亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

用于產(chǎn)生作為與惰性免疫球蛋白Fc區(qū)Fc融合的可溶FcR的方法及其用途

文檔序號:467605閱讀:2566來源:國知局
用于產(chǎn)生作為與惰性免疫球蛋白Fc區(qū)Fc融合的可溶FcR的方法及其用途
【專利摘要】本文是具有式R1-FC-R2的融合多肽及其用途,其中R1表示第一Fc受體,R2表示第二Fc受體,并且FC表示重鏈Fc區(qū)多肽,其中R1或R2或二者均存在,其中FC基本上不結(jié)合R1和/或R2。
【專利說明】用于產(chǎn)生作為與惰性免疫球蛋白Fc區(qū)Fc融合的可溶FcR 的方法及其用途
[0001] 本文報道用于產(chǎn)生作為與防止自我聚集的惰性免疫球蛋白Fc區(qū)的融合多肽的可 溶Fc受體的方法及其用途,例如FcR層析柱,測定低親和力抗體的FcR相互作用。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 免疫球蛋白一般包含兩條輕多肽鏈和兩條重多肽鏈。每條重多肽鏈和輕多肽鏈包 含含有能夠與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可變區(qū)(通常是多肽鏈的氨基端部分)。每條 重多肽鏈和輕多肽鏈還包含恒定區(qū)(通常是羧基端部分)。重鏈的恒定區(qū)介導(dǎo)免疫球蛋白 與例如具有FcY受體(FcyR)的細(xì)胞(如吞噬細(xì)胞)或與具有新生Fc受體(FcRn)(也稱 為Brambell受體)的細(xì)胞的結(jié)合,還介導(dǎo)與一些因子(包括經(jīng)典補體系統(tǒng)的因子,如(Clq) 成分)的結(jié)合。
[0004]Hulett和Hogarth(Hulett,M.D?和Hogarth,P.M.,Adv.Immunol. 57 (1994) 1-127) 報道,G類免疫球蛋白的Fc部分的胞外受體是跨膜糖蛋白家族,該家族包含具有不同結(jié)合 特異性的三種不同受體類型:FcyRI、FcyRII和FcyRIII。I型受體與未復(fù)合的IgG相互 作用,而II型和III型受體優(yōu)選與復(fù)合的IgG相互作用。
[0005] 人FcyRIII(⑶16)以兩種同種型和兩種多態(tài)形式存在。第一同種型FcyRIIIa 是由與第二同種型FcyRlllb不同的基因編碼的跨膜分子,所述第二同種型FcyRlllb是 GPI錨定的膜蛋白。多態(tài)形式V159在氨基酸序列的159位具有纈氨酸殘基而多態(tài)形式F159 在159位具有苯丙氨酸殘基。
[0006] 對于IgG類免疫球蛋白,ADCC和ADCP由Fc區(qū)與稱為Fc-gamma(FcY)受體 (FcyR)的受體的家族的參與管控。在人中,此蛋白家族包含F(xiàn)cyRI(⑶64)、包括同種型 FcyRIIA、FcyRIIB,和FcyRIIC的FcyRII(CD32),和包括同種型FcyRIIIA和FcyRIIIB 的FcyRIII(CD16)(Raghavan和Bjorkman,Annu.Rev.CellDev.Biol.12 (1996) 181 - 220 ; Abes,等人,ExpertReviews(2009)735_747)。FcyR在多種免疫細(xì)胞上表達(dá),并且Fc/ FcYR復(fù)合體的形成將這些細(xì)胞招募至結(jié)合的抗原的位點,通常導(dǎo)致發(fā)信號和隨后的免疫 應(yīng)答諸如炎癥介質(zhì)的釋放、B細(xì)胞激活、內(nèi)吞作用、吞噬作用,和細(xì)胞毒性攻擊。此外,盡管 FcyRI、FCYRIIA/C,和FcyRIIIA是由基于胞內(nèi)免疫受體酪氨酸的激活基序(ITAM)表征 的激活受體,F(xiàn)cyRIIB具有抑制性基序(ITM)并因此是抑制性的。盡管FcyRI以高親和 力結(jié)合單體IgG,F(xiàn)cyRIII和FcyRII是低親和力受體,與復(fù)合的或聚集的IgG相互作用。
[0007]IgG與激活和抑制性Fey受體或補體的第一組分(Clq)的結(jié)合取決于位于鉸鏈 區(qū)和CH2結(jié)構(gòu)域中的殘基。CH2結(jié)構(gòu)域的2個區(qū)域?qū)τ贔cYR和補體Clq結(jié)合是至關(guān)重要 的,并且具有獨特的序列。替換人IgGl和IgG2第233-236位殘基和IgG4第327、330和 331 位殘基大大降低了ADCC和CDC(Armour,等人,Eur.J.Immunol. 29(1999)2613-2624 ; Shields,等人,J.Biol.Chem. 276 (2001) 6591-6604)。Idusogie,等人(J.Immunol 166(2000)2571-2575)對治療性抗體Rituxan?的Clq結(jié)合位點繪圖并顯示Pro329Ala 替換降低了利妥昔單抗(Rituximab)結(jié)合Clq和激活補體的能力。已經(jīng)報道用Ala替換 Pro329 導(dǎo)致降低的與FcyRI,F(xiàn)cyRIIandFcyRIIIA受體的結(jié)合(Shields,等人,J. Biol.Chem. 276 (2001) 6591-6604)但是也已經(jīng)將此突變描述為表現(xiàn)出與FcyRI和FcyRII的野生型樣結(jié)合并且與FcyRIIIA受體的結(jié)合僅有非常小的降低(EP1068241,Genentech 中的表1和表2)。
[0008]在W0 2010/048313中報道了用于純化含有Fc的融合蛋白的重組FcRn及其變 體。Fc-X融合蛋白在哺乳動物細(xì)胞中的高水平表達(dá)和分泌由Lo等人報道(Lo,K-M.,等 人,Prot.Eng. 11(1998)495-500)。Dumont,F.A.,等人(Biodrugs20(2006) 151-160)報道 了單體Fc融合物。受體Fc融合治療劑,traps,和MMETIB0DYTM技術(shù)由Huang,C. (Curr. Opin.Biotechnol.20(2009)592-599)報道。在TO01/03737 中報道了免疫球蛋白融合蛋 白。W0 00/40615中報道了作為Fc融合蛋白表達(dá)和輸出抗肥胖蛋白。
[0009]發(fā)明概述
[0010] 已發(fā)現(xiàn),可以通過將Fc受體表達(dá)為具有基本上不結(jié)合融合的Fc受體的Fc區(qū)的融 合多肽生產(chǎn)可溶Fc受體。使用融合多肽來表達(dá)Fc受體增加融合多肽形式或作為分離的受 體的Fc受體的可獲得的產(chǎn)量。此外,本文報道的融合多肽提供用于組合單個分子中的多于 一個拷貝的Fc受體,例如用于增加的親和力,或用于組合單個分子中的不同F(xiàn)c受體(不同 來源或不同類型或上述二者)的增加的靈活性。
[0011] 本文報道的一個方面是根據(jù)式I的融合多肽:
[0012] R1-FC-R2 (式I)
[0013] 其中
[0014]R1表不第一Fc受:體,
[0015]R2表示第二Fc受體,和
[0016]FC表不重鏈Fc區(qū)多肽,
[0017] 其中R1或R2或二者均存在,
[0018]其中FC基本上不結(jié)合R1和/或R2。
[0019] 在一個實施方案中融合多肽具有式II
[0020] R1-CS1-L1-CS2-FC-CS3-L2-CS4-R2 (式II)
[0021] 其中
[0022] R1表示第一Fc受體,
[0023]R2表示第二Fc受體,
[0024]FC表示重鏈Fc區(qū)多肽,
[0025]CS1表不第一切割位點,
[0026]CS2表示第二切割位點,
[0027]CS3表示第三切割位點,
[0028]CS4表示第四切割位點,
[0029]L1表示第一間插氨基酸序列,和
[0030]L2表示第二間插氨基酸序列,
[0031] 其中R1或R2或二者均存在,
[0032] 其中CS1、CS2、CS3、CS4中的任一者可以彼此獨立地存在或不存在,
[0033] 其中L1和L2可以彼此獨立地存在或不存在,
[0034] 其中FC基本上不結(jié)合R1和/或R2。
[0035] 在一個實施方案中R1和R2彼此獨立地選自人Fcy受體、人新生Fc受體、鼠Fc 受體,和兔新生Fc受體的組。
[0036] 在一個實施方案中人Fcy受體選自人FcyRI(CD64)、人FcyRII(CD32)、人 FcyRIIA、人FcyRIIB、人FcyRIIC、人FcyRIII(CD16)、人FcyRIIIA,和人FcyRIIIB。
[0037] 在一個實施方案中人新生Fc受體是人FcRn。
[0038]在一個實施方案中鼠Fc受體選自鼠FcyRI(CD64)、鼠FcyRII(CD32)、鼠 FcyRIIB、鼠FcyRIII(CD16)、鼠FcyRIII-2 (CD16-2),和鼠FcyRIV。
[0039] 在一個實施方案中Fc是選自人IgG重鏈多肽、鼠IgG重鏈多肽、兔IgG重鏈多肽 的組的重鏈多肽的變體。
[0040] 在一個實施方案中,F(xiàn)C是選自人IgGl重鏈多肽、人IgG2重鏈多肽、人IgG3重鏈多 肽、人IgG4重鏈多肽、鼠IgGl重鏈多肽、鼠IgG2重鏈多肽、鼠IgG2a重鏈多肽、鼠IgG3重 鏈多肽、兔IgG重鏈多肽的組的重鏈多肽的變體。
[0041] 在一個實施方案中,重鏈Fc區(qū)多肽在位置234、235、236、237、238、239、253、254、 265、266、267、268、269、270、288、297、298、299、307、311、327、328、329、330、331、332、434和 435中的一個或多個處具有氨基酸突變。
[0042] 在一個實施方案中,F(xiàn)c受體中的一個或多個是Fcy受體。
[0043] 在一個實施方案中,人IgGl重鏈多肽在氨基酸位置233、234、235、236、265、297、 329和331中的一個或多個處具有突變。
[0044] 在一個實施方案中,人IgGl重鏈多肽具有氨基酸突變E233P、L234A、L235A、 L235E、AG236、D265A、N297A、N297D、P329A、P329G和P331S中的一個或多個。
[0045] 在一個實施方案中,人IgGl重鏈多肽具有氨基酸突變L234A和L235A及E233P、 L235E、AG236、D265A、N297A、N297D、P329A、P329G和P331S中的一個或多個。
[0046] 在一個實施方案中,人IgGl重鏈多肽具有氨基酸突變L234A和L235A及P329A或 P329G。
[0047] 在一個實施方案中,人IgG2重鏈多肽在氨基酸位置233、234、235、236、265和329 中的一個或多個處具有突變。
[0048] 在一個實施方案中,人IgG4重鏈多肽在氨基酸位置228、235、265和329中的一個 或多個處具有突變。
[0049] 在一個實施方案中,人IgG4重鏈多肽具有突變S228P、L235E、P329A和P329G中的 一個或多個。
[0050] 在一個實施方案中,人IgG4重鏈多肽具有突變S228P和L235E及P329A或P329G。
[0051] 在一個實施方案中,重鏈Fc區(qū)多肽在位置248、250、251、252、253、254、255、256、 257、272、285、288、290、291、308、309、310、311、314、385、386、387、428、433、434、435 和 436 中的一個或多個處具有氨基酸突變。
[0052] 在一個實施方案中,F(xiàn)c受體中的一個或多個是FcRn。
[0053] 在一個實施方案中,人IgG重鏈多肽在氨基酸位置238、252、253、254、255、256、 265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、 386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439和/或447中的一個或多個處具有突變。
[0054]在一個實施方案中,具有減少的與FcRn的結(jié)合的人IgG重鏈多肽在氨基酸位置 252、253、254、255、288、309、386、388、400、415、433、435、436、439 和 / 或 447 處具有一個或 多個氨基酸改變。
[0055] 在一個實施方案中,具有減少的與FcRn的結(jié)合的人IgG重鏈多肽具有氨基酸突變 I253A、H310A 和 H435A。
[0056] 在一個實施方案中,間插氨基酸序列選自包含(G3S)3、(G3S)4、(G3S)5、(G3S)6、 (G4S)3、(G4S)4、(G4S)5、(G5S)2、(G5S)3、和(G5S)4 的第一組,或選自包含 Arg 標(biāo)記、Avi 標(biāo)記、His-Avi標(biāo)記、His標(biāo)記、Flag標(biāo)記、3xFlag標(biāo)記、Strep標(biāo)記、Nano標(biāo)記、SBP標(biāo)記、 c-myc標(biāo)記、S標(biāo)記、鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽、纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域、GST標(biāo)記或 MBP標(biāo)記的第二組,或選自這些組的兩個元件的組合。
[0057] 在一個實施方案中,切割位點選自IgA蛋白酶切割位點、顆粒酶B蛋白酶切割位 點、Tev蛋白酶切割位點、Precision蛋白酶切割位點、凝血酶切割位點、FaktorlOa蛋白酶 位點、Ides蛋白酶切割位點、腸激酶切割位點或SUM0蛋白酶切割位點。
[0058] 在一個實施方案中,融合多肽不包含額外的蛋白酶切割位點而是包含固有的蛋白 酶切割位點,如木瓜蛋白酶切割位點、胃蛋白酶切割位點或Ides蛋白酶切割位點。
[0059] 本文報道的一方面是包含本文報道的兩條融合多肽的二聚體融合多肽。
[0060] 在一個實施方案中第一 FC包含突變T366W和任選地突變S354C并且第二FC包含 突變T366S、L368A和Y407V和任選地突變Y349C。
[0061] 在一個實施方案中融合多肽特征在于
[0062]a)第一和第二多肽的R1和R2相同,
[0063] b)第一融合多肽的R1和R2相同,第二融合多肽的R1和R2相同但與第一融合多 肽的R1和R2不同,
[0064] c)第一和第二融合多肽的R1相同并且第一和第二多肽的R2相同但與R1不同, [0065] d)第一和第二融合多肽的R1相同并且兩個R2均不存在,
[0066]e)第一和第二融合多肽的R1不同并且兩個R2均不存在,
[0067]f)第一和第二融合多肽的R2相同并且兩個R1均不存在,
[0068]〈PN144659〉
[0069]g)第一和第二融合多肽的R2不同并且兩個R1均不存在,
[0070]h)第一融合多肽的R1和第二多肽的R2不同并且第一融合多肽的R2不存在并且 第二多肽的R1不存在。
[0071] 本文報道的一方面是生產(chǎn)可溶Fc受體的方法,所述方法包括以下步驟:
[0072]a)培養(yǎng)包含編碼本文報道的融合多肽的核酸的細(xì)胞,
[0073]b)從細(xì)胞或培養(yǎng)基回收融合多肽,
[0074] c)任選地用蛋白酶切割融合多肽,
[0075] 從而生產(chǎn)可溶Fc受體。
[0076] 本文報道的一個方面是固定化的本文報道的融合多肽或固定化的本文報道的二 聚體融合多肽作為親和層析配體的用途。
[0077] 本文報道的一個方面是固定化的本文報道的融合多肽或固定化的本文報道的二 聚體融合用于測定抗體的Fc受體結(jié)合的用途。
[0078] 在一個實施方案中,融合多肽結(jié)合于固相。
[0079] 本文報道的一個方面是包含本文報道的融合多肽的藥物組合物。
[0080] 本文報道的一個方面是本文報道的融合多肽在制備藥物中的用途。
[0081] 在一個實施方案中藥物用于治療炎性疾病。
[0082] 在一個實施方案中疾病是特征為增加的抗體水平的疾病。
[0083] 在一個實施方案中疾病是自身免疫病。
[0084] 在一個實施方案中疾病是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
[0085] 發(fā)明詳述
[0086] 附圖簡述
[0087]圖1.融合多肽表達(dá)質(zhì)粒的質(zhì)粒圖譜。
[0088] 圖2.木瓜蛋白酶切割的分析型SDS-PAGE凝膠。
[0089]圖 3. 12%BisTrisGel+/-DIT;分別用PreScission蛋白酶(泳道 3, 8)、IgA蛋 白酶(泳道2, 7)切割FcyRIIIaV158-Avi-FcLALAP239G:可以看到使用PP的非特異性 切割(泳道3, 8)。
[0090] 圖4?抗Her抗體(野生型,上部)和糖改造的抗Her抗體的不同糖基化形式的分 尚和定星。
[0091] 圖5.使用FcYRIIIaV158和Fc標(biāo)記的FcYRIIIaV158的親和柱的比較。
[0092] 圖 6?與FcyRIIIaV158 的 40RU相比,F(xiàn)cyRIIIaV158-FcLALAP329G融合多肽 的響應(yīng)的BIAcore傳感圖顯示超過100個響應(yīng)單位;FcgRIIIaV158_008表示非切割的融 合多肽,F(xiàn)cgRIIIaV158_007表示FcgRIIIa的縮短的非功能性變體(=對照),F(xiàn)cgRIIIa V158_jf323表示包含F(xiàn)cgRIIIa的功能性變體的完整的HisAvi標(biāo)記。
[0093]圖 7.FcY受體V158-FcLALAP329G融合多肽(圖 7a)、FcY受體V158(圖 7b)、切 割的Fcy受體V158-FcLALAP329G融合多肽(圖7c)、非功能性Fcy受體V158-FcLALA P329G融合多肽(圖7d)(=對照)的傳感圖。
[0094] 定義
[0095] 術(shù)語"與Fc受:體結(jié)合"指在例如BIAcore?測定法(PharmaciaBiosensor AB,Uppsala,瑞典)中Fc區(qū)與Fc受體的結(jié)合。
[0096] 在BIAcore?測定法中,使Fc受體結(jié)合于表面,并通過表面等離振子共振(SPR)來 測量分析物(例如含有Fc區(qū)的融合多肽或抗體)的結(jié)合。通過術(shù)語ka(締合常數(shù):Fc區(qū) 融合多肽或綴合物締合形成Fc區(qū)/Fc受體復(fù)合物的速率常數(shù))、kd(解離常數(shù):Fc區(qū)融合 多肽或綴合物從Fc區(qū)/Fc受體復(fù)合物解離的速率常數(shù))和KD(kd/ka)來定義結(jié)合的親和 力。備選地,可以就共振信號高度和解離行為將SPR傳感圖的結(jié)合信號與參考的響應(yīng)信號 直接比較。
[0097] 術(shù)語"CH2結(jié)構(gòu)域"指從約EU位置231延伸至EU位置340 (按照Kabat的EU編 號系統(tǒng))的抗體重鏈多肽部分。在一個實施方案中,CH2結(jié)構(gòu)域具有SEQIDN0:01(APELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQESTYRWSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK)的氨基酸序列。CH2結(jié)構(gòu)域的獨特性在于,它不與另一結(jié)構(gòu) 域緊密配對。相反,兩個N連接的分枝糖鏈插在完整的天然Fc區(qū)的兩個CH2結(jié)構(gòu)域之間。 已推測,糖可以提供結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域配對的替代,并幫助穩(wěn)定CH2結(jié)構(gòu)域。Burton,Mol. Immunol. 22(1985) 161-206。
[0098] 術(shù)語"CH3結(jié)構(gòu)域"指約從EU位置341延伸至EU位置446的抗體重鏈多肽部分。 在一個實施方案中,CH3 結(jié)構(gòu)域具有SEQIDN0:02(GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG)的氨 基酸序列。
[0099] 術(shù)語抗體的"類別"指它的重鏈所具有的恒定結(jié)構(gòu)域或恒定區(qū)的類型。存在五個主 要類別的抗體:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,這些中的幾種可以進(jìn)一步劃分為亞類(同種型), 例如IgGpIgGylgGpIgGpIgAjP IgA2。對應(yīng)于不同類別免疫球蛋白的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分 別稱為a、6、e、y和]i。
[0100] 術(shù)語"Fc區(qū)"指免疫球蛋白的C端區(qū)域。Fc區(qū)是包含兩個二硫化物連接的抗體重 鏈Fc區(qū)多肽(Fc區(qū)多肽鏈)的二聚體分子。Fc區(qū)可以通過木瓜蛋白酶消化或IdeS消化或 胰蛋白酶消化完整(全長)抗體來產(chǎn)生或可以重組產(chǎn)生。
[0101]可從全長抗體或免疫球蛋白獲得的Fc區(qū)包含全長重鏈C端的殘基226 (Cys),因 此包含部分鉸鏈區(qū)和兩個或三個恒定結(jié)構(gòu)域,即CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域和任選的CH4結(jié)構(gòu) 域。從US5, 648, 260和US5, 624, 821已知,F(xiàn)c區(qū)中確定的氨基酸殘基的修飾導(dǎo)致表型效 應(yīng)。
[0102] 通過所包含的CH3結(jié)構(gòu)域的非共價二聚化來介導(dǎo)包含兩個相同或不同的抗 體重鏈片段的二聚體Fc區(qū)的形成(所涉及的氨基酸殘基見例如Dal1'Acqua,Bioch em. 37(1998)9266-9273)。通過鉸鏈區(qū)中二硫鍵的形成來共價穩(wěn)定Fc區(qū)(見例如Huber 等,Nature264 (1976) 415-420;Thies等,J.Mol.Biol. 293 (1999) 67-79)。由于CH3-CH3 結(jié) 構(gòu)域二聚化所涉及的殘基的位置定位在CH3結(jié)構(gòu)域的內(nèi)側(cè)界面,而Fc區(qū)-FcRn相互作用所 涉及的殘基定位在CH2-CH3結(jié)構(gòu)域的外側(cè),為破壞CH3-CH3結(jié)構(gòu)域相互作用的二聚化而在 CH3結(jié)構(gòu)域內(nèi)引入的氨基酸殘基改變對FcRn結(jié)合沒有不利的影響。
[0103] Fc區(qū)相關(guān)效應(yīng)子功能由Fc區(qū)與效應(yīng)子功能特異性細(xì)胞表面受體的相互作用起 始。大多數(shù)情況下,IgGl同種型的抗體可以實現(xiàn)受體激活,而IgG2和IgG4同種型的抗體 不具有效應(yīng)子功能或具有有限的效應(yīng)子功能。
[0104] 引出效應(yīng)子功能的受體是Fc受體類型(和亞型)FcyRI、FcyRII和FcyRIII。 可以通過在下鉸鏈區(qū)中引入特異性氨基酸改變(如涉及FcyR和Clq結(jié)合的L234A和/或 L235A)來減少與IgGl同種型相關(guān)的效應(yīng)子功能。尤其是定位在CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域中 的某些氨基酸殘基也與抗體分子或Fc區(qū)融合多肽在血流中的循環(huán)半壽期相關(guān)。通過Fc區(qū) 與新生Fc受體(FcRn)的結(jié)合來測定循環(huán)半壽期。
[0105] 按照Kabat(Kabat等 1991,SequencesofProteinsofimmunological Interest,U.S.DepartmentofPublicHealth,Bethesda,Md.)的EU索引進(jìn)行抗體恒定區(qū) 中氣基酸殘基的編號。
[0106] 術(shù)語"人來源的Fc區(qū)"指人來源的免疫球蛋白重鏈的C端區(qū)域,其包含至少部分鉸 鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中,人IgG重鏈Fc區(qū)從Cys226或從Pro230 延伸至重鏈的羧基端。但是,F(xiàn)c區(qū)的C端賴氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另 有說明,F(xiàn)c區(qū)或恒定區(qū)中氨基酸殘基的編號按照Kabat,E.A.等,SequencesofProteins ofImmunologicalInterest,第 5 版,PublicHealthService,NationalInstitutesof Health,Bethesda,MD(1991),NIHPublication91-3242 中所述的EU編號系統(tǒng),也稱為EU 索引。
[0107] 術(shù)語"Fc區(qū)的FcRn結(jié)合部分"指抗體重鏈多肽的部分,其約從EU位置243延伸 至EU位置261,和約從EU位置275延伸至EU位置293,和約從EU位置302延伸至EU位置 319,和約從EU位置336延伸至EU位置348,和約從EU位置367延伸至EU位置393和EU 位置408,和約從EU位置424延伸至EU位置440。在一個實施方案中,改變以下根據(jù)Kabat 的EU編號的氨基酸殘基中的一個或多個:F243、P244、P245P、K246、P247、K248、D249、T250、 L251、M252、I253、S254、R255、T256、P257、E258、V259、T260、C261、F275、N276、W277、Y278、 V279、D280、V282、E283、V284、H285、N286、A287、K288、T289、K290、P291、R292、E293、V302、 V303、S304、V305、L306、T307、V308、L309、H310、Q311、D312、W313、L314、N315、G316、K317、 E318、Y319、1336、S337、K338、A339、K340、G341、Q342、P343、R344、E345、P346、Q347、V348、 C367、V369、F372、Y373、P374、S375、D376、I377、A378、V379、E380、W381、E382、S383、N384、 G385、Q386、P387、E388、N389、Y391、T393、S408、S424、C425、S426、V427、M428、H429、E430、 A431、L432、H433、N434、H435、Y436、T437、Q438、K439 和S440(EU編號)。
[0108] IgGl同種型的野生型人Fc區(qū)的多肽鏈具有以下氨基酸序列:
[0109] DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK(SEQIDNO:03).
[0110] 具有突變L234A、L235A的IgGl同種型的變體人Fc區(qū)的多肽鏈具有以下氨基酸序 列:
[0111] DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK(SEQIDNO:04).
[0112] 具有突變T366S、L368A和Y407V的IgGl同種型的變體人Fc區(qū)的多肽鏈具有以下 氨基酸序列:
[0113] DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLS CAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK(SEQIDNO:05).
[0114] 具有突變T366W的IgGl同種型的變體人Fc區(qū)的多肽鏈具有以下氨基酸序列:
[0115] DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSL WCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK(SEQIDNO:06).
[0116] 具有突變L234A、L235A和T366S、L368A和Y407V的IgGl同種型的變體人Fc區(qū)的 多肽鏈具有以下氨基酸序列:
[0117] DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLS CAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK(SEQIDNO:07).
[0118] 具有突變L234A、L235A和T366W的IgGl同種型的變體人Fc區(qū)的多肽鏈具有以下 氨基酸序列:
[0119] DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLW CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK(SEQIDNO:08).
[0120] 具有突變P329G的IgGl同種型的變體人Fc區(qū)的多肽鏈具有以下氨基酸序列:
[0121] DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK(SEQIDNO:09).
[0122] 具有突變L234A、L235A和P329G的IgGl同種型的變體人Fc區(qū)的多肽鏈具有以下 氨基酸序列:
[0123] DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK(SEQIDNO:10).
[0124] 具有突變P239G和T366S、L368A和Y407V的IgGl同種型的變體人Fc區(qū)的多肽鏈 具有以下氨基酸序列:
[0125] DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLS CAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK(SEQIDNO:11).
[0126] 具有突變P329G和T366W的IgGl同種型的變體人Fc區(qū)的多肽鏈具有以下氨基酸 序列:
[0127] DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLW CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK(SEQIDNO:12).
[0128] 具有突變L234A、L235A、P329G和T366S、L368A和Y407V的IgGl同種型的變體人 Fc區(qū)的多肽鏈具有以下氨基酸序列:
[0129] DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPKEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLS CAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK(SEQIDNO:13).
[0130] 具有突變L234A、L235A、P329G和T366W的IgGl同種型的變體人Fc區(qū)的多肽鏈具 有以下氨基酸序列:
[0131] DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLW CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK(SEQIDNO:14).
[0132] IgG4同種型的野生型人Fc區(qū)的多肽鏈具有以下氨基酸序列:
[0133] ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLGK(SEQIDNO:15).
[0134] 具有突變S228P和L235E的IgG4同種型的變體人Fc區(qū)的多肽鏈具有以下氨基酸 序列:
[0135] ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLGK(SEQIDNO:16).
[0136] 具有突變S228P、L235E和P329G的IgG4同種型的變體人Fc區(qū)的多肽鏈具有以下 氨基酸序列:
[0137] ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSLGK(SEQIDNO:17).
[0138] 術(shù)語"Fc受體"、簡稱"FcR"指與Fc區(qū)結(jié)合的受體。在一個實施方案中,F(xiàn)cR是 天然序列人FcR。此外,在一個實施方案中,F(xiàn)cR是結(jié)合IgG抗體的FcR(FcY受體),且 包括FcyRI、FcyRII和FcyRIII亞類的受體,包括其等位基因變體和可變剪接變體。 FcyRII受體包括FcyRIIA( "激活受體")和FcyRIIB( "抑制受體"),其具有主要在 其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中不同的相似的氨基酸序列。FcR綜述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev. Immunol9 (1991) 457-492;Capel等,Immunomethods4 (1994) 25-34;deHaas等,J.Lab. Clin.Med. 126(1995)330-341中。本文的術(shù)語"FcR"涵蓋其他FcR。該術(shù)語還包括負(fù)責(zé)將母 體IgG轉(zhuǎn)移至胎兒的新生受體FcRn(見例如Guyer等,J.Immunol. 117 (1976) 587 ;Kim等, J.Immunol. 24(1994)249)。
[0139] 術(shù)語"FcY受體"、簡稱"FcYR"或"FcgammaR"指結(jié)合IgG抗體Fc區(qū)且由FcYR 基因編碼的蛋白質(zhì)家族的任意成員。在人類中,此家族包括但不限于:FcyRI(CD64), 包括同種型FcyRIA、FcyRIB和FcyRIC;FcyRII(CD32),包括同種型FcyRIIA(包 括同種異型H131 和R131)、FcyRIIB(包括FcyRIIB-1 和FcyRIIB-2)和FcyRile; 和FcyRIII(CD16),包括同種型FcyRIIIA(包括同種異型V158 和F158 ;Swiss-Prot 入口P08637 ;N-端-MRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSY FIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGR KYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQ-C-端;SEQID NO: 18)和FcyRIIlb(包括同種異型FcyRIIB-NA1 和FcyRIIB-NA2)(見例如Jefferis 等,Immunol.Lett. 82 (2002) 57-65,整體引入作為參考);以及FcyR同種型或同種異型。FcyR可以來自任意生物,包括但不限于人類、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcyR包括但不 限于FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)、FcyRIII(CD16)和FcyRIII-2 (CD16-2),以及或 FcyR同種型或同種異型。Fc區(qū)-FcyR相互作用所涉及的氨基酸殘基是234-239 (下鉸 鏈區(qū))、265-269 (B/C環(huán))、297-299 (D/E環(huán))和 327-332 (F/G環(huán))(Sondermann等,Nature 406 (2000) 267-273)。導(dǎo)致減少的對FcyRI、FcyRIIA、FcyRIIB和 / 或FcyRIIIA的 結(jié)合/親和力的氨基酸突變包括N297A(伴有降低的免疫原性和延長的半壽期結(jié)合/親 和力)(R〇utledge等,Transplantation6〇(l995)847;Friend等,Transplantation 68(1999) 1632;Shields等,J.Biol.Chem. 276 (1995) 6591)、殘基 233-236(Ward和 Ghetie,Ther.Immunol. 2 (1995) 77;Armour等,Eur.J.Immunol. 29 (1999) 2613)。一些不例 性氨基酸取代描述于US7, 355, 008和US7, 381,408中。
[0140] 術(shù)語"新生Fc受體"、簡稱"FcRn"指結(jié)合IgG抗體Fc區(qū)且至少部分由FcRn基因 編碼的蛋白質(zhì)。FcRn可以來自任意生物,包括但不限于人類、小鼠、大鼠、兔和猴。如本領(lǐng)域 已知,功能性FcRn蛋白質(zhì)包含常稱為重鏈和輕鏈的兩條多肽。輕鏈?zhǔn)?-2-微球蛋白,重 鏈由FcRn基因編碼。除非本文另有說明,F(xiàn)cRn或FcRn蛋白質(zhì)指FcRn重鏈與3 -2-微球 蛋白的復(fù)合物。Fc區(qū)與FcRn的相互作用氨基酸殘基在CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的連接處附近。 Fc區(qū)-FcRn接觸殘基全都在單條IgG重鏈內(nèi)。所涉及的氨基酸殘基是248、250-257、272、 285、288、290-291、308-311和314(全都在CH2結(jié)構(gòu)域中)及氨基酸殘基385-387、428和 433-436 (全都在CH3結(jié)構(gòu)域中)。導(dǎo)致增加的對FcRn的結(jié)合/親和力的氨基酸突變包括 T256A、T307A、E380A和N434A(Shields等,J.Biol.Chem. 276 (2001) 6591)。
[0141] 在物種間保守的新生Fc受體的氨基酸殘基是Fc區(qū)中的310和435位的組氨酸 殘基。這些殘基造成Fc區(qū)FcRn相互作用的pH依賴性(見例如Victor,G?等,Nature Biotechnol. 15 (1997) 637-640) ;Dall'Acqua,W.F?等J.Immunol. 169 (2002) 5171-5180)。 減弱與FcRn的相互作用的Fc區(qū)突變可以降低抗體半壽期。
[0142] 術(shù)語"鉸鏈區(qū)"指抗體重鏈多肽的連接CH1結(jié)構(gòu)域和CH2結(jié)構(gòu)域的部分,例如從 根據(jù)Kabat的EU編號系統(tǒng)的約216位至約230位。鉸鏈區(qū)通常是由兩條具有相同氨基 酸序列的多肽組成的二聚體分子。鉸鏈區(qū)通常包含約25個氨基酸殘基,且具有允許抗原 結(jié)合區(qū)獨立移動的柔性。鉸鏈區(qū)可以細(xì)分為三個結(jié)構(gòu)域:上、中和下鉸鏈區(qū)(Roux等,J. Immunol. 161(1998)4083)。
[0143] 術(shù)語Fc區(qū)的"下鉸鏈區(qū)"指緊接著鉸鏈區(qū)C端的一段氨基酸殘基,即根據(jù)Kabat的 EU編號的Fc區(qū)的殘基233至239。
[0144] 術(shù)語"野生型Fc區(qū)"指與見于自然界中的Fc區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序 列。野生型人Fc區(qū)包括天然人IgGIFc區(qū)(非A和A同種異型)、天然人IgG2Fc區(qū)、天然人 IgG3Fc區(qū)和天然人IgG4Fc區(qū),及其天然存在的變體。
[0145] 術(shù)語"藥物組合物"指這樣的制劑,其處于這樣的形式,以致允許包含在其中的活 性成分的生物學(xué)活性有效,且其不包含對將施用該制劑的對象具有不可接受的毒性的額外 成分。
[0146] "可藥用載體"指藥物組合物中除活性成分外的成分,其對對象無毒性。可藥用載 體包括但不限于緩沖劑、賦形劑、穩(wěn)定劑或防腐劑。
[0147] 術(shù)語"多肽"指天然產(chǎn)生或合成產(chǎn)生的由通過肽鍵連接的氨基酸組成的聚合物。少 于約20個氨基酸殘基的多肽可以稱為"肽",而由兩條或多條多肽組成或包含一條超過100 個氨基酸殘基的多肽的分子可以稱為"蛋白質(zhì)"。多肽還可以包含非氨基酸成分,如糖基、 金屬離子或羧酸酯。非氨基酸成分可以由其中表達(dá)該多肽的細(xì)胞加入,且可以隨細(xì)胞類型 而不同。本文根據(jù)其氨基酸骨架結(jié)構(gòu)或編碼其氨基酸骨架結(jié)構(gòu)的核酸來定義多肽。加入物 (如糖基)通常不指明,但可以存在。
[0148] 術(shù)語"氨基酸序列標(biāo)記"指具有特定結(jié)合特性的通過肽鍵相互連接的氨基酸殘 基的序列。在一個實施方案中,氨基酸序列標(biāo)記是親和或純化標(biāo)記。在一個實施方案中, 氨基酸序列標(biāo)記選自Arg標(biāo)記、His標(biāo)記、Avi標(biāo)記、His-Avi標(biāo)記、Flag標(biāo)記、3xFlag標(biāo) 記、Strep標(biāo)記、Nano標(biāo)記、SBP標(biāo)記、c-myc標(biāo)記、S標(biāo)記、興調(diào)蛋白結(jié)合肽、纖維素結(jié)合 結(jié)構(gòu)域、幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域、GST標(biāo)記和MBP標(biāo)記。在一個實施方案中,氨基酸序列標(biāo)記 選自5£〇10勵:19(1?^1^)、5£〇10勵:20(1^1^1^)、5£〇10勵:21仏 ¥卜標(biāo)記)、5£〇10 N0:22 (His-Avi-標(biāo)記)、SEQIDN0:23 (HHHHHH)、SEQIDN0:24 (KDHLIHNVHKEFHAHAHNK),SEQ IDNO:25(DYKDDDDK)、SEQIDNO:26(DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK)、SEQID N0:27(AWRHPQFGG),SEQIDNO:28(WSHPQFEK),SEQIDNO:29(MDVEAWLGAR),SEQID N0:30(MDVEAWLGARVPLVET),SEQIDNO:31(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP), SEQIDN0:32(EQKLISEEDL),SEQIDNO:33(KETAAAKFERQHMDS),SEQIDNO:34(KRRWKKNFIA VSAANRFKKISSSGAL)、SEQIDN0:35(纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域)、SEQIDN0:36(纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu) 域)、SEQIDN0:37(TNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQ)、SEQID NO: 38(GST標(biāo)記)和SEQIDNO: 39(MBP標(biāo)記)。
[0149] 術(shù)語"酶切割位點"指可由蛋白酶特異性切割的通過肽鍵相互連接的氨基酸殘基 的序列。在一個實施方案中,蛋白酶是IgA蛋白酶、顆粒酶B、Tev蛋白酶、PreScission蛋 白酶、凝血酶、因子l〇a、Ides蛋白酶或腸激酶。
[0150] 術(shù)語"IgA蛋白酶"指衍生自淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)的具有包含 以下序列之一的識別位點的蛋白酶,其中"丨"表示所切割的鍵的位置:
[0151] Pro-Ala-Pro丨Ser-Pro(SEQIDN0:40),
[0152] Pro-Pro丨Ser-Pro(SEQIDN0:41),
[0153] Pro-Pro丨Ala-Pro(SEQIDNO:42),
[0154] Pro-Pro丨Thr-Pro(SEQIDN0:43),
[0155] Pro-Pro丨Gly_Pro(SEQIDN0:44),
[0156] Pro-Arg-Pro-Pro丨Thr-Pro(SEQIDN0:45),
[0157] Val-Val-Ala-Pro-Pro丨 Ala_Pro(SEQIDN0:46),
[0158] Val-Val-Ala-Pro-Pro丨 Ser_Pro(SEQIDN0:47),
[0159] Val-Val-Ala-Pro-Pro丨 Thr-Pro(SEQIDN0:48),
[0160] Val-Val-Ala-Pro-Pro丨 Gly_Pro(SEQIDN0:49),
[0161] Pro-Arg-Pro-Pro 丨 Thr-Pro(SEQIDN0:50),
[0162] Ala-Pro-Pro-Ala 丨 Ala_Pro(SEQIDN0:51),
[0163] Pro-Arg-Pro-Pro 丨 Ala_Pro(SEQIDN0:52),
[0164] Pro-Arg-Pro-Pro 丨 Ser-Pro(SEQIDNO:53),
[0165] Pro-Arg-Pro-Pro丨Gly_Pro(SEQIDN0:54).
[0166] 本申請中所用的術(shù)語"接頭"或"肽接頭"指天然來源和/或合成來源的肽接頭。 它們組成線性氨基酸鏈,其中20種天然存在的氨基酸是單體構(gòu)件。鏈具有1至50個氨基 酸、優(yōu)選1和28個氨基酸之間、尤其優(yōu)選3和25個氨基酸之間的長度。接頭可以包含重復(fù) 氨基酸序列或天然存在的多肽(如具有鉸鏈功能的多肽)的序列。接頭具有通過允許肽正 確折疊和正確呈遞來確保與抗-CD4抗體綴合的肽可以發(fā)揮其生物學(xué)活性的功能。優(yōu)選地, 接頭是設(shè)計為富含甘氨酸、谷氨酰胺和/或絲氨酸殘基的"合成肽接頭"。這些殘基例如以 至多五個氨基酸的小重復(fù)單位排列,如GGGGS、QQQQG或SSSSG。此小重復(fù)單位可以重復(fù)兩 次至五次來形成多聚體單位。在多聚體單位的氨基端和/或羧基端,可以加入至多六個額 外的任意的、天然存在的氨基酸。其他合成肽接頭由重復(fù)10至20次之間的單種氨基酸組 成,且可以在氨基端和/或羧基端包含至多六個額外的任意的、天然存在的氨基酸。所有肽 接頭都可以由核酸分子編碼,因此可以重組表達(dá)。
[0167] 本文報道的融合多肽
[0168] 已發(fā)現(xiàn),可以通過將Fc受體表達(dá)為具有基本上不結(jié)合融合的Fc受體的Fc區(qū)的融 合多肽生產(chǎn)可溶Fc受體。
[0169] 術(shù)語"基本上不結(jié)合Fc受體"表示Fc受體所融合至的Fc區(qū)不以使得形成聚集體 的程度與Fc受體結(jié)合。
[0170] 本文報道的一個方面是根據(jù)式I的融合多肽
[0171] R1-FC-R2 (式I)
[0172] 其中
[0173]R1表不第一Fc受:體,
[0174] R2表示第二Fc受體,和
[0175] FC表示重鏈Fc區(qū)多肽,
[0176] 其中R1或R2或二者均存在,
[0177] 其中FC基本上不結(jié)合R1和/或R2。
[0178] 本文報道的一個方面是根據(jù)式II的融合多肽
[0179] R1-CS1-L1-CS2-FC-CS3-L2-CS4-R2 (式II)
[0180] 其中
[0181] R1表不第一Fc受:體,
[0182] R2表示第二Fc受體,
[0183] FC表示重鏈Fc區(qū)多肽,
[0184] CS1表不第一切割位點,
[0185] CS2表示第二切割位點,
[0186] CS3表示第三切割位點,
[0187] CS4表示第四切割位點,
[0188] L1表示第一間插氨基酸序列,和
[0189] L2表示第二間插氨基酸序列,
[0190] 其中R1或R2或二者均存在,
[0191] 其中CS1、CS2、CS3、CS4中的任一者可以彼此獨立地存在或不存在,
[0192] 其中L1和L2可以彼此獨立地存在或不存在,
[0193] 其中FC基本上不結(jié)合R1和/或R2。
[0194] 本文報道的融合多肽中所含有的Fc受體可以是來自任何物種的任何Fc受體,包 括但不限于人、小鼠、大鼠、兔,和猴。
[0195] 在一個實施方案中Fc受體選自包含F(xiàn)cy-受體和新生Fc受體的組。在一個實施 方案中Fc受體是人FcY-受體,人新生Fc受體,鼠FcY-受體,和兔新生Fc受體。
[0196] 在一個實施方案中人FcY-受體選自人FcyRI(CD64)、人FcyRII(CD32)、人 FcyRIIA、人FcyRIIB、人FcyRIIC、人FcyRIII(CD16)、人FcyRIIIA,和人FcyRIIIB。
[0197] 在一個實施方案中人新生Fc受體是人FcRn。
[0198]在一個實施方案中鼠Fc受體選自鼠FcyRI(CD64)、鼠FcyRII(CD32)、鼠 FcyRIIB、鼠FcyRIII(CD16)、鼠FcyRIII-2 (CD16-2),和鼠FcyRIV。
[0199] 在一個實施方案中Fc是選自人IgG重鏈多肽、鼠IgG重鏈多肽、兔IgG重鏈多肽 的組的重鏈多肽的變體。
[0200] 在一個實施方案中,F(xiàn)C是選自人IgGl重鏈多肽、人IgG2重鏈多肽、人IgG3重鏈多 肽、人IgG4重鏈多肽、鼠IgGl重鏈多肽、鼠IgG2重鏈多肽、鼠IgG2a重鏈多肽、鼠IgG3重 鏈多肽、兔IgG重鏈多肽的組的重鏈多肽的變體。
[0201] 本文報道的融合多肽中所包含的Fc區(qū)應(yīng)基本上不結(jié)合與其融合的任何Fc受體。
[0202] 在一個實施方案中,融合多肽基本上不具有效應(yīng)子功能,這使它成為其中某些效 應(yīng)子功能不必要或有害的應(yīng)用所希望的候選者??梢赃M(jìn)行體外和/或體內(nèi)細(xì)胞毒性測定 法來確認(rèn)效應(yīng)子功能的減少/消除。例如,可以進(jìn)行Fc受體(FcR)結(jié)合測定法來確保 融合多肽缺乏FcyR結(jié)合(因此可能缺乏ADCC活性)。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞NK細(xì)胞 僅表達(dá)FcyRIII,而單核細(xì)胞表達(dá)FcyRI、FcRII和FcRIII。造血細(xì)胞上的FcR表達(dá) 總結(jié)在Ravetch,J.V?和Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol. 9 (1991) 457-492 的 464 頁上 的表3中。評估目的分子的ADCC活性的體外測定法的非限制性實例描述于美國專利號 5, 500, 362(見例如Hellstrom,I?等,Proc.Nat' 1Acad.Sci.USA83(1986)7059-7063; 和Hellstrom,I?等,Proc.Nat' 1Acad.Sci.USA82(1985) 1499-1502);美國專利號 5, 821,337 (見&uggemann,?等,J.Exp.Med. 166 (1987) 1351-1361)中。備選地,可 以利用非放射性測定方法(見例如用于流式細(xì)胞術(shù)的ACTI?非放射性細(xì)胞毒性測定法 (CellTechnology,Inc.MountainView,CA)和CytoTox96? 非放射性細(xì)胞毒性測定法 (Promega,Madison,WI))??捎糜谶@類測定法的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和 天然殺傷(NK)細(xì)胞。備選地或此外,可以在體內(nèi),例如在諸如公開于Clynes,R.等,Proc. Natl.Acad.Sci.USA95(1998)652-656中的動物模型中評估目的分子的ADCC活性。還 可以用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行FcRn結(jié)合和體內(nèi)清除/半壽期測定(見例如Petkova,S. B?等,Int.Immunol. 18 (2006:1759-1769)。
[0203] 可以通過本領(lǐng)域已知的用于測定Fc區(qū)/FcR相互作用(即Fc區(qū)與FcYR的特異性 結(jié)合)的多種體外測定方法(基于生物化學(xué)或免疫學(xué)的測定)來測定Fc區(qū)對其配體的親 和力和結(jié)合特性,該體外測定方法包括但不限于平衡法(例如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA) 或放射免疫測定(RIA))或動力學(xué)(例如BIACORE?分析)及其他方法,如間接結(jié)合測 定、競爭性抑制測定、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、凝膠電泳和層析(例如凝膠過濾)。這些 及其他方法可以利用所檢查的一種或多種成分上的標(biāo)記和/或利用包括但不限于生色、熒 光、發(fā)光或同位素標(biāo)簽的多種檢測方法。結(jié)合親和力和動力學(xué)的詳細(xì)描述可以見于Paul,W. E.編輯,F(xiàn)undamentalImmunology,第 4 版,Lippincott-Raven,Philadelphia(1999)中。
[0204] 在一個實施方案中,F(xiàn)C是人來源的IgG4亞類的Fc區(qū)或人來源的IgGl、IgG2或 IgG3亞類的Fc區(qū),其以這樣的方式修飾,使得無Fcy受體(例如FcyRIIIa)結(jié)合。在 一個實施方案中,F(xiàn)C是人來源的、尤其是來自人IgG4亞類的Fc區(qū),或來自人IgGl亞類的 突變的Fc區(qū)。在一個實施方案中,F(xiàn)C屬于具有突變L234A和L235A的人IgGl亞類。在 一個實施方案中,F(xiàn)C屬于具有突變S228P的人IgG4亞類。雖然IgG4顯示減少的FcY受 體(FcyRIIIa)結(jié)合,但其他IgG亞類的抗體顯示強結(jié)合。但是,Pro238、Asp265、Asp270、 Asn297(Fc糖類的丟失)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、 Lys288、Thr307、Gln311、Asn434或/和His435是在如果改變時也提供減少的Fcy受體 結(jié)合的殘基(Shields,R.L?等,J.Biol.Chem. 276 (2001) 6591-6604 ;Lund,J?等,F(xiàn)ASEB J. 9 (1995) 115-119 ;Morgan,A?等,Immunology86 (1995) 319-324;EP0307434)。在一個實 施方案中,關(guān)于Fcy受體結(jié)合,F(xiàn)C屬于IgG4亞類,或?qū)儆贗gGl或IgG2亞類,在L234、L235 和/或D265中具有突變和/或包含PVA236突變。在一個實施方案中,F(xiàn)C包含突變S228P、 L234A、L235A、L235E和/或PVA236 (PVA236意指IgGl的氨基酸位置233至236的氨基酸 序列ELLG(以單字母氨基酸密碼給出)或IgG4的EFLG被PVA取代)中的一個或多個。在 一個實施方案中,該突變是IgG4的S228P及IgGl的L234A和L235A。
[0205]Fc區(qū)結(jié)合位點為現(xiàn)有技術(shù)已知,并例如由Lukas,T.J.等,J. Immunol. 1 2 7 ( 1 98 1 ) 2555-2560;Brunhouse,R.和Cebra,J.J. ,Mol. Immunol.l6 (1979) 907-917;Burton,D.R?等,Nature288 (1980) 338-344; Thommesen,J.E?等,Mol.Immunol. 37 (2000) 995-1004 ;Idusogie,E.E?等,J. Immunol. 164(2000)4178-4184 ;Hezareh,M?等,J.Virol. 75 (2001) 12161-12168 ; Morgan,A?等,Immunology86(1995)319-324;及EP0307434 描述。Fc區(qū)結(jié)合位點例如由 氨基酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331 和P329 (根據(jù)Kabat的EU索引的 編號)表征。
[0206] 具有減少的效應(yīng)子功能的Fc區(qū)包括具有Fc區(qū)殘基238、265、269、270、297、327和 329中的一個或多個的取代的那些(美國專利號6, 737, 056)。這類Fc突變體包括在氨基 酸位置265、269、270、297和327中的兩個或多個上具有取代的Fc突變體,包括殘基265取 代為丙氨酸的所謂"DA"Fc突變體及殘基265和297取代為丙氨酸的所謂"DANA"Fc突變 體(美國專利號7, 332, 581)。
[0207] 描述了具有與FcR的改善或減弱的結(jié)合的某些Fc區(qū)變體(見例如美國專利號 6, 737, 056 ;W0 2004/056312 ;和Shields,R.L?等,J.Biol.Chem. 276 (2001) 6591-6604)。
[0208] 在一些實施方案中,在Fc區(qū)中進(jìn)行改變,該改變導(dǎo)致改變的(即改善的或減弱的) Clq結(jié)合和/或補體依賴性細(xì)胞毒性(CDC),例如,如美國專利號6, 194, 551 ;W0 99/51642 ; 及Idusogie,E.E?等,J.Immunol. 164 (2000) 4178-4184 中所述。
[0209]關(guān)于Fc區(qū)變體的其他實例,還見Duncan,A.R.和Winter,G.,Natu re322 (1988) 738-740;US5,648,260;US5, 624, 821;及TO94/29351。
[0210] 在一個實施方案中,重鏈Fc區(qū)多肽在位置234、235、236、237、238、239、253、254、 265、266、267、268、269、270、288、297、298、299、307、311、327、328、329、330、331、332、434和 435中的一個或多個上具有氨基酸突變。在一個實施方案中,F(xiàn)c受體中的一個或多個是FcY受體。
[0211] 在一個實施方案中,人IgGl重鏈多肽在氨基酸位置233、234、235、236、265、297、 329和331中的一個或多個上具有突變。
[0212] 在一個實施方案中,人IgGl重鏈多肽具有氨基酸突變E233P、L234A、L235A、 L235E、AG236、D265A、N297A、N297D、P329A、P329G和P331S中的一個或多個。
[0213] 在一個實施方案中,人IgGl重鏈多肽具有氨基酸突變L234A和L235A,及E233P、 L235E、AG236、D265A、N297A、N297D、P329A、P329G和P331S中的一個或多個。
[0214] 在一個實施方案中,人IgGl重鏈多肽具有氨基酸突變L234A和L235A和P329A或 P329G。
[0215] 在一個實施方案中,人IgG2重鏈多肽在氨基酸位置233、234、235、236、265和329 中的一個或多個上具有突變。
[0216] 在一個實施方案中,人IgG4重鏈多肽在氨基酸位置228、235、265和329中的一個 或多個上具有突變。
[0217] 在一個實施方案中,人IgG4重鏈多肽具有突變S228P、L235E、P329A和P329G中的 一個或多個。
[0218] 在一個實施方案中,人IgG4重鏈多肽具有突變S228P和L235E和P329A或P329G。
[0219] 在一個實施方案中,重鏈Fc區(qū)多肽在位置248、250、251、252、253、254、255、256、 257、272、285、288、290、291、308、309、310、311、314、385、386、387、428、433、434、435 和 436 中的一個或多個上具有氨基酸突變。在一個實施方案中,F(xiàn)c受體中的一個或多個是FcRn。
[0220] 在一個實施方案中,人IgG重鏈多肽在氨基酸位置238、252、253、254、255、256、 265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、 386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439和/或447中的一個或多個上具有突變。
[0221] 在一個實施方案中,具有減少的與FcRn的結(jié)合的人IgG重鏈多肽在氨基酸位置 252、253、254、255、288、309、386、388、400、415、433、435、436、439 和 / 或 447 上具有一個或 多個氨基酸改變。
[0222] 融合多肽可以在Fc受體和Fc區(qū)之間包含接頭多肽。此接頭多肽可以用來調(diào)節(jié)Fc 受體和Fc區(qū)之間的距離,以允許兩個區(qū)域以預(yù)期的方式發(fā)揮作用。
[0223] 在一個實施方案中,接頭多肽選自包含(G3S)3、(G3S)4、(G3S)5、(G3S)6、(G4S)3、 (G4S)4、(G4S)5、(G5S)2、(G5S)3、和(G5S)4 的組及其任意組合。
[0224] 此外,融合多肽可以在Fc受體和Fc區(qū)之間包含標(biāo)記,例如適合用于親和純化或固 定化的標(biāo)記。
[0225] 在一個實施方案中,該標(biāo)記選自包含Arg標(biāo)記、Avi標(biāo)記、His-Avi標(biāo)記、His標(biāo)記、 Flag標(biāo)記、3xFlag標(biāo)記、Strep標(biāo)記、Nano標(biāo)記、SBP標(biāo)記、c-myc標(biāo)記、S標(biāo)記、興調(diào)蛋白結(jié) 合肽、纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域、GST標(biāo)記、MBP標(biāo)記、鏈霉抗生物素蛋白或抗 生物素蛋白、生物素、凝集素、多糖、類固醇、類固醇結(jié)合蛋白、激素和激素受體的組。
[0226] 接頭多肽和標(biāo)記可以組合在定位在Fc受體和Fc區(qū)之間的間插氨基酸序列中。
[0227] 在一個實施方案中,間插氨基酸序列選自包含(G3S)3、(G3S)4、(G3S)5、(G3S)6、 (G4S)3、(G4S)4、(G4S)5、(G5S)2、(G5S)3、和(G5S)4 的第一組,或選自包含Arg標(biāo)記、Avi標(biāo)記、His-Avi標(biāo)記、His標(biāo)記、Flag標(biāo)記、3xFlag標(biāo)記、Strep標(biāo)記、Nano標(biāo)記、SBP標(biāo)記、 c-myc標(biāo)記、S標(biāo)記、鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽、纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域、GST標(biāo)記、MBP 標(biāo)記的第二組,或選自這些組的兩個元件的組合。
[0228] 間插氨基酸序列可以在融合多肽中定位在切割位點之前或之后。
[0229] 在一個實施方案中,切割位點是酶切割位點。在一個實施方案中,酶切割位點選自 包含IgA蛋白酶切割位點、顆粒酶B蛋白酶切割位點、Tev蛋白酶切割位點、PreScission蛋 白酶切割位點、凝血酶切割位點、FaktorlOa蛋白酶位點、Ides蛋白酶切割位點、SUM0蛋白 酶切割位點和腸激酶切割位點的組。在一個實施方案中,切割位點選自IgA蛋白酶切割位 點、PreScission蛋白酶切割位點、顆粒酶B切割位點和Ides蛋白酶切割位點的組。
[0230] 在一個實施方案中,融合多肽包含木瓜蛋白酶、或胃蛋白酶、或Ides蛋白酶的固 有切割位點。
[0231] 本文報道的一個方面是包含本文報道的兩種融合多肽的二聚體融合多肽。
[0232] 由于本文報道的融合多肽包含F(xiàn)c區(qū),所述Fc區(qū)轉(zhuǎn)而包含免疫球蛋白鉸鏈區(qū),二聚 體融合多肽包含將第一融合多肽與第二融合多肽共價連接的一個或多個二硫橋。
[0233] 二聚體融合多肽可以是同二聚體融合多肽或異二聚體融合多肽。
[0234] 額外地二聚體融合多肽可以包含根據(jù)式I
[0235] R1-FC-R2 (式I)
[0236] 其中
[0237] R1表示第一Fc受體,
[0238] R2表示第二Fc受體,和
[0239]FC表示重鏈Fc區(qū)多肽,
[0240] 其中R1或R2或二者均存在,
[0241] 其中FC基本上不結(jié)合R1和/或R2,
[0242] 或根據(jù)式II的第一融合多肽
[0243] R1-CS1-L1-CS2-FC-CS3-L2-CS4-R2 (式II)
[0244] 其中
[0245]R1表示第一Fc受體,
[0246]R2表示第二Fc受體,
[0247]FC表示重鏈Fc區(qū)多肽,
[0248]CS1表不第一切割位點,
[0249]CS2表示第二切割位點,
[0250]CS3表示第三切割位點,
[0251]CS4表示第四切割位點,
[0252]L1表示第一間插氨基酸序列,和
[0253]L2表示第二間插氨基酸序列,
[0254] 其中R1或R2或二者均存在,
[0255] 其中CS1、CS2、CS3、CS4中的任一者可以彼此獨立地存在或不存在,
[0256] 其中L1和L2可以彼此獨立地存在或不存在,
[0257] 其中FC基本上不結(jié)合R1和/或R2,
[0258] 其中二聚體融合多肽的第一和第二融合多肽可以彼此獨立地選自式I和式II。
[0259] 如果二聚體融合多肽可以包含兩條不同的融合多肽,必須使用確保異二聚化的機 制。
[0260] 在一個實施方案中第一FC包含突變T366W和任選地突變S354C并且第二FC包含 突變T366S、L368A和Y407V和任選地突變Y349C。
[0261] 在一個實施方案中融合多肽特征在于
[0262] a)第一和第二多肽的R1和R2相同,
[0263] b)第一融合多肽的R1和R2相同,第二融合多肽的R1和R2相同但與第一融合多 肽的R1和R2不同,
[0264] c)第一和第二融合多肽的R1相同并且第一和第二多肽的R2相同但與R1不同,
[0265] d)第一和第二融合多肽的R1相同并且兩個R2均不存在,
[0266] e)第一和第二融合多肽的R1不同并且兩個R2均不存在,
[0267] f)第一和第二融合多肽的R2相同并且兩個R1均不存在,
[0268] g)第一和第二融合多肽的R2不同并且兩個R1均不存在,
[0269] h)第一融合多肽的R1和第二多肽的R2不同并且第一融合多肽的R2不存在并且 第二多肽的R1不存在。
[0270] 本文報道的融合多肽的應(yīng)用
[0271] 本文報道的一個方面是固定化的本文報道的融合多肽作為親和層析配體的用途。
[0272] 在一個實施方案中,融合多肽結(jié)合于固相。在一個實施方案中,固相是層析材料。 在一個實施方案中,生物素化融合多肽,并用鏈霉抗生物素蛋白衍生固相。
[0273] 在一個實施方案中,融合多肽在Fc受體和Fc區(qū)之間包含切割位點。在一個實施 方案中,在生物素化之前切割融合多肽。
[0274] 在一個實施方案中,融合多肽在Fc受體和切割位點之間包含固定化標(biāo)記。在一個 實施方案中,固定化標(biāo)記是His-Avi標(biāo)記。
[0275] 還報道包含基質(zhì)和基質(zhì)結(jié)合的層析官能團的親和層析柱,其特征在于,基質(zhì)結(jié)合 的層析官能團包含本文報道的融合多肽。
[0276] 在一個實施方案中,融合多肽在Fc受體和Fc區(qū)之間包含切割位點。在一個實施 方案中,在生物素化之前切割融合多肽。
[0277] 在一個實施方案中,融合多肽在Fc受體和切割位點之間包含固定化標(biāo)記。在一個 實施方案中,固定化標(biāo)記是Avi標(biāo)記。
[0278] 本文報道的一個方面是固定化的本文報道的融合多肽用于測定抗體的Fc受體結(jié) 合的用途。
[0279] 在一個實施方案中抗體是低親和力抗體。
[0280] 在一個實施方案中測定是通過表面等離子體共振。在一個實施方案中抗體由單體 Fc受體捕獲。在一個實施方案中抗體由二聚體抗體捕獲。
[0281] 重組方法
[0282] 本文報道的一個方面是用于產(chǎn)生可溶Fc受體的方法,其包括以下步驟
[0283] a)培養(yǎng)包含編碼本文報道的融合多肽的核酸的細(xì)胞,
[0284] b)從細(xì)胞或培養(yǎng)基回收融合多肽,
[0285] c)任選地用蛋白酶切割融合多肽,
[0286] 從而產(chǎn)生可溶Fc受體。
[0287] 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于實施本發(fā)明的方法和技術(shù)描述于例如Ausubel,F(xiàn). M.編輯,CurrentProtocolsinMolecularBiology,I至III卷(1997),WileyandSons;Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第 2 版,ColdSpringHarbor LaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y. (1989)中。
[0288] 可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼本文報道的融合多肽的核酸。重組表達(dá)后,可以通過 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法純化融合多肽。這些方法是完善且廣泛用于免疫球蛋白純化, 且單獨或組合利用。這類方法是例如使用微生物衍生的蛋白質(zhì)的親和層析(例如A蛋白或 G蛋白親和層析)、離子交換層析(例如陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(氨基乙基 樹脂)和混合模式交換層析)、親硫吸附(例如用0 -巰基乙醇和其他SH配體)、疏水相互 作用或芳香族化合物吸附層析(例如使用苯基-瓊脂糖、氮雜-arenophilic樹脂或間-氨 基苯基硼酸)、金屬螯合親和層析(例如使用Ni(II)-和Cu(II)-親和材料)、大小排阻層 析和制備型電泳方法(如凝膠電脈、毛細(xì)管電泳)(Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem. Biotech. 75(1998)93-102)。在層析純化前或?qū)游黾兓螅梢悦复偾懈钊诤隙嚯囊葬尫臚c 受體。表達(dá)盒包含啟動子、編碼分泌信號序列的DNA區(qū)段、結(jié)構(gòu)基因和終止子/多腺苷酸化 信號。元件以有效連接的形式組裝在編碼全部所需的不同融合多肽的一個質(zhì)粒上,或各編 碼一個融合多肽的兩個或多個質(zhì)粒上。為了表達(dá)結(jié)構(gòu)基因,將一個或多個質(zhì)粒引入適宜的 宿主細(xì)胞中。在哺乳動物細(xì)胞如CH0細(xì)胞、NS0細(xì)胞、Sp2/0細(xì)胞、C0S細(xì)胞、HEK細(xì)胞、K562 細(xì)胞、BHK細(xì)胞、PER.C6?細(xì)胞等中產(chǎn)生蛋白質(zhì)。在一個實施方案中,在CH0細(xì)胞、或BHK 細(xì)胞、或HEK細(xì)胞中表達(dá)融合多肽。必須以這樣的方式選擇質(zhì)粒的調(diào)節(jié)元件,使得它們在所 選擇的宿主細(xì)胞中有功能。所表達(dá)的融合多肽功能性組裝。
[0289] "表達(dá)質(zhì)粒"是提供在宿主細(xì)胞中表達(dá)所包含的一個或多個結(jié)構(gòu)基因所需的全部 元件的核酸。通常,表達(dá)質(zhì)粒包含原核質(zhì)粒繁殖單位,例如,對于大腸桿菌,包含復(fù)制起點, 選擇標(biāo)記,真核選擇標(biāo)記,一個或多個用于表達(dá)一個或多個目的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)盒,該表達(dá) 盒各包含啟動子、結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄終止子(包括多腺苷酸化信號)。基因表達(dá)通常置于啟動 子的控制下,并且這種結(jié)構(gòu)基因稱為與啟動子"有效連接"。類似地,如果調(diào)節(jié)元件調(diào)節(jié)核心 啟動子的活性,則調(diào)節(jié)元件和核心啟動子有效連接。
[0290] 可以用例如描述于美國專利號4, 816, 567中的重組方法和組合物產(chǎn)生抗體。在一 個實施方案中,提供編碼本文所述的融合多肽抗體的分離的核酸。在一個實施方案中,提供 一個或多個包含這種核酸的載體(例如表達(dá)載體)。在另一實施方案中,提供包含這種核酸 的宿主細(xì)胞。在一個這種實施方案中,宿主細(xì)胞包含以下(例如已用以下轉(zhuǎn)化):(1)載體, 其包含編碼含有第一融合多肽的氨基酸序列和含有第二融合多肽的氨基酸序列的核酸;或 (2)第一載體,其包含編碼含有第一融合多肽的氨基酸序列的核酸,和第二載體,其包含編 碼含有第二融合多肽的氨基酸序列的核酸。在一個實施方案中,宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞,例如 中國倉鼠卵巢(CH0)細(xì)胞或淋巴樣細(xì)胞(例如Y0、NS0、Sp20細(xì)胞)。在一個實施方案中, 提供制備融合多肽的方法,其中該方法包括在適于表達(dá)融合多肽的條件下培養(yǎng)含有編碼上 文提供的融合多肽的核酸的宿主細(xì)胞,并任選地從宿主細(xì)胞(或宿主細(xì)胞培養(yǎng)基)回收融 合多肽。
[0291] 為了重組產(chǎn)生本文報道的融合多肽,分離如上文所述的編碼融合多肽的核酸,并 插入一個或多個載體中進(jìn)行進(jìn)一步克隆,和/或在宿主細(xì)胞中表達(dá)。這種核酸可以用常規(guī) 方法(例如使用能夠特異性結(jié)合編碼融合多肽的基因的寡核苷酸探針)容易地分離和測 序。
[0292] 適合用于克隆或表達(dá)編碼融合多肽的載體的宿主細(xì)胞包括本文所述的原核或 真核細(xì)胞。例如,尤其是在不需要糖基化和Fc效應(yīng)子功能時,可以在細(xì)菌中產(chǎn)生融合 多肽。對于抗體片段和多肽在細(xì)菌中的表達(dá)見例如US5, 648, 237、US5, 789, 199和US 5,840,523(還見Charlton,K.A.,In:MethodsinMolecularBiology,248 卷,Lo,B. K.C.(編輯),HumanaPress,Totowa,NJ(2003),245-254頁,其描述抗體片段在大腸桿菌中 的表達(dá))。表達(dá)后,可以從可溶級分中的細(xì)菌細(xì)胞糊分離融合多肽,并可以進(jìn)一步純化。
[0293] 除原核生物外,諸如絲狀真菌或酵母的真核微生物也是編碼融合多肽的載體的適 宜的克隆或表達(dá)宿主,包括糖基化途徑已"人源化",導(dǎo)致產(chǎn)生具有部分或完全人糖基化模 式的融合多膚的真菌和酵母菌株(見Gerngross, T.U.,Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414 ; 和Li, H?等,Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215)。
[0294] 適合用于表達(dá)糖基化融合多肽的宿主細(xì)胞也衍生自多細(xì)胞生物(無脊椎動物和 脊椎動物)。無脊椎動物細(xì)胞的實例包括植物和昆蟲細(xì)胞。已鑒定了許多可以與昆蟲細(xì)胞 結(jié)合使用,尤其是用于轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)細(xì)胞的桿狀病毒毒株。
[0295] 植物細(xì)胞培養(yǎng)物也可以用作宿主(見例如美國專利號5, 959, 177、6, 040, 498、 6, 420, 548、7, 125, 978和6, 417, 429 (描述用于在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生抗體的PLANTIB0DIES? 技術(shù)))。
[0296] 脊椎動物細(xì)胞也可以用作宿主。例如,可以使用適應(yīng)懸浮生長的哺乳動物細(xì)胞 系。有用的哺乳動物宿主細(xì)胞系的其他實例是SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1細(xì)胞系(C0S-7); 人胚腎細(xì)胞系(描述于例如Graham,F.L.等,J.GenVirol. 36 (1977) 59-74中的293 或293細(xì)胞);幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK);小鼠支持細(xì)胞(描述于例如Mather,J.P.,Biol. R印rod. 23(1980)243-252中的TM4細(xì)胞);猴腎細(xì)胞(CV1);非洲綠猴腎細(xì)胞(VER0-76); 人宮頸癌細(xì)胞(HELA);犬腎細(xì)胞(MDCK) ;buffalo大鼠肝細(xì)胞(BRL3A);人肺細(xì)胞(W138); 人肝細(xì)胞〇fepG2);小鼠乳腺腫瘤(MMT060562);描述于例如Mather,J.P?等,Annals N.Y.Acad.Sci. 383(1982)44-68中的TRI細(xì)胞;MRC5細(xì)胞;及FS4細(xì)胞。其他有用的哺 乳動物細(xì)胞系包括中國倉鼠卵巢(CH0)細(xì)胞,包括DHFR_CH0細(xì)胞(Urlaub,G.等,Proc. Natl.Acad.Sci.USA77(1980)4216-4220);及骨髓瘤細(xì)胞系,如Y0、NS0 和Sp2/0。適合用 于抗體產(chǎn)生的某些哺乳動物宿主細(xì)胞系的綜述見例如Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methodsin MolecularBiology, 248 卷,Lo,B.K.C.(編輯),HumanaPress,Totowa,NJ(2004),255-268 頁。
[0297] 用于診斷和檢測的方法和組合物
[0298] 在某些實施方案中,本文提供的任意融合多肽可用來檢測含有Fc區(qū)的分子在生 物樣品中的存在。本文所用的術(shù)語"檢測"涵蓋定量或定性檢測。
[0299] 在一個實施方案中,提供本文報道的融合多肽用于診斷或檢測的方法。在另一方 面,提供檢測含有Fc區(qū)的分子在生物樣品中的存在的方法。在某些實施方案中,方法包括 使生物樣品與本文報道的融合多肽在允許融合多肽與含有Fc區(qū)的分子結(jié)合的條件下接 觸,并檢測融合多肽和含有Fc區(qū)的分子之間是否形成復(fù)合物。這種方法可以是體外或體內(nèi) 方法。
[0300] 在某些實施方案中,提供經(jīng)標(biāo)記的融合多肽。標(biāo)記物包括但不限于,直接檢測 至IJ(如熒光、有色、電子致密、化學(xué)發(fā)光和放射性標(biāo)記物)的標(biāo)記物或部分,以及間接檢測 到(例如借助酶促反應(yīng)或分子相互作用)的部分,如酶或配體。示例性標(biāo)記物包括但不限 于放射性同位素呷、14(:、 1251、311和1311、熒光團如稀土元素螯合物或熒光素及其衍生物、羅 丹明及其衍生物、丹磺酰、傘形酮、螢光素酶,例如螢火蟲螢光素酶和細(xì)菌螢光素酶(US專 利號4, 737, 456)、螢光素、2, 3-二氫二氮雜萘二酮、辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶、 3 -半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶,例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄 糖-6-磷酸脫氫酶、雜環(huán)氧化酶如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶,其與利用過氧化氫來氧化染料 前體的酶如HRP、乳過氧化物酶或微過氧化物酶偶聯(lián)、生物素/抗生物素蛋白、自旋標(biāo)記物、 喔囷體標(biāo)記物、穩(wěn)定自由基等。
[0301] 藥物組合物
[0302] 通過以下方式制備凍干制劑或水溶液形式的如本文報道的融合多肽的藥物組合 物:將具有所需純度的此類融合多肽與一種或多種任選的可藥用載體混合(Remington's PharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.(編著)(1980))??伤幱幂d體總體上在所用 的劑量和濃度對接受者無毒,并且包括但不限于:緩沖劑如磷酸鹽、檸檬酸和其他有機酸; 抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫氨酸;防腐劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨;六甲氯銨; 苯扎氯銨、苯扎溴銨;苯酚、丁醇或芐醇;烷基尼泊金酯如尼泊金甲酯或丙酯;兒茶酚;雷瑣 辛;環(huán)己醇;3-戊醇和間甲酚);低分子量(少于約10個殘基)多肽;蛋白質(zhì),如血清白蛋 白、明膠或免疫球蛋白;親水聚合物如聚(乙烯吡咯烷酮);氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天 冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸;單糖、二糖和其他糖包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合劑 如EDTA;糖如蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨糖;形成鹽的反離子如鈉;金屬復(fù)合物(例如, Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)和/或非離子表面活性劑如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性可藥用 載體還包括間質(zhì)藥物分散劑如可溶中性活性透明質(zhì)酸酶糖蛋白(sHASEGP),例如,人可溶 PH-20 透明質(zhì)酸酶糖蛋白,如rhuPH20(HYLENEX?,BaxterInternational,Inc.)。在 美國專利
【發(fā)明者】P·魯格爾, T·施洛特豪爾, S·西伯爾 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1