專利名稱：用于提高檢測(cè)b細(xì)胞免疫球蛋白基因重組的方法
用于提高檢測(cè)B細(xì)胞免疫球蛋白基因重組的方法本申請(qǐng)要求2010年3月29日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/318，417的優(yōu)先權(quán)。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于識(shí)別和量化B細(xì)胞免疫球蛋白基因重組的方法。更具體地，本發(fā)明涉及設(shè)計(jì)用于增加來(lái)自免疫球蛋白cDNA和/或RNA的PCR-擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量的引物的方法。
背景技術(shù)：
當(dāng)考慮科學(xué)研究的“停滯地帶”時(shí)，免疫學(xué)已經(jīng)成為了身體及其在健康和疾病時(shí)的狀態(tài)的研究的主要部分?？茖W(xué)家不斷地發(fā)現(xiàn)身體的天然防御系統(tǒng)和疾病之間的聯(lián)系，這曾經(jīng)被認(rèn)為與免疫學(xué)無(wú)關(guān)。免疫系統(tǒng)的細(xì)胞提供炎性應(yīng)答的最顯著部分，且炎癥可以與不同疾病，如心血管病、腎病、糖尿病、關(guān)節(jié)炎、和癌癥有關(guān)。炎性應(yīng)答必須小心地平衡,并且當(dāng)該平衡得不到維持時(shí)，可以導(dǎo)致由免疫缺陷引起的疾病，或者在型譜另一端導(dǎo)致“自身免疫疾病”諸如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和結(jié)節(jié)病。Anthony Fauci博士，Μ.D.,美國(guó)國(guó)家變態(tài)反應(yīng)和傳染病學(xué)院(UnitedStatesNational Institute of Allergy and Infectious Disease, NIAID)院長(zhǎng)，由于提出“定義處于健康和疾病的人免疫系統(tǒng)狀態(tài)是人免疫學(xué)研究的主要目標(biāo)”(NIH新聞(NIH News),2010年 3 月 8 日,http: / / www.nih.gov, news/heal th/mar2010/niaid-Q8a.htm)而被弓 I 證。NIAID的的科學(xué)家認(rèn)識(shí)到“目前用于檢查處于血液中的免疫細(xì)胞混合物中基因表達(dá)差異的方法沒(méi)有考慮即使在健康個(gè)體中存在廣泛范圍的各自細(xì)胞類型比例的變化”(Mark Davis博士，NIH新聞(NIH NewS)，2010年3月8日)。他們團(tuán)隊(duì)關(guān)于該問(wèn)題的方法是一種分析通過(guò)使用微陣列技術(shù)獲得的分子數(shù)據(jù)的新型數(shù)學(xué)方法——微陣列細(xì)胞特異的顯著性分析(csSAM)由B細(xì)胞提供的抗體應(yīng)答在免疫系統(tǒng)針對(duì)攻擊的應(yīng)答中產(chǎn)生顯著程度的多樣性。通過(guò)抗原的攻擊，B細(xì)胞轉(zhuǎn)移至B細(xì)胞濾`泡并構(gòu)建生發(fā)中心(GCs)。重排的免疫球蛋白基因，本身作為顯著的多樣性來(lái)源，進(jìn)一步通過(guò)恒定區(qū)的類型-轉(zhuǎn)換重組和高變區(qū)的體細(xì)胞高突變來(lái)修飾。這些區(qū)域中的突變率已經(jīng)估計(jì)比自發(fā)遺傳突變的高約IO6倍。需要更靈敏的檢測(cè)B細(xì)胞多樣性的方法，以提供對(duì)處于健康和疾病的免疫系統(tǒng)狀態(tài)的更好的理解。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于提高免疫球蛋白重組區(qū)PCR擴(kuò)增和增加可檢測(cè)重組分子數(shù)量的方法，所述方法包括將約3至約5個(gè)隨機(jī)產(chǎn)生的核苷酸添加至用于PCR擴(kuò)增一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白可變區(qū)的至少一個(gè)引物的3’末端，5’末端，或3’和5’末端二者。附圖簡(jiǎn)述

圖1圖示來(lái)自人患者的B細(xì)胞群的免疫球蛋白可變區(qū)的PCR擴(kuò)增結(jié)果。泳道1-3圖示使用對(duì)照引物(在3’末端無(wú)隨機(jī)產(chǎn)生的核苷酸序列)的PCR產(chǎn)物的相對(duì)產(chǎn)量，且4-6圖示使用實(shí)驗(yàn)引物(在3’末端具有隨機(jī)產(chǎn)生的核苷酸序列)的擴(kuò)增序列的相對(duì)數(shù)量。泳道I表示來(lái)自正常個(gè)體RNA的擴(kuò)增產(chǎn)物。泳道2來(lái)自CLL患者，且泳道3是空白，作為陰性對(duì)照。泳道4表示來(lái)自由正常個(gè)體分離的RNA的擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道5來(lái)自CLL患者，且泳道6是陰性對(duì)照。擴(kuò)增條件相同。向引物添加3’隨機(jī)產(chǎn)生的核苷酸，如通過(guò)泳道1、2、4和5中條帶之間的強(qiáng)度差別所示，產(chǎn)生顯著更多的擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2圖示多個(gè)靶標(biāo)的測(cè)序結(jié)果，所述靶標(biāo)用于檢測(cè)來(lái)自不同個(gè)體的重排。檢測(cè)這些重排及其相對(duì)頻率、缺乏某些序列等可以提供關(guān)于免疫系統(tǒng)狀態(tài)及其在健康和疾病中作用的有價(jià)值信息。詳述本發(fā)明人已經(jīng)開(kāi)發(fā)了用于提高免疫球蛋白重組區(qū)PCR擴(kuò)增和增加來(lái)自人和/或動(dòng)物的B細(xì)胞群樣品的可檢測(cè)重組分子數(shù)量的新方法。本發(fā)明包括將約3至約5個(gè)隨機(jī)產(chǎn)生的核苷酸添加至用于PCR擴(kuò)增一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白可變區(qū)的至少一個(gè)引物的3’末端，5’末端，或3’和5’末端二者。所述方法與利用在一個(gè)末端或兩個(gè)末端無(wú)隨機(jī)產(chǎn)生的核苷酸的引物的擴(kuò)增反應(yīng)相比，提供增多數(shù)量的擴(kuò)增產(chǎn)物。在生發(fā)中心中，B細(xì)胞通過(guò)體細(xì)胞高突變來(lái)修飾重排的免疫球蛋白基因。該高突變提供另外的多樣性和抗原結(jié)合特異性。它還在免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因的V區(qū)中和附近引入突變。近期改善了引物設(shè)計(jì)，因?yàn)殚_(kāi)發(fā)了計(jì)算機(jī)程序來(lái)協(xié)助設(shè)計(jì)更容易與這些序列結(jié)合的簡(jiǎn)并引物。然而，為了檢測(cè)表示抗體分子重組的真實(shí)群的重組，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可檢測(cè)的分子數(shù)量可以通過(guò)使用下述引物而增加，所述引物在高變區(qū)接合處結(jié)合并考慮該區(qū)中序列的高變性質(zhì)。本發(fā)明提供用于擴(kuò)增來(lái)自人或動(dòng)物血液樣品的RNA和/或cDNA的方法。然而，樣品還可以獲自人或動(dòng)物體的骨髓或其他B細(xì)胞源?！爸亟M免疫球蛋白序列”表示體內(nèi)已經(jīng)發(fā)生的不同遺傳重排，其導(dǎo)致不同的多樣性抗體。擴(kuò)增可以通過(guò)本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的多種方法進(jìn)行，并且其可以通過(guò)使用商購(gòu)試劑盒而簡(jiǎn)化。用于擴(kuò)增來(lái)自單個(gè)樣品的多個(gè)靶標(biāo)的方法已經(jīng)記述在，例如，美國(guó)專利申請(qǐng)
發(fā)明者韓建 申請(qǐng)人:韓建