包括下列步驟I)處死大鼠，分離脾臟，取新鮮脾臟一個(gè)，研磨后用200目濾網(wǎng)過(guò)濾，4°C 9%氯化鈉(生理鹽水)2ml稀釋?zhuān)玫搅馨图?xì)胞混懸液，并移入試管，將試管傾斜45°，在淋巴細(xì)胞混懸液液面上Icm處,沿試管管壁緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液2ml,要求淋巴細(xì)胞分離液與淋巴細(xì)胞混懸液不混合，2000rpm/min梯度離心20分鐘，吸取淋巴細(xì)胞層，再2000rpm/min離心10分鐘，得到沉淀的大鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞；2)將雙蒸水2ml加入沉淀的大鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞中，輕搖50秒，待RBC裂解后，立即加入I. 8%的氯化鈉2ml (恢復(fù)等滲狀態(tài)),2000rpm/min離心10分鐘；3)將步驟2)重復(fù)1-2次后，生理鹽水洗2-3次，移去上清液，得到淋巴細(xì)胞占97%、中性粒細(xì)胞占3%的細(xì)胞團(tuán)；4)在細(xì)胞團(tuán)中加入4°C 5%的蔗糖2ml，混勻，2000rpm/min水平離心10分鐘，移去
上清液；5)將步驟4)重復(fù)2-3次(以除去水相中的氯化鈉等鹽分)，顯微鏡下計(jì)數(shù)，將5 X IO7個(gè)淋巴細(xì)胞作為一次電泳量；6)將步驟5) —次電泳量的淋巴細(xì)胞移到研缽中，室溫干燥20分鐘，加入水化/裂解緩沖液100 μ I (以促進(jìn)蛋白的溶解)，超聲儀破碎淋巴細(xì)胞，超聲的時(shí)間I秒，間隔I秒，功率8-9W至溶液清亮，4° C 15000r/min離心30分鐘，留取上清液，即得到適用于雙向電泳的淋巴細(xì)胞蛋白樣品。步驟6)所述的水化/裂解緩沖液為含有Tris飽和酚40mM、尿素7M、硫脲2M、CHAPS2%、DTT40mM、PMSF儲(chǔ)存液100 μ M、溴酚藍(lán)O. 002%和IPG2%緩沖液的溶液。本發(fā)明采用蔗糖法洗滌淋巴細(xì)胞，以除去水相中氯化鈉等鹽分，可避免鹽類(lèi)物質(zhì)對(duì)雙向電泳的影響。本發(fā)明的水化/裂解緩沖液中尿素可使蛋白質(zhì)去折疊暴露疏水核心， 而配合使用硫脲會(huì)增加蛋白質(zhì)的溶解性；二硫蘇糖醇DTT還原二硫鍵，從而使蛋白質(zhì)達(dá)到完全溶解的狀態(tài)；IPG緩沖液能清除氰酸鹽離子、離心時(shí)加速核酸沉淀；PMSF可防止蛋白被降解。采用本發(fā)明制備淋巴細(xì)胞蛋白樣品快速、簡(jiǎn)單易行，成本低，可獲得高質(zhì)量、重復(fù)性好的雙向電泳圖譜，便于后續(xù)進(jìn)行生物質(zhì)譜分析鑒定蛋白的研究，本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究，具有較高的實(shí)用價(jià)值。


圖I為大鼠脾臟淋巴細(xì)胞蛋白樣品雙向電泳圖譜圖2為人血淋巴細(xì)胞蛋白樣品雙向電泳圖譜其中麗為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，單位是kDa。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的濃度，如無(wú)特別說(shuō)明，均為體積百分比(V/V)。實(shí)施例I、制備大鼠脾臟淋巴細(xì)胞蛋白雙向電泳樣品并進(jìn)行雙向電泳分析I)收集哮喘大鼠脾臟淋巴細(xì)胞。處死大鼠后取脾一個(gè)，新鮮脾研磨后，用200目濾網(wǎng)過(guò)濾，用2ml 4°C生理鹽水稀釋?zhuān)玫搅馨图?xì)胞混懸液，并移入試管，將試管傾斜45°，在淋巴細(xì)胞混懸液液面上Icm處，沿試管管壁緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液(相對(duì)密度
I.080) 2ml (要求淋巴細(xì)胞分離液與淋巴細(xì)胞混懸液不混合)，2000rpm/min梯度離心20分鐘，吸取淋巴細(xì)胞層；再2000rpm/min離心10分鐘,得到沉淀的大鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞；2)將雙蒸水2ml加入沉淀的大鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞中，輕搖50秒，待RBC裂解后，立即加入I. 8%的氯化鈉2ml, 2000rpm/min離心10分鐘；3)將步驟2)重復(fù)1-2次后，生理鹽水洗2-3次，移去上清液，得到淋巴細(xì)胞占97%、中性粒細(xì)胞占3%的細(xì)胞團(tuán)；4)在細(xì)胞團(tuán)中加入4°C 5%的蔗糖2ml，混勻，2000rpm/min水平離心10分鐘，移去
上清液；5)將步驟4)重復(fù)2-3次，顯微鏡下計(jì)數(shù)，將5X107個(gè)淋巴細(xì)胞作為一次電泳量；6)將步驟5) —次電泳量的淋巴細(xì)胞移到研缽中，室溫干燥20分鐘，加入水化/裂解緩沖液100μ 1，促進(jìn)蛋白的溶解，超聲儀破碎淋巴細(xì)胞，超聲的時(shí)間I秒，間隔I秒，功率8-9W至溶液清亮，4° C15000r/min離心30分鐘，留取上清液，即得到適用于雙向電泳的淋巴細(xì)胞蛋白樣品；7)將步驟6)得到的大鼠脾臟淋巴細(xì)胞蛋白溶解于水化/裂解緩沖液后，離心留取上清液，得到大鼠脾臟淋巴細(xì)胞蛋白雙向電泳樣品液；所述的水化/裂解緩沖液水化/裂解緩沖液為含有Tris飽和酚40mM、尿素7M、硫脲2M、CHAPS 2%, DTT40mM、PMSF儲(chǔ)存液100 μ M、溴酚藍(lán)O. 002%和IPG2%緩沖液的溶液；8)通過(guò)上述過(guò)程提取的蛋白，用Bradford法紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度,結(jié)果表明上述得到的用于雙向電泳的淋巴細(xì)胞蛋白樣品中，蛋白濃度為3-4ug/uL ；9)按照如下方法進(jìn)行雙向電泳利用Ettan IPGphor I I Isoelectric FocusingSyStem(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)，USA)在20°C進(jìn)行第一向等電聚焦電泳(IEF)。電泳條件為在20°C以設(shè)定程序進(jìn)行等電聚焦電泳，設(shè)定最大電壓8000伏，電流50 μ A/gel，時(shí)間10. 5h。實(shí)際總電壓時(shí)間積為42，000Vh。然后將聚焦后的固定pH梯度膠條(IPG膠條)，在IOmL 平衡緩沖液 I (50mmol/L Tris-Cl 緩沖液，pH8. 8 ；6mol/L urea ;30%甘油，O. 02g/mL SDS,O. 01g/mL 二硫蘇糖醇)中平衡15min，然后在IOml平衡緩沖液2 (50mmol/L Tris-Cl緩沖液，pH8. 8 ；6mol/Lurea ;30%甘油，O. 02g/mL SDS,O. 25g/mL碘乙酰胺)中平衡 15min。將平衡后的膠條轉(zhuǎn)移到第二向凝膠上，第二向電泳利用Ettan DALTsix system(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)，USA)在12. 5% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行，恒流進(jìn)行電泳，電流IOmA/膠，電壓300伏，時(shí)間O. 5h，電流20mA/膠，電壓300伏，時(shí)間12h，待溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠前沿到約O. 5cm時(shí)，終止電泳。凝膠采用硝酸銀染色法，結(jié)果如圖I所示，結(jié)果表明淋巴細(xì)胞蛋白樣品分離效果良好，沒(méi)有發(fā)生明顯的蛋白降解。實(shí)施例2、制備人血淋巴細(xì)胞蛋白樣品并進(jìn)行雙向電泳分析
I)采取人血2ml，EDTA抗凝；2)用2ml生理鹽水稀釋?zhuān)?jīng)4ml淋巴細(xì)胞分離液(相對(duì)密度I. 077)梯度離心，分離人血淋巴細(xì)胞；3)經(jīng)低滲裂解紅細(xì)胞，反復(fù)洗滌去除血小板，吸取單個(gè)核細(xì)胞層，4°C，2000rpm/min，離心5分鐘，用4°C生理鹽水洗3遍后，移去上清液；4)加入4°C 5%的蔗糖2ml，混勻震蕩30秒，2000rpm/min水平離心10分鐘，移去上清液，反復(fù)2-3次；顯微鏡下計(jì)數(shù)，5 X IO7個(gè)淋巴細(xì)胞為一次電泳量進(jìn)行分裝；5)細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到研缽中室溫干燥20分鐘,加入水化/裂解液100 μ I促進(jìn)蛋白的溶解；6)超聲儀破碎細(xì)胞。超聲時(shí)間I秒間隔I秒，功率8 9W至溶液清亮，4° C離心(15000r/min,30分)，留取上清液，即得到適用于雙向電泳的淋巴細(xì)胞蛋白樣品；7)將步驟6)得到的人血淋巴細(xì)胞蛋白溶解于水化/裂解緩沖液后，離心，留取上清液，得到人血淋巴細(xì)胞蛋白雙向電泳樣品液；所述裂解緩沖液為含有Tris飽和酚40mM，Urea 7M, Thiourea 2M, CHAPS 2%, DTT 40mM, PMSF 儲(chǔ)存液 100 μ M，0· 002%溴酚藍(lán)和 2%IPG緩沖液的溶液；8)通過(guò)上述過(guò)程提取的蛋白，用Bradford法紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度,結(jié)果表明上述得到的用于雙向電泳的淋巴細(xì)胞蛋白樣品中，蛋白濃度為3-4ug/uL ；9)按照如下方法進(jìn)行雙向電泳利用Ettan IPGphor I I Isoelectric FocusingSystem(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)，USA)在20°C進(jìn)行第一向等電聚焦電泳(IEF)。電泳條件為在200C以設(shè)定程序進(jìn)行等電聚焦電泳，設(shè)定最大電壓5000伏，電流50 μ A/gel，時(shí)間10. 5h。實(shí)際總電壓時(shí)間積為42，OOOVh0然后將聚焦后的固定pH梯度膠條(IPG膠條)在IOmL平衡緩沖液 l(50mmol/L Tris-Cl 緩沖液，ρΗ8· 8 ;6mol/L urea ;30% 甘油，O. 02g/mL SDS,0. 01g/mL二硫蘇糖醇)中平衡15min，然后在IOml平衡緩沖液2 (50mmol/L Tris-Cl緩沖液，pH8. 8 ；6mol/Lurea ;30%甘油，0. 02g/mL SDS,O. 25g/mL碘乙酰胺)中平衡15min。將平衡后的膠條轉(zhuǎn)移到第二向凝膠上，第二向電泳利用Ettan DALTsix system(通用電氣醫(yī)療集團(tuán),USA)在 12. 5% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行，恒流進(jìn)行電泳，電流IOmA/膠，電壓300伏，時(shí)間O. 5h，電流20mA/膠，電壓300伏，時(shí)間12h，待溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠前沿到約O. 5cm時(shí)，終止電泳。凝膠采用硝酸銀染色法，結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明淋巴細(xì)胞蛋白樣品分離效果良好，沒(méi)有發(fā)生明顯的蛋白降解。
權(quán)利要求
1.一種適用于雙向電泳的淋巴細(xì)胞蛋白樣品制備方法，其特征在于包括下列步驟 1)處死大鼠，分離脾臟，取新鮮脾臟一個(gè)，研磨后用200目濾網(wǎng)過(guò)濾，4°C9%氯化鈉2ml稀釋?zhuān)玫搅馨图?xì)胞混懸液，并移入試管，將試管傾斜45°，在淋巴細(xì)胞混懸液液面上Icm處，沿試管管壁緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液2ml，要求淋巴細(xì)胞分離液與淋巴細(xì)胞混懸液不混合,2000rpm/min梯度離心20分鐘，吸取淋巴細(xì)胞層，再2000rpm/min離心10分鐘,得到沉淀的大鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞； 2)將雙蒸水2ml加入沉淀的大鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞中，輕搖50秒，待RBC裂解后，立即加A I. 8%的氯化鈉2ml, 2000rpm/min離心10分鐘； 3)將步驟2)重復(fù)1-2次后，生理鹽水洗2-3次，移去上清液，得到淋巴細(xì)胞占97%、中性粒細(xì)胞占3%的細(xì)胞團(tuán)； 4)在細(xì)胞團(tuán)中加入4°C5 %的蔗糖2ml，混勻，2000rpm/min水平離心10分鐘，移去上 清液； 5)將步驟4)重復(fù)2-3次，顯微鏡下計(jì)數(shù)，將5X107個(gè)淋巴細(xì)胞作為一次電泳量； 6)將步驟5)—次電泳量的淋巴細(xì)胞移到研缽中，室溫干燥20分鐘，加入水化/裂解緩沖液100 u 1，超聲儀破碎淋巴細(xì)胞，超聲的時(shí)間I秒，間隔I秒，功率8-9W至溶液清亮，4° C 15000r/min離心30分鐘，留取上清液，即得到適用于雙向電泳的淋巴細(xì)胞蛋白樣品。
2.按權(quán)利要求I所述的適用于雙向電泳的淋巴細(xì)胞蛋白樣品制備方法，其特征在于步驟6)所述的水化/裂解緩沖液為含有Tris飽和酚40mM、尿素7M、硫脲2M、CHAPS 2%,DTMOmM、PMSF儲(chǔ)存液lOOyM、溴酚藍(lán)0. 002%和IPG 2%緩沖液的溶液。
全文摘要
一種適用于雙向電泳的淋巴細(xì)胞蛋白樣品制備方法屬疾病發(fā)病機(jī)制研究技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明包括下列步驟取新鮮大鼠脾臟研磨，200目過(guò)濾，加4℃氯化鈉2ml，入試管，再加淋巴細(xì)胞分離液2ml，離心，得單個(gè)核細(xì)胞；加雙蒸水2ml，使RBC快速裂解，再加1.8％氯化鈉2ml，恢復(fù)等滲狀態(tài)，4℃生理鹽水洗滌細(xì)胞后，去上清；加4℃5％的蔗糖2ml混勻，離心、去上清；細(xì)胞團(tuán)室溫干燥，加水化/裂解緩沖液，促進(jìn)蛋白的溶解，超聲破碎細(xì)胞，取上清，即得適用于雙向電泳的淋巴細(xì)胞蛋白樣品。采用本發(fā)明制備淋巴細(xì)胞蛋白樣品快速、簡(jiǎn)單，成本低，可獲得高質(zhì)量、重復(fù)性好的雙向電泳圖譜，且便于后續(xù)進(jìn)行生物質(zhì)譜分析鑒定蛋白研究，可廣泛應(yīng)用于淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究。
文檔編號(hào)G01N1/28GK102967496SQ20121049606
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月28日
發(fā)明者李善玉, 錢(qián)東華, 張海玉, 張影, 金美玉, 曹肖琲, 張文娟 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)